尼康顯微鏡：體視暗場照明

在立體顯微鏡的暗視野觀察，需要一個專門的支架，其中包含反射鏡和遮光板直接對試樣在斜角度一個倒置空心錐體的照明。暗場照明的主要內(nèi)容，體視顯微鏡和更常規(guī)的復合顯微鏡，這往往配備復雜的多透鏡聚光系統(tǒng)或聚光鏡具有專門的內(nèi)部反射鏡包含在特定的幾何形狀的反射面面向相同的。

暗視野顯微鏡是一種簡單和常用的方法，呈現(xiàn)清晰可見的未染色透明標本。暗視野觀察的很好的候選經(jīng)常有非常接近的值與其周圍環(huán)境的折射率，難以與常規(guī)的明視場技術(shù)的圖像。作為一個例子，小的水生生物，卵母細胞，在組織培養(yǎng)中的細胞具有范圍從1.2到1.4的折射率，從而導致從周圍的水性介質(zhì)中（折射率為1.3）的光程差可以忽略不計。這些以及類似的標本觀察，暗場照明技術(shù)的理想人選。

圖1中顯示的配置示出了現(xiàn)代尼康顯微鏡SMZ1500配備一個*的支架，其中包含在明場和暗場照明的規(guī)定，通過安裝在支架頂部的透明玻璃階段。還描繪的是一個數(shù)字網(wǎng)絡攝像機能夠顯微鏡遠程觀察家所收集的圖像傳輸系統(tǒng)（尼康DN100）。暗場照明的機制的詳情在下面討論。

標本的暗視野照明，需要阻斷通常通過和周圍（前后）的試樣的顯微鏡，沿著光軸的中心的光線。阻止這些光線，使得只有那些在大角度的斜光線撞擊試樣置于顯微鏡舞臺上。在配備一個簡單的聚光鏡系統(tǒng)，聚光鏡（阿貝式）*鏡頭的凹球面狀，使光線在所有方位的表面形成一個倒置的中空光錐具有頂點為中心，在試樣平面新興的復合顯微鏡。如果沒有試樣本的舞臺上，和聚光鏡的數(shù)值孔徑*過物鏡，斜光線交叉，和，錯過進入物鏡前透鏡，因為他們的傾角。視野會變暗。

在圖1所示的體視顯微鏡產(chǎn)生的照度，使用特別設(shè)計的7雙面環(huán)形鏡（圖2），大大降低了雜散光進入大常見的主要物鏡前鏡頭斜圓錐體。的環(huán)形反射鏡的高數(shù)值孔徑，反射暗視野中的聚光鏡，內(nèi)部鏡面，具有各種幾何形狀的曲率，配備類似的方式操作。

其中*流行的暗場聚光鏡的設(shè)計，大量使用高倍率化合物顯微鏡相襯出現(xiàn)之前，是拋物面聚光器，其中有一個彎曲和鏡像cardioidal的內(nèi)表面。照明光通過聚光，從一個單一的表面，是由拋物面截斷的光停止面向垂直聚光鏡和顯微鏡光軸反射。該系統(tǒng)是從球形，色差和慧差和產(chǎn)生一個重點突出的光錐將試樣從所有方位。體視顯微鏡環(huán)形反射鏡的設(shè)計雖然圖2和圖3中示出，不與拋物面聚光鏡的復雜性和精度的，它是有一個圓筒形的幾何結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)的反射鏡，在暗視野照明標本更為有效。圖3中的圖表進行比較發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)的體視顯微鏡用更傳統(tǒng)的柱面反射鏡的環(huán)形反射鏡的設(shè)計。從所有方位，以提供更均勻的照明，另外，環(huán)形的聚光鏡設(shè)計大大減少了雜散光進入物鏡前透鏡到試樣和背景之間的對比度顯著提高，這導致的量。

當一個透明的標本被放置在玻璃顯微鏡載物臺和暗場照明下觀察時，傾斜的光線穿過試樣，衍射，反射，折射和/或通過光學的不連續(xù)性（如細胞膜，細胞核，和內(nèi)部的細胞器）讓這些微弱的光線進入物鏡。試樣，然后其他黑色背景上出現(xiàn)亮點。暗場照明在傅里葉光學方面，消除零階（未散射光）的衍射圖案，形成在后側(cè)焦點面上的物鏡。這會導致形成的圖像中的完全從試樣散射的高階衍射強度，并且還負責為暗視野觀察的主要限制。因為圖像是完全由從檢體的散射光，它是含有豐富的眩光，甚至可以在不同程度上被扭曲，因此它不能被認為是一個忠實的試樣的幾何再現(xiàn)。

圖4說明數(shù)字圖像暗場和明照明的影響纖維整裝標本準備使用加拿大香脂和顯微鏡載玻片和蓋玻片。圖4（a）和4（二）的尼龍纖維的明視場的條件下（圖圖4（a））和暗場（圖4（b）條）照明的。嚴重缺乏纖維與明場成像的對比度和微小的細節(jié)是很難區(qū)分的白色背景。與此相反，當用這種纖維與暗場技術(shù)（尼康SMZ1500與一個環(huán)形反射鏡的照明器）照明，內(nèi)部纖維的細節(jié)是可辨別的到一個更高的程度和深度字段強調(diào)變得更加明顯。圖4（c）中，這是不是透明的，幾乎是不透明時，可視在光照下菠蘿纖維纖維具有一種情形在明反差太大。查看相同的菠蘿纖維試樣與暗場照明揭示更為錯綜復雜的細節(jié)（圖4（D）），公開縱向分裂的纖維，是看不出來的明場圖像。

