尼康顯微鏡：光譜成像和線(xiàn)性分解

在過(guò)去的十年中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了廣泛的高性能熒光在熒光顯微鏡調(diào)查采用了*的技術(shù)，如激光點(diǎn)掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤(pán)，多光子，總的內(nèi)部反射。現(xiàn)在可用的*探針基因編碼的熒光蛋白，半導(dǎo)體量子點(diǎn)，膜透性的合成熒光基團(tuán)組成的混合動(dòng)力系統(tǒng)，物鏡蛋白融合，和單機(jī)的人工合成，具有廣泛的物理和光譜性質(zhì)。這些試劑能夠針對(duì)幾乎任何在活的或固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或肽的許多也是很有用的生物動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。當(dāng)用作單一的標(biāo)簽，成像大多數(shù)熒光團(tuán)很簡(jiǎn)單，可以很容易地實(shí)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)照明器和熒光過(guò)濾器集。然而，當(dāng)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光探針的組合時(shí)，調(diào)查員應(yīng)該知道在檢測(cè)通道中的潛在信號(hào)交叉的發(fā)生是由于熒光團(tuán)之間的光譜重疊。

高級(jí)研究顯微鏡能夠在一次實(shí)驗(yàn)中使用單，雙，三或四波段的雙色鏡以及相關(guān)的激勵(lì)和的發(fā)射濾光片集，正在分析的探針的發(fā)射光譜剖面相匹配的多個(gè)熒光成像。不幸的是，許多合成的熒光基團(tuán)和熒光蛋白的發(fā)射光譜的檔案跨越范圍從約50納米到150納米的波長(zhǎng)帶，從而擴(kuò)散到發(fā)射信號(hào)從用于另一個(gè)檢測(cè)通道的一個(gè)探針插入的潛力。情況就復(fù)雜了進(jìn)一步的熒光探針的選擇是有限的，或兩個(gè)以上的熒光蛋白，同時(shí)在相同的試件進(jìn)行調(diào)查對(duì)象。由于研究多個(gè)探針在起居室和固定細(xì)胞之間的相互作用所提供的信息的級(jí)別顯著高于單獨(dú)使用相同的標(biāo)簽的情況下，方法已發(fā)展解開(kāi)發(fā)射信號(hào)的復(fù)雜的混合物，使光譜可以單獨(dú)解決。在這方面*的字段是一種技術(shù)被稱(chēng)為光譜成像耦合數(shù)學(xué)上線(xiàn)性分解所測(cè)得的光譜中，表示目前可作為市售各種各樣的輔助硬件和軟件組件的光學(xué)成像和分子光譜的協(xié)同聯(lián)合廣角和激光掃描共聚焦顯微鏡。

如圖1所示是一個(gè)高性能的尼康A(chǔ)1共聚焦顯微鏡光譜檢測(cè)裝置，可以使在單次掃描多光譜高速采集的剖面圖。的光譜檢測(cè)器是連接到掃描單元通過(guò)的光纖，具有波長(zhǎng)分辨率獨(dú)立的共焦針孔的直徑。首先通過(guò)一個(gè)專(zhuān)有的衍射效率增強(qiáng)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)DEES）為兩個(gè)正交的偏振光的波陣面（稱(chēng)為P和S），使用一個(gè)偏振分束器分開(kāi)進(jìn)入的非偏振光的發(fā)光的熒光發(fā)射光進(jìn)入探測(cè)器。DEES系統(tǒng)的目的是為了增加光的衍射效率由光柵用于分離成不同波長(zhǎng)的熒光發(fā)射。離開(kāi)分束器后的p -波陣面旋轉(zhuǎn)90度（到一個(gè)S -偏振波），使用棱鏡系統(tǒng)和兩個(gè)光束然后由三個(gè)可互換的光柵衍射。的衍射光柵，可以精確地控制，以確保高度的重現(xiàn)性，波長(zhǎng)分辨率為2.5，6，和10納米。使用10納米的光柵，光譜在320納米的范圍內(nèi)，可以在單次掃描方式獲得。由光柵衍射光譜不同波長(zhǎng)的重點(diǎn)由兩個(gè)獨(dú)立可調(diào)的圓柱形鏡，聚焦點(diǎn)產(chǎn)生的每束（正常的s和旋轉(zhuǎn)P波）重疊到一個(gè)32通道多陽(yáng)極光電倍增**。一個(gè)專(zhuān)門(mén)的屏蔽機(jī)制，可同時(shí)混合熒光激發(fā)了四個(gè)激光器。

在許多應(yīng)用中，光譜成像，加上受益于基于軟件的線(xiàn)性分解算法是那些需要破譯個(gè)人光譜吸收染料和熒光基團(tuán)在一個(gè)顯著的光譜重疊程度發(fā)生的情況下，大量的各種型材的能力。調(diào)查涉及活細(xì)胞成像（在動(dòng)物和植物），免疫，染色體核型分析，臨床病理，流式細(xì)胞儀，體內(nèi)成像和藥物發(fā)現(xiàn)可以提高使用光譜成像方法。的光譜信息：使用這種技術(shù)經(jīng)?？梢詤^(qū)分測(cè)量的工件，例如自體熒光，折射率的波動(dòng)，沒(méi)有料到的熒光基團(tuán)的相互作用，和環(huán)境的不均勻性，并獲得所需的信號(hào)從探測(cè)目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)協(xié)議。除了 從實(shí)用程序，在去除不需要的自發(fā)熒光，可以掩蓋的細(xì)節(jié)在許多標(biāo)本，光譜成像也是一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，在分離的重疊發(fā)射光譜的熒光蛋白和其他的熒光基團(tuán)，在動(dòng)態(tài)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的實(shí)驗(yàn)中，這往往是復(fù)雜極其快速的圖像采集的要求。

