徠卡顯微鏡：三維超分辨率GSDIM顯微鏡
蜂窩條塊維持細(xì)胞骨架的軌道在水皰結(jié)構(gòu)沿靶蛋白販運(yùn)。這些細(xì)胞成分的詳細(xì)特征是了解細(xì)胞功能至關(guān)重要。基于單分子定位的*分辨率成像方法已經(jīng)開始把這些小的結(jié)構(gòu)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
GSDIM（地面的狀態(tài)耗盡顯微鏡其次個別分子回報）可用于細(xì)胞車廂參與販運(yùn)蛋白質(zhì)，如高爾基體和微管網(wǎng)絡(luò)，以獲得詳細(xì)的關(guān)鍵洞察。隨著新的的3D GSDIM技術(shù)（徠卡SR GSD 3D），這些結(jié)構(gòu)不僅解決橫向，而且在第三個維度。的原理是基于使用的光學(xué)散光，以確定個別的熒光染料的精確的側(cè)向和軸向位置。這種技術(shù)的另一個巨大優(yōu)勢是使用標(biāo)準(zhǔn)熒光和普通染色協(xié)議的可能性。易于使用GSD向?qū)Ш喕娜S圖像重建和處理。這種方法允許蜂窩結(jié)構(gòu)具有橫向分辨率下降到20納米，約70nm的軸向分辨率的三維成像。
圖 1：個別熒光基團(tuán)的三維定位。
高功率激光的徠卡SR GSD 3D系統(tǒng)可以切換廣泛的熒光染料，可以在很短的時間，搜集了大量的光子熒光抗體和Alexa的染料，也用于古典螢光允許研究人員使用一套。高功率激光物鏡具有160倍的放大倍率，另外單分子在高分辨率的精確定位。對于這樣的精度，需要一段較長的時間。成像期內(nèi)非漂流樣本的前提是通過相撲（禁止運(yùn)動）階段的技術(shù)，*大限度地減少橫向漂移不到20 nm/10分鐘。
在三維可視化車廂蜂窩物流
徠卡SR GSD 3D系統(tǒng)是一種新型的本地化顯微鏡方法，在第三維度的高分辨率顯示細(xì)胞車廂。要了解運(yùn)輸過程中的極化上皮細(xì)胞不同的細(xì)胞器的精確定位參與販運(yùn)蛋白質(zhì)是必要的。利用高分辨率的GSD顯微鏡未能分析高爾基體基質(zhì)蛋白GM130，線粒體的ATP合成酶ATP的-2B和detyrosinated的的微管（微管蛋白detyr）。MDCK細(xì)胞的野生型細(xì)胞，用冰冷的甲醇或4％PFA固定于蓋玻片上培養(yǎng)一天。阻止將細(xì)胞用1％牛奶粉末或1％BSA（牛血清白蛋白）在PBS + +（PBS 1 mM的CaCl 2的和1 mM的MgCl 2的）和免疫染色，進(jìn)行通過使用抗體針對GM130，ATP-2B或detyr微管蛋白。一抗標(biāo)記抗體Alexa647耦合，用100mM的MEA（β-巰基乙胺）的PBS作為包埋劑。高爾基體標(biāo)記的圓形結(jié)構(gòu)GM130面臨的高爾基體腔中（圖2A）的*分辨率。除了2D圖像的詳細(xì)信息的落射熒光圖像相比，第三維清楚地定義了使用的顏色漸變，該值指示從0-800 nm的z軸在此隔室中的細(xì)胞定位。雖然線粒體和微管中的2D，GSD圖像（圖2B），已經(jīng)很好地解決三維GSD*分辨率圖像顯示線粒體定位在接近微管，表明這些細(xì)胞器和細(xì)胞骨架的軌道的移動。
蛋白質(zhì)運(yùn)輸和上皮細(xì)胞分化
極性的上皮細(xì)胞的功能的器官的先決條件。他們建立一個單分子層的外表面上的臟器，器官和環(huán)境之間提供了一個阻擋和交換系統(tǒng)。上皮細(xì)胞的極化結(jié)構(gòu)，其特征在于由兩個不同的域的質(zhì)膜，心尖朝向域的器官腔體和細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 細(xì)胞外基質(zhì)的接觸發(fā)生時，基底域。這兩種膜域分隔緊密連接，并表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分。為了保持這種極性，上皮細(xì)胞演變的一個非常具體的極化分揀他們的物鏡膜蛋白質(zhì)和脂類。
根尖蛋白質(zhì)的分類需要的各種不同的途徑到細(xì)胞表面的各種排序的信號。糖基肌醇（GPI）錨，以及參與的N和O-聚糖識別作為根尖排序信號。分選通路由所運(yùn)輸?shù)闹さ鞍椎挠H合性，可以細(xì)分。因此，存在的脂質(zhì)筏依賴和非依賴途徑。因此，蛋白質(zhì)分離成不同的囊泡群體在高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN）或后高爾基體隔室。