標本有光滑的反射面產(chǎn)生主要是由于到物鏡的光反射的暗場圖像。的檢體的折射率是不同的，從周圍介質(zhì)中，或發(fā)生的折射率梯度（在邊緣的膜）的情況下，光的折射的試樣。這兩種情況下的反射和折射光的方向產(chǎn)生比較小的角度變化，使一些光線進入的目的。與此相反，一些光撞擊試樣也是衍射，穿過整個物鏡的數(shù)值孔徑范圍內(nèi)的光，產(chǎn)生一個180度的弧。物鏡的分辨能力是相同的暗場照明的明視場的條件下實現(xiàn)的，但不是精確地再現(xiàn)的圖像（如上所述）的光學字符。

在暗視野顯微鏡，對比度也大大提高由強光照射試樣在一個黑暗的背景上的疊加。由一個不透明的一站式零階光線阻斷，使只有高階的光線照明，洗澡標本。高傾斜的試樣衍射光線，并產(chǎn)生*，第二，和更高衍射級的物鏡，請他們彼此干擾，以產(chǎn)生圖像的標本到成像面的后側(cè)焦點面。

如果使用伯特蘭透鏡或目鏡望遠鏡觀看在暗場照明的體視顯微鏡操作中的物鏡的后部，它會顯示為充滿光。微弱的衍射光改組為可見的圖像在目鏡膜片的平面，其對比度逆轉(zhuǎn)一個黑暗的背景上產(chǎn)生明亮的圖像。因為暗視野顯微鏡消除是非常浪費的光線明亮，未衍射的零階光，這種形式的照明，因此要求高強度的照明光源。體視顯微鏡照明暗場照明，配備的看臺上，采取這一因素考慮在內(nèi)，和高強度鎢鹵素燈泡為宗旨，以產(chǎn)生足夠的光通量。

目前一些產(chǎn)品售后加裝立體顯微鏡與透射暗場照明。此外，許多顯微鏡制造商提供照明配件，可以很方便地用來實現(xiàn)他們的立體聲系統(tǒng)的暗場條件。列于圖5和圖6典型的售后暗視野照明。在圖5所示的設(shè)計，采用了光纖環(huán)的光以提供特制的照明階段包含一個內(nèi)部的反射鏡系統(tǒng)和一個不透明的光停止。從環(huán)形光照明器的光被反射，從內(nèi)部柱面反射鏡的中心（零階）射線被阻斷的光停止，形成一個倒錐形的照明。放入試樣直接在玻璃板上休息階段孔徑以上，與暗場照明，可以進行可視化。環(huán)形燈配備有一個外部的，它包含一個電壓電源和高強度的鎢鹵燈的光源。另一個暗場聚光鏡的設(shè)計，其中還包含明照明的規(guī)定，如圖6所示。此的聚光系統(tǒng)利用旋轉(zhuǎn)的滑塊之間的明場和暗場照明，并且還包含一個光源通過光纖束耦合到聚光鏡。

在立體顯微鏡暗場照明的理想人選包括分鐘生活的水生生物，硅藻，小昆蟲，骨，纖維，頭發(fā)，未染色的細菌，酵母菌，和原生動物。非生物試樣包括礦物質(zhì)，化學晶體，膠體顆粒，夾雜物和孔隙率的玻璃，陶瓷，聚合物薄膜的部分，和折射率梯度。應謹慎，在暗視野顯微鏡標本準備，因為躺在上面和下面的功能平面的焦點，尤其是指紋，灰塵，纖維，和清渣，還可以散射光線，有助于圖像退化。用試樣的厚度和顯微鏡載片上的厚度也是非常重要的，在一般情況下，薄的試樣衍射工件，可以干擾圖像形成期望消除的可能性。

在適當?shù)臈l件下成像的暗場照明的標本是在外觀上頗為壯觀（例如，嘗試一滴新鮮血液）。標本通常含有非常低的固有對比度在明顯微鏡很容易在暗場觀察，這種類型的照明是理想顯露輪廓，邊緣，邊界，和折射率梯度。不幸的是，暗場照明揭示內(nèi)部細節(jié)不太有用。其他類型的標本，其中包括許多已與染料染色，也很好地回應暗場條件下的照明。這些措施包括植物和樹*薄切片（染色和未染色），硅藻，放射蟲化石，骨骼部分，胚胎，毛（人和動物）。

暗視野顯微鏡（化合物和立體聲）在上半年的20世紀，有一個非常**的內(nèi)容和大量的精力花費在優(yōu)化暗場聚光鏡系統(tǒng)和照明。這種強烈的興趣開始慢慢褪色的出現(xiàn)更*的對比度增強技術(shù)，如相襯，微分干涉相襯，霍夫曼調(diào)制對比。*近，新的體視顯微鏡照明技術(shù)，如尼康的斜相干對比，大大提高對比度的透明標本，目前正在引進并*終將可能取代一個重大的金額在暗場立體顯微鏡的興趣。然而，新的興趣已經(jīng)出現(xiàn)在傳輸?shù)陌狄曇帮@微鏡熒光顯微鏡結(jié)合使用時，由于它的優(yōu)勢。

暗視野顯微鏡仍然是生物和醫(yī)學研究的一個很好的工具。該技術(shù)可以有效地利用，以查看廣泛的生物醫(yī)學和工業(yè)的標本，并且常常可以揭示與其他照明方法是不可見的細節(jié)。