熒光串?dāng)_

這取決于分子結(jié)構(gòu)和元素組成的微妙細(xì)節(jié)，任何特定的熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射光譜可以分布在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，30和200納米之間的變化。為了說(shuō)明這個(gè)概念，“通用的”吸收和所產(chǎn)生的一個(gè)假設(shè)的熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射光譜如圖2所示。本圖所示的光譜特征是共同所有熒光發(fā)射輪廓近似（但不完全）“鏡像”的吸收輪廓。在更短的波長(zhǎng)區(qū)域的光譜輪廓的發(fā)射光譜具有量子產(chǎn)率急劇增加的曲線(xiàn)接近*大值的（稱(chēng)為峰值發(fā)射波長(zhǎng)）。光譜曲線(xiàn)的峰值，作為波長(zhǎng)繼續(xù)增加，斜率更為緩慢下降，直到達(dá)到一個(gè)*低值后，返回到基線(xiàn)。光譜輪廓的寬度測(cè)定熒光發(fā)射的帶寬一般在*大的量子產(chǎn)率的50％，通常被稱(chēng)為的半峰全寬（FWHM，圖2）。然而，在圖2中從檔案中可以觀察到，在這個(gè)區(qū)域之外，在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（在某些情況下，*過(guò)100納米）而產(chǎn)生的熒光發(fā)射量可以是顯著的。

具有單個(gè)熒光在熒光顯微鏡中成像時(shí)，可以一個(gè)長(zhǎng)通排放過(guò)濾器用于收集在一個(gè)寬的光譜范圍內(nèi)的*大排放量。在這種情況下，不必?fù)?dān)心由另一熒光團(tuán)所產(chǎn)生的排放重疊的信號(hào)的干擾（通常稱(chēng)為交叉，滲色，或串?dāng)_）。然而，當(dāng)成像的多個(gè)熒光標(biāo)記，同時(shí)，發(fā)射的檔案經(jīng)常共享相同的光譜區(qū)域，特別是在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，需要限制排放波長(zhǎng)的帶通濾波器的中心附近的單個(gè)熒光基團(tuán)的峰波長(zhǎng)的限制，或優(yōu)選消除，從其他的熒光團(tuán)的發(fā)射的不必要的檢測(cè)。即使在使用窄帶濾光片，從一個(gè)熒光發(fā)射進(jìn)入檢測(cè)通道用于另一個(gè)流血。成像時(shí)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光蛋白質(zhì)中，經(jīng)常發(fā)射光譜，使用合成染料或量子點(diǎn)，具有窄的發(fā)射光譜公司（通常為30至60納米）時(shí)，此問(wèn)題不太嚴(yán)重，但變得更為嚴(yán)重跨越幾百納米。請(qǐng)注意，在整個(gè)可見(jiàn)光譜區(qū)域的寬度被限制為約300納米（從約400到700納米）。因此，同時(shí)成像的兩個(gè)分離的熒光蛋白，每一個(gè)具有跨越150納米的發(fā)射光譜公司，導(dǎo)致了一個(gè)顯著部分在可見(jiàn)光光譜的檢測(cè)信號(hào)。

熒光發(fā)射的電平信號(hào)，可以檢測(cè)到確定的寬度的發(fā)射濾波器的通帶和熒光團(tuán)激發(fā)的效率的一個(gè)因素，是由耦合的熒光團(tuán)的激發(fā)濾光器的通頻帶寬度的吸收光譜的檔案。其結(jié)果是，即使是在熒光基團(tuán)的情況下，在其發(fā)射的檔案中有顯著的重疊，它們可能不產(chǎn)生可檢測(cè)的串?dāng)_，如果激發(fā)光濾光片的波長(zhǎng)通帶特性都經(jīng)過(guò)精心挑選。此外，由于激勵(lì)效率急劇下降的事實(shí)，在波長(zhǎng)比周?chē)奈辗澹ㄒ?jiàn)圖2），熒光基團(tuán)具有的*長(zhǎng)波長(zhǎng)的吸收特性往往可以專(zhuān)門(mén)興奮沒(méi)有同時(shí)令人興奮的熒光基團(tuán)，在更短的波長(zhǎng)的吸收。例如，當(dāng)成像增強(qiáng)型青色（ECFP）和黃色熒光蛋白（EYFP）（具有高度重疊的發(fā)射光譜;參見(jiàn)圖3（b）），可以盡量減少串?dāng)_*激勵(lì)和檢測(cè)EYFP，其次是成像的波長(zhǎng)較短的ECFP使用激發(fā)和發(fā)射濾光片設(shè)計(jì)，以盡量減少激發(fā)EYFP。這種技術(shù)依賴(lài)于使用帶通發(fā)射過(guò)濾器，通?？梢詸z測(cè)只有大約50％或更少的可用由每個(gè)熒光團(tuán)發(fā)射的光子的順序成像。此外，這樣的做法不會(huì)有效使用熒光基團(tuán)（如ECFP和EGFP;參見(jiàn)圖3（c）），有太多的光譜重疊或不尋常的斯托克斯轉(zhuǎn)變時(shí)。