分揀過程涉及許多蛋白質(zhì)，是必不可少的正確交付貨物的蛋白質(zhì)。一個重要的排序受體是半乳糖凝集素-3。它可以由于它們的糖基化的具體貨物綁定到傳輸?shù)秸_的質(zhì)膜。此外，細(xì)胞骨架肌動蛋白微絲和微管形成的軌跡在這個過程中所涉及的分泌泡和細(xì)胞器的運(yùn)動。都需要特別長的段落在細(xì)胞內(nèi)的微管。它們包括α-和β-微管蛋白的聚合二聚體的亞基。翻譯后修飾，如微管蛋白的酪氨酸殘基，其中α-微管蛋白的C端結(jié)構(gòu)域添加或刪除tyrosination detyrosination，需要正確交付貨物的頂膜。
高度解決GSDIM圖像描繪沿著單個分子的分布這些修改，并可以解決細(xì)胞成分中所涉及的極化蛋白販運(yùn)詳細(xì)。
三維GSD的原理
衍射障礙限制了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的成像分辨率的橫向尺寸在200-300納米和500-800納米的軸向尺寸，留下許多細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)無法解決的。許多蜂窩結(jié)構(gòu)要小得多，如高爾基體潴像煎餅間隔排列<100 nm的分開，ATP合酶相隔間距10納米內(nèi)線粒體膜，微管是由二聚亞基形成空心棒25納米外徑。一些方法已被用來克服這個衍射極限，以二維的*分辨率顯微鏡技術(shù)，如受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡，光活化定位顯微鏡（PALM），隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（風(fēng)暴），其次是個別的基態(tài)耗盡分子的回報（GSDIM）顯微鏡。直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）的*近的3D GSDIM顯微鏡（徠卡SR GSD 3D），蜂窩室就可以解決的第三個維度。
在dSTORM GSDIM顯微鏡的熒光的確切位置，確定基于時空分離的原則。這就需要開關(guān)之間的打開和關(guān)閉狀態(tài)，然后順序讀出的熒光染料。在一個實(shí)驗(yàn)的開始，大部分的熒光染料轉(zhuǎn)移到一個長期生活的黑暗狀態(tài)（關(guān)閉狀態(tài)），通過采用高強(qiáng)度激光。只有單分子將返回到ON狀態(tài)隨機(jī)切換回之前的黑暗狀態(tài)，并發(fā)出熒光的時間很短。這些分子的熒光信號周期，從暗到亮的狀態(tài)，回到黑暗狀態(tài)，隨著時間的推移被記錄。*后，*分辨率圖像重建的圖像由數(shù)千。
將被描繪成一個點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）幾百納米大小的熒光信號。但是可適應(yīng)的PSF /調(diào)整的一個兩維高斯函數(shù)本地化的分子的確切位置。分子的位置的精確度依賴于信號強(qiáng)度，即收集的光子的數(shù)量。的分辨率是通過增加檢測時間上彼此分離的單熒光斑點(diǎn)。
為了使定位在z方向上的單熒光團(tuán)，用于引入到顯微鏡的成像路徑中的柱面透鏡的散光效果。其結(jié)果是熒光點(diǎn)的橢圓率和方向的變化取決于其在z維度的位置，從而使三維重建。當(dāng)在焦平面的熒光，圖像出現(xiàn)一輪。當(dāng)熒光團(tuán)是下面的重點(diǎn)，在垂直方向上的圖像的光點(diǎn)形狀是細(xì)長的，反之，高于的焦點(diǎn)位置時，它是當(dāng)場在水平方向上延伸。
A）
B）
圖 2：廣角鏡，2D GSDIM和3D GSDIM顯微鏡的比較。
）MDCK細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片，固定和高爾基體基質(zhì)蛋白gm130/Alexa647免疫染色。比例尺條為2μm
B）的蓋玻片上生長的MDCK細(xì)胞中線粒體的ATP合成酶固定和染色使用抗ATP-2B使用一個反detyr的微管蛋白抗體的抗體和微管。兩人被打成Alexa647耦合二次抗體。比例尺條為2μm。漸變的顏色表示的x軸0-800納米。
展望
*分辨率GSDIM的有助于闡明本地化的組件中所涉及的更詳細(xì)的極化蛋白販運(yùn)，因此揭示以前懸而未決的運(yùn)輸機(jī)制。三維GSD的圖像顯示了在常規(guī)落射熒光圖像分辨率提高，而且，它提供了，這不是所提供的2D圖像的3D信息。使用在三維的這個*分辨率技術(shù)，這將有可能監(jiān)測蛋白運(yùn)輸通路的多個組件，如運(yùn)輸小泡，在未來。徠卡SR GSD 3D是一個新的*分辨率顯微鏡多應(yīng)用平臺，包括TIRF，廣角和*分辨率更深入的了解，使基本過程在細(xì)胞內(nèi)。