圖3中所示的計(jì)算機(jī)模擬的活細(xì)胞表達(dá)兩種熒光蛋白的幾種組合的示范頻譜交叉熒光成像。這些細(xì)胞是印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞在細(xì)胞核中表達(dá)ECFP（頻道1），無(wú)論EGFP，EYFP的或單體Kusabira的橙色熒光蛋白（MKO）β -肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架細(xì)絲融合（通道2）。光譜重疊的區(qū)域中為每個(gè)探頭組合表示的濾波器窗口內(nèi)的灰色區(qū)域中的頻譜圖。這些熒光蛋白組合展示出不同程度的發(fā)射光譜重疊。ECFP和人民圣戰(zhàn)組織（圖3（a））相結(jié)合的展示*少量的重疊和ECFP-標(biāo)記的細(xì)胞核并沒(méi)有顯示通道2中的主要信號(hào)（通道）人民圣戰(zhàn)組織。ECFP和EYFP的組合（圖3（b）條）與此相反，具有相當(dāng)多的重疊，在通道2中較為清晰和細(xì)胞核。*后，ECFP和EGFP的組合演示光譜重疊程度*高的（圖圖3（c）），在通道之間有顯著的信號(hào)交叉。

嘗試使用三個(gè)或更多的熒光蛋白，可在一次實(shí)驗(yàn)中，需要使用更加高度受限制的激發(fā)和發(fā)射濾波器策略。兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光基團(tuán)的結(jié)果，在一些不良后果，包括速度的限制，由于連續(xù)成像的必要性，在大多數(shù)情況下，成像的靈敏度降低為較小的濾波器的通帶的大小，和更復(fù)雜的標(biāo)記策略是必要的，以減少光譜重疊的結(jié)果。收集圖像順序，需要更多的時(shí)間比同時(shí)成像和業(yè)績(jī)的快速采集過(guò)程中試樣的運(yùn)動(dòng)，可以妥協(xié)。此外，在活細(xì)胞中的熒光信號(hào)電平往往是低的，尤其是對(duì)于稀疏目標(biāo)豐度表達(dá)內(nèi)源性水平的標(biāo)本。其結(jié)果是，使用有限的通帶過(guò)濾器的檢測(cè)可以是具有挑戰(zhàn)性。的信號(hào)與噪聲的的未混合數(shù)據(jù)集往往*過(guò)排放窄帶帶通濾波器獲得，因?yàn)檎麄€(gè)150納米熒光探針的發(fā)射帶寬可以樣品，而不是只是一個(gè)狹窄的30納米發(fā)射窗口。*后，熒光蛋白調(diào)色板仍然是相當(dāng)有限的，并在寬的發(fā)射公司很難干凈地分離排放或其他需要專(zhuān)門(mén)的過(guò)濾器集。因此，在活細(xì)胞成像高速數(shù)據(jù)采集往往是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵任務(wù)的因素，這些后果可以有嚴(yán)重影響的調(diào)查結(jié)果。

光譜顯微鏡

光譜成像顯微鏡和光譜學(xué)的學(xué)科合并成一個(gè)組合，使確定的強(qiáng)度和光譜圖像中的每個(gè)像素的標(biāo)本。在成像的*近的技術(shù)進(jìn)步產(chǎn)生的高度復(fù)雜的數(shù)碼相機(jī)和點(diǎn)源檢測(cè)器（光電倍增管等），能夠以高空間分辨率和動(dòng)態(tài)范圍的各種樣品，從眾多對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，包括明場(chǎng)下創(chuàng)建信息豐富的圖像，相位相反，和熒光顯微鏡。這些探測(cè)器的進(jìn)步也擴(kuò)展能力創(chuàng)造合適的圖像依稀熒光標(biāo)本，其先前失去了在本底噪聲低信號(hào)電平。與此相反，光譜法是一種行之有效的字段，包括收集和分析的定量收集在規(guī)定的波長(zhǎng)頻帶的光強(qiáng)度值，它可以包括任何部分的電磁輻射光譜。顯微鏡，光譜成像技術(shù)通常只限于從近紫外到近紅外的波長(zhǎng)范圍。

原子和分子，可以檢查與光譜儀的特性的能帶結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，光吸收的過(guò)程中，一個(gè)電子從基態(tài)激發(fā)到更高的能級(jí)，從它可以通過(guò)幾個(gè)途徑，包括衰變到基態(tài)與低能量的光（熒光）相關(guān)聯(lián)的排放量放松。的能量水平是每個(gè)分子的內(nèi)在性質(zhì)，因此該分子提供一個(gè)精確的光譜的指紋。熒光，特定的分子（稱(chēng)為熒光染料或熒光團(tuán)）連接到感興趣的結(jié)構(gòu)，用作光源成像。在熒光顯微鏡中要注意的一個(gè)重要概念是，往往直接熒光基團(tuán)的濃度和熒光強(qiáng)度的量的，尤其是在低濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系。這種情況使定量分析的熒光，在必要的信號(hào)的情況下，可以成功地分開(kāi)，飽和度，光轉(zhuǎn)換，光漂白效果，往往會(huì)干擾預(yù)期的線(xiàn)性。

不同于與熒光的情況下，在其他形式的光學(xué)顯微鏡，包括明場(chǎng)，增強(qiáng)對(duì)比度的傳播模式（相襯;霍夫曼調(diào)制對(duì)比度，HMC ;微分干涉對(duì)比，DIC），反射光，散射，試樣與外部寬帶照明光源和檢測(cè)器的測(cè)量相同的光后，與試樣相互作用。為了分析光譜數(shù)據(jù)，由所述光源發(fā)射的頻譜必須被考慮，所測(cè)量的信號(hào)通常是不成正比，除非它首先被轉(zhuǎn)換為光密度單位的發(fā)色團(tuán)或在試樣的吸光物質(zhì)的濃度根據(jù)比爾-朗伯定律。然而，大多數(shù)的細(xì)胞和組織染色吸收染料和成像的使用明場(chǎng)技術(shù)的光譜成像分析的總理候選人。

為了測(cè)量的光譜吸收染料，熒光基團(tuán)，或完成試樣與多個(gè)標(biāo)簽，傳輸或發(fā)射的光被分散成它的組成波長(zhǎng)測(cè)定在各波長(zhǎng)的強(qiáng)度或波長(zhǎng)的帶寬很窄。光譜分辨率為每次測(cè)量的帶寬取決于作為采樣通道decreses的帶寬增加。各種不同的技術(shù)可以用于分散光，其中大部分已被應(yīng)用的（至少在原型工具）顯微鏡場(chǎng)景。其中*重要的特征光譜測(cè)量時(shí)要考慮的是分辨率，波長(zhǎng)范圍和動(dòng)態(tài)范圍。光譜分辨率是由*接近的波長(zhǎng)可以彼此區(qū)分的，高度精確的光譜成像測(cè)量的是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。光譜范圍內(nèi)是指在一個(gè)特定的測(cè)量波長(zhǎng)（實(shí)際上，帶寬）的總數(shù)。*后，檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)范圍定義信號(hào)分別進(jìn)行分辨的水平在一個(gè)特定的測(cè)量的尺寸和數(shù)量，所需的*低水平。所有這些值可以為每個(gè)熒光團(tuán)或吸光物質(zhì)的光譜輪廓的函數(shù)發(fā)生變化。

如圖4中所示，是在連續(xù)跨越500至692納米的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以產(chǎn)生一個(gè)lambda堆棧（在下面詳細(xì)討論），其中包含32張圖片6納米的帶寬獲得的一組典型的光譜圖像。樣品是培養(yǎng)貼壁人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞線(xiàn)）中，用吖啶橙染色的DNA和RNA，并用尼康A(chǔ)1光譜共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的成像。圖像（512×512像素），使用32個(gè)通道的多陽(yáng)極光電倍增管以每秒24幀，使用488納米的激光激發(fā)記錄。如此高的采集速度，這是活細(xì)胞成像的重大利益，可以通過(guò)*的信號(hào)處理技術(shù)，再加上快速的模擬 - 數(shù)字轉(zhuǎn)換電路，隨著倍增。

光譜成像注意事項(xiàng)

*次出現(xiàn)在遙感領(lǐng)域的精密光譜成像技術(shù)由于要求分析衛(wèi)星圖像數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的反映，折射和散射的太陽(yáng)光，以及陰影，在同一場(chǎng)景中。頻譜分析方法的目的是使從圖像數(shù)據(jù)集的多個(gè)頻率特性，為了區(qū)分各種景觀和地形的觀察對(duì)象。類(lèi)似的技術(shù)用于其他應(yīng)用，從研究材料的化學(xué)成分闡發(fā)恒星和星系的形成機(jī)制。因此，通過(guò)檢查作為譜頻率（波長(zhǎng)）的函數(shù)的單個(gè)像素相關(guān)聯(lián)的，相匹配的光譜信息的強(qiáng)度波動(dòng)，新的細(xì)節(jié)可以露天模糊簡(jiǎn)單地分析單個(gè)圖像時(shí)，利用混合頻率的光捕獲。

在一般情況下，衛(wèi)星和天體的數(shù)據(jù)集是具有一個(gè)或二個(gè)探針標(biāo)記的生物標(biāo)本的圖像所得到的復(fù)雜得多，因?yàn)楣庾V的類(lèi)的數(shù)量通常是更大的。無(wú)論如何，衛(wèi)星圖像的光譜特征是相似的檢查重疊的熒光蛋白在活細(xì)胞或固定的組織標(biāo)本，標(biāo)記的一些吸收染料（如曙紅，蘇木）的混合物時(shí)，所獲得的復(fù)雜性。在過(guò)去的幾年中，應(yīng)用衛(wèi)星成像的**方法已成功遷移到廣角和激光掃描共聚焦顯微鏡的一些應(yīng)用，包括消除自發(fā)熒光文物生物標(biāo)本的分析，檢測(cè)弱和卷積福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào)，在人類(lèi)染色體核型分析，并為解開(kāi)共定位的一個(gè)像素的像素的基礎(chǔ)上的熒光基團(tuán)。將所得的光譜信息可以用于精確定位的位置特定的熒光基團(tuán)和染料具有高空間精度，也可能能夠產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)探針之間的相互作用信息。

在常規(guī)情況下，實(shí)驗(yàn)協(xié)議許可，傳統(tǒng)的共焦和廣角成像技術(shù)可以成功應(yīng)用于通過(guò)精心挑選的熒光探針和相關(guān)的過(guò)濾器集，以及通過(guò)實(shí)施適當(dāng)?shù)目刂?，以產(chǎn)生合理的分離，熒光掃描multitracking戰(zhàn)略信號(hào)。不幸的是，增加使用多個(gè)熒光蛋白的顏色與他們的關(guān)聯(lián)程度高的頻譜重疊監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的相互作用，往往限制了實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇。此外，在使用單個(gè)熒光活細(xì)胞成像，自然的自體熒光可以顯著干擾檢測(cè)通道，其中*流行的綠色發(fā)光的熒光探針（如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）是可視化。該背景噪聲問(wèn)題也可能變得非常嚴(yán)重，通過(guò)使用固定劑或DNA轉(zhuǎn)染試劑引入多余的熒光。在熒光探針光譜明顯重疊或自發(fā)熒光過(guò)高的情況下，再加上收購(gòu)后使用線(xiàn)性分解算法可以用來(lái)解開(kāi)混合熒光信號(hào)，并明確解決的空間貢獻(xiàn)每個(gè)熒光圖像分析光譜成像。

光譜圖像拉姆達(dá)堆棧

類(lèi)似的概念獲得厚的試樣，使用高數(shù)值孔徑物鏡的激光掃描共聚焦或反卷積顯微鏡的光學(xué)部分（或z棧的），拉姆達(dá)堆棧是一個(gè)三維的圖像集合中包括的數(shù)據(jù)集使用相同的試樣字段在不同的波長(zhǎng)帶，每一個(gè)橫跨在有限的頻譜范圍從2到20納米的區(qū)域獲得。相比之下，典型的一切形式的光學(xué)顯微鏡的成像方案涉及收購(gòu)（或時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)組連續(xù)圖像）的整個(gè)波長(zhǎng)的探測(cè)器響應(yīng)帶一個(gè)單一的形象。因此，盡管傳統(tǒng)的成像產(chǎn)生的圖像中的每個(gè)像素的強(qiáng)度值（ I （的x，y）），用分光光度計(jì)測(cè)量只提供了一個(gè)頻譜（ I （λ））。在lambda堆棧合并這些所提供的頻譜在每個(gè)像素的值（I （的x，y，λ）），以創(chuàng)建作為收集在一個(gè)不同的波長(zhǎng)（或窄頻帶的波長(zhǎng)，其中每個(gè)圖像獲取的圖像可以被認(rèn)為），或作為不同的波長(zhǎng)值在每個(gè)像素位置的集合。

為了更好地理解的lambda堆棧的概念（通常也被稱(chēng)為在文獻(xiàn)中作為圖像的多維數(shù)據(jù)集或光譜立方體），單個(gè)像素的位置在橫向的圖像尺寸（具有坐標(biāo) x _我 Y _我的），可以檢驗(yàn)沿波長(zhǎng)（?_λ）軸。在圖5（a）的強(qiáng)度和/或顏色的像素我作為熒光發(fā)射的信號(hào)強(qiáng)度和波長(zhǎng)的函數(shù)的變化，分 別如圖時(shí)，從一端的lambda堆棧的其他監(jiān)視。通過(guò)繪制的像素強(qiáng)度與波長(zhǎng)的直線(xiàn)圖形（參見(jiàn)圖5（b）條），空間位于像素的特定熒光團(tuán)的發(fā)射光譜的檔案我可以很容易地確定。應(yīng)當(dāng)指出的是，使用這種技術(shù)獲得的發(fā)射光譜的準(zhǔn)確度和分辨率是聚集在不同的波長(zhǎng)帶的，在每個(gè)波長(zhǎng)帶內(nèi)的納米（較短的帶寬產(chǎn)生更高的分辨率）的頻譜寬度的lambda堆棧的圖像的數(shù)量的函數(shù)，根據(jù)調(diào)查樣本的身體素質(zhì)和光子探測(cè)器的靈敏度（量子效率）。

圖6給出了一個(gè)真實(shí)世界的例子，激光掃描共聚焦顯微鏡用三個(gè)重疊光譜的熒光蛋白在活細(xì)胞上獲得一個(gè)lambda棧。本實(shí)驗(yàn)中使用的熒光蛋白標(biāo)記的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP從水母，*大發(fā)射波長(zhǎng)在507納米），增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP從水母，*大發(fā)射波長(zhǎng)在527納米），和單體的版本：橙Kusabira（人民圣戰(zhàn)組織*大發(fā)射波長(zhǎng)在561納米），一個(gè)高性能的探針，從天然存在的珊瑚蛋白開(kāi)發(fā)。在這種情況下，個(gè)別的lambda堆棧的圖像進(jìn)行掃描，在10納米波段的范圍從480至640納米（圖圖6（a）），生成一個(gè)共16光譜部分的熒光蛋白的混合物。

所述*圖像的lambda堆棧揭示了檢體中的發(fā)射范圍為480至490納米的光譜特征，而所述第二圖像包含從490至500納米（參見(jiàn)圖6（b））的排放數(shù)據(jù)。需要注意的是幾乎所有的來(lái)自?xún)蓚€(gè)lambda在*部分熒光發(fā)射的短波長(zhǎng)尾巴的EGFP單獨(dú)只有一個(gè)很小的EYFP在波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分（490至500納米）的貢獻(xiàn)。（500到510納米和510納米至520納米），在接下來(lái)的兩個(gè)lambda部分EYFP的貢獻(xiàn)穩(wěn)步提高，EGFP的排放物達(dá)到一個(gè)高原。在520和550納米之間的三個(gè)拉姆達(dá)部分的開(kāi)始，該EGFP信號(hào)的貢獻(xiàn)減小，從EYFP發(fā)射大約530納米處達(dá)到*大值。同樣，人民圣戰(zhàn)組織的排放貢獻(xiàn)變得更加顯著，在540和550納米之間的頻帶。因此，在550至560納米的頻帶，從熒光蛋白質(zhì)的相對(duì)貢獻(xiàn)是約10，25，和65％分別為EGFP，EYFP，人民圣戰(zhàn)組織。

EGFP和EYFP成為人民圣戰(zhàn)者組織主導(dǎo)的排放物*終的波段（560?640納米）減少排放貢獻(xiàn)。我們回顧一下，在極端的lambda堆棧（480至500納米之間，在590至640納米之間）波段的功能，*短和*長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)光蛋白，EGFP和人民圣戰(zhàn)者組織，分別主要由排放貢獻(xiàn)。這些波長(zhǎng)帶的中心的lambda堆棧（500到590納米），代表了一定的貢獻(xiàn)從所有三個(gè)熒光蛋白含有熒光。如下面將要討論的，在整個(gè)波長(zhǎng)頻帶的lambda堆棧的混合發(fā)射信號(hào)的分布可以線(xiàn)性未混合使用參考從每個(gè)探針的發(fā)射光譜公司明確分開(kāi)的貢獻(xiàn)的個(gè)體的熒光蛋白。

光譜成像技術(shù)

光譜成像光學(xué)顯微鏡的主要器樂(lè)代價(jià)包括能夠準(zhǔn)確地分離熒光發(fā)射或光源光試樣吸收到它的組成波長(zhǎng)色散元件或類(lèi)似的技術(shù)。已經(jīng)實(shí)施了許多不同的方法在廣角和共聚焦顯微鏡使用幾個(gè)探測(cè)器設(shè)計(jì)產(chǎn)生的lambda棧。已被證明是*有用的工具依賴(lài)于棱鏡或衍射光柵的光譜檢測(cè)器配備有分散，然后將其引導(dǎo)到一個(gè)或多個(gè)光電倍增管的熒光發(fā)射的激光掃描共聚焦顯微鏡。*的激光共聚焦儀器包含棱鏡或衍射光柵發(fā)射光束分散到其成分譜，然后傳遞到任何一個(gè)多陽(yáng)極光電倍增管可以同時(shí)檢測(cè)多達(dá)32個(gè)獨(dú)立通道的光譜信息，或通過(guò)選擇波長(zhǎng)狹縫一個(gè)檢測(cè)器，并反映了額外的狹縫較短和較長(zhǎng)的波長(zhǎng)。寬視場(chǎng)儀器利用干涉濾光器，聲光可調(diào)諧濾波器（AOTFs），液晶可調(diào)諧濾波器（LCTFs），干涉，棱鏡耦合到反射鏡，棱鏡或光柵，用于圖像分析產(chǎn)生的lambda棧。

在眾多的技術(shù)，已被用于生成lambda棧的，所謂的波長(zhǎng)掃描方法代表可能是*簡(jiǎn)單的方法。在實(shí)踐中，一系列的窄帶通干涉濾光器（通常為5至20納米的寬）用來(lái)收集每個(gè)過(guò)濾器的視場(chǎng)的圖像的堆棧。或者，可以組合shortpass和長(zhǎng)通濾波器，具有特別尖銳截止波長(zhǎng)的帶通濾波器來(lái)代替。在一些早期的光譜成像的共聚焦顯微鏡實(shí)現(xiàn)這種類(lèi)型的配置，但已經(jīng)被更*的技術(shù)所取代。使用過(guò)濾器時(shí)，帶通的大小確定 的λ掃描包括在每個(gè)波長(zhǎng)的數(shù)目，因此，光譜分辨率。后車(chē)輪轉(zhuǎn)動(dòng)到位（請(qǐng)參閱圖7（a））的新的過(guò)濾器的發(fā)射過(guò)濾器被放置在一個(gè)過(guò)濾器輪之間的試樣和檢測(cè)器，以獲得連續(xù)的圖像相同的試樣字段。一般情況下，基于過(guò)濾器的光譜成像技術(shù)是實(shí)用，僅有限數(shù)量的波段的情況下，必需的，因?yàn)樵嚇樱仨毞磸?fù)掃描的每一個(gè)過(guò)濾器，而這往往導(dǎo)致過(guò)度的光漂白。此外，收集的lambda棧過(guò)濾器是一個(gè)比較緩慢的過(guò)程（至少需要幾分鐘），不適合用于活細(xì)胞成像所需的時(shí)間尺度。

用于獲得波長(zhǎng)掃描的λ棧的更方便的方法是使用可變?yōu)V波器（參見(jiàn)圖7（b）），可被精細(xì)地調(diào)諧，提供更多數(shù)量的波長(zhǎng)帶，通常是更緊湊的過(guò)濾器的車(chē)輪。*廣泛使用的可變?yōu)V波器的配置是基于可變頻譜干擾濾波器和電可調(diào)諧的光濾波器。圓形可變?yōu)V波器包含的干涉濾光器，在空間上改變?nèi)Q于入射光穿過(guò)過(guò)濾器的波長(zhǎng)通帶。在實(shí)踐中，過(guò)濾器被放置在相同的位置作為一個(gè)過(guò)濾器輪，旋轉(zhuǎn)來(lái)改變通帶。無(wú)商業(yè)工具提供使用變量過(guò)濾器，可能是由于拉姆達(dá)的堆棧圖像包含一分鐘的疊加譜梯度表現(xiàn)濾波器設(shè)計(jì)的事實(shí)。但是，有幾個(gè)光譜檢測(cè)器提供的（參見(jiàn)圖7（c）和圖7（四））AOTF和LCTF設(shè)計(jì)的基于位置之間的可調(diào)諧濾光器的照明光源和試樣（當(dāng)使用寬帶光源，例如電弧放電燈）或試樣和檢測(cè)器之間。不幸的是，樣品和探測(cè)器之間放置一個(gè)AOTF或LCTF可以導(dǎo)致貧困，由于極化和散射文物的傳輸效率。

AOTF和LCTF濾波器的的主要優(yōu)點(diǎn)是，它們是電光學(xué)元件，沒(méi)有移動(dòng)部件，濾光輪和狹縫的系統(tǒng)相比，能夠快速的切換時(shí)間。液晶可調(diào)諧濾波器的操作由安裝兩個(gè)線(xiàn)性偏振器之間，在一極化液晶施加電壓時(shí)，發(fā)射的窄帶波長(zhǎng)。在大多數(shù)實(shí)現(xiàn)中，幾個(gè)階段要實(shí)現(xiàn)高分辨率的光譜分離的條件，也減少了在濾波器的通帶之內(nèi)的總透光量。發(fā)送非偏振光（熒光發(fā)射）時(shí)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的LCTF具有約40％的光通過(guò)。如果*次通過(guò)的非偏振光通過(guò)偏振分束器，用于反射和透射的光的正交偏振的LCTF，效率可以提高一倍。過(guò)濾后的光，然后可以使用兩個(gè)單獨(dú)的檢測(cè)器檢測(cè)到或重新組合成一個(gè)單一的檢測(cè)器與另一偏振分束器，與圖像放置側(cè)的兩側(cè)或重疊（后者需要精確的注冊(cè)）。利用兩個(gè)偏振圖像的偏振熒光各向異性的圖像，可以是特別有用的，當(dāng)進(jìn)行FRET的熒光蛋白的測(cè)量使計(jì)算。

聲光可調(diào)諧濾波器采用一個(gè)專(zhuān)門(mén)的結(jié)晶化合物，如二氧化碲的晶格變形響應(yīng)聲波。在每個(gè)聲頻，晶體變形，產(chǎn)生的衍射光柵，具有一個(gè)特定的期間，發(fā)送一個(gè)不同的波長(zhǎng)（或窄頻帶的波長(zhǎng)）。這兩個(gè)濾波器的設(shè)計(jì)產(chǎn)生一個(gè)lambda堆棧通過(guò)捕獲在不同的波長(zhǎng)帶的連續(xù)的圖像的優(yōu)點(diǎn)，并具有非常高的光譜分辨率。此外，操作員可以為每個(gè)單獨(dú)的波長(zhǎng)帶中選擇一個(gè)*佳的曝光時(shí)間。在下行路上，AOTF過(guò)濾器可以是有問(wèn)題的，如上所述，使用時(shí)發(fā)射光學(xué)列車(chē)（樣品和探測(cè)器之間）由于光線(xiàn)不好的吞吐量，以及圖像模糊和移位文物。一些制造商已經(jīng)產(chǎn)生的圖像質(zhì)量AOTF設(shè)備。也可以用來(lái)作為一種聲光可調(diào)諧濾波器可以在共聚焦顯微鏡的聲光分束器（AOBS），以取代通常的過(guò)濾器相結(jié)合的激光。AOBS使快得多波長(zhǎng)切換比過(guò)濾器可以是特別有用的，當(dāng)結(jié)合一個(gè)*連續(xù)白色光激光。

光譜成像時(shí)間掃描方法是基于獲取的數(shù)據(jù)集，它表示的光譜和空間信息的疊加，但還需要一個(gè)收集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)出的光譜圖像的數(shù)學(xué)變換。在實(shí)踐中，該技術(shù)不要求的過(guò)濾器或棱鏡耦合的干涉計(jì)單元（圖7（五））在熒光顯微鏡進(jìn)行傅里葉變換成像光譜通常被實(shí)現(xiàn)在寬視場(chǎng)顯微鏡。干涉的方法分割成兩個(gè)獨(dú)立的路徑的光的入射光束和兩個(gè)得到的光束之間的時(shí)間延遲引入的光程差。兩束光在到達(dá)探測(cè)器（CCD或光電倍增管），能夠干擾。通過(guò)測(cè)量強(qiáng)度的光程差為一個(gè)函數(shù)，創(chuàng)建干涉是特定的試樣的光譜特性。而計(jì)算出來(lái)的原來(lái)的頻譜施加傅里葉變換算法的干涉。成像光譜法的*顯著的優(yōu)點(diǎn)是，收集整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在各波長(zhǎng)的強(qiáng)度的分辨率可調(diào)制只需通過(guò)調(diào)整采集參數(shù)。*的缺點(diǎn)是，即使在情況下，只有少數(shù)幾個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都需要，必須收集檢體的整個(gè)頻譜。一般成像光譜儀上進(jìn)行定制工具，由于缺乏商業(yè)儀器。

流式細(xì)胞儀技術(shù)迅速推進(jìn)，也可以從光譜成像技術(shù)中獲益。成像時(shí)，由于空間的限制流式細(xì)胞儀，光譜成像是通過(guò)選擇一個(gè)更小的感興趣區(qū)域（通常具有一個(gè)單一的單元的尺寸）和限制，以所收集的波長(zhǎng)頻帶的數(shù)目進(jìn)行的。因此，被分散的熒光發(fā)射的衍射光柵或定制的光學(xué)元件的表面上投影的時(shí)間延遲集成（TDI）CCD傳感器的像素時(shí)鐘同步的流量。類(lèi)似的方法，利用電腦斷層掃描，全息分散元素投射到面陣CCD光譜和空間信息。在一般情況下，CCD照相機(jī)的速度與一個(gè)單一的lambda棧需要幾分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間的收集光譜成像是一個(gè)主要的限制。然而，出現(xiàn)了更快的系統(tǒng)可以幫助克服這些缺陷。數(shù)碼相機(jī)也需要重復(fù)掃描捕獲一個(gè)lambda棧，這可能會(huì)導(dǎo)致增加漂白和光毒性。更為重要的是在活細(xì)胞成像標(biāo)記的結(jié)構(gòu)可以改變空間位置在一個(gè)lambda堆棧消耗幾分鐘收購(gòu)速度的情況。

在激光掃描和多光子共聚焦顯微鏡成像光譜

檢體的整個(gè)頻譜的應(yīng)用空間掃描的光譜成像技術(shù)，可以同時(shí)獲取通過(guò)在一個(gè)單一使用點(diǎn)掃描或行掃描儀器。這種方法是特別有用的活細(xì)胞成像和探測(cè)厚的組織，那里的標(biāo)本必須經(jīng)常反復(fù)進(jìn)行掃描，并因此接觸到大量的潛在的破壞性激發(fā)照明。空間掃描的光譜成像方法需要使用（圖8（a）和圖8（c））的衍射光柵或棱鏡（圖8（b））的分散體的熒光發(fā)射，并已被廣泛的使用在商用激光掃描顯微鏡和多光子。這些儀器通過(guò)棱鏡或光柵的色散，然后通過(guò)收集使用可變寬度的狹縫或多通道光電倍增器的選定部分的頻譜分離成它的組成波長(zhǎng)的熒光發(fā)射。為了控制在共聚焦儀器配備有狹縫的波長(zhǎng)選擇帶寬，光圈的大小是可調(diào)的。對(duì)于含有多通道光電倍增管的工具，衍射光柵的大小可以被改變（通過(guò)旋轉(zhuǎn)一個(gè)新的光柵具有不同的行間距到光學(xué)列車(chē)）控制進(jìn)入檢測(cè)器中的每個(gè)信道的波長(zhǎng)的數(shù)目。普通的到兩個(gè)儀器設(shè)計(jì)的存在下，以確保在所捕獲的頻譜缺乏的物理間隙的多個(gè)檢測(cè)通道。不管帶寬的大小，只限于由光電倍增管或通道的數(shù)量的數(shù)量的圖像，可以聚集在一個(gè)單一的lambda堆棧。

*通用的光譜成像的共聚焦顯微鏡的配置可以大大提高采集速度收集的lambda棧，利用多通道光電倍增管收集有限容量的波段熒光發(fā)射后，它已被分散使用衍射光柵（見(jiàn)圖8（ c）條）。此次收購(gòu)戰(zhàn)略已經(jīng)成功實(shí)施尼康的C1si的A1共聚焦儀器，其中每一個(gè)都能夠高速只有一個(gè)單一的掃描光譜采集。多通道光電倍增管（通常稱(chēng)為多陽(yáng)極光電倍增管），這些工具包含一個(gè)線(xiàn)性陣列的單個(gè)10納米檢測(cè)通道建立成一個(gè)單一的單元，從而使多個(gè)發(fā)射帶并行成像，從而嚴(yán)重限制了標(biāo)本漂白和光毒性。尼康光譜檢測(cè)單元具有與采樣增量2.5，5（或6），10納米，可以單獨(dú)的光路進(jìn)行調(diào)整的頻譜帶寬的lambda部分旋轉(zhuǎn)到一些衍射光柵。分散的排放量，然后通過(guò)32個(gè)通道的多陽(yáng)極光電倍增管的精確定義的通道每個(gè)通道生成一個(gè)單獨(dú)的圖像。熒光發(fā)射的總帶寬是由衍射光柵采樣增量決定：2.5納米抽樣產(chǎn)生一個(gè)80納米的帶寬，5納米光柵產(chǎn)生160納米的帶寬，而6納米光柵產(chǎn)生192納米的帶寬和10納米光柵產(chǎn)生320納米波段。在Nikon儀器，光譜成像檢測(cè)器的使用激光屏蔽機(jī)制，消除了來(lái)自激勵(lì)源的激光反射光的，和衍射光柵可以?xún)A斜，以選擇任何的子采樣的帶寬。

其中高性能成像光譜共焦顯微鏡的*功能尼康**的專(zhuān)有衍射效率增強(qiáng)系統(tǒng)（DEES），這是設(shè)計(jì)，消除兩極分化文物，光柵波長(zhǎng)減少損失，并捕捉熒光發(fā)射的*大金額。DEES系統(tǒng)操作通過(guò)非偏振的熒光發(fā)射通過(guò)產(chǎn)生兩個(gè)分量的波陣面取向平行和垂直于入射平面的，分別稱(chēng)為P和S偏振光的雙分束器的光學(xué)元件。*精通觀察到s -偏振光的光衍射效率，所以偏振旋轉(zhuǎn)器被定位在該途徑的s -偏振光的光的p偏振光的光而產(chǎn)生，顯著提高了工作效率的光柵系統(tǒng)。正如圖9（a）中所示，對(duì)偏振光的衍射效率是450至675納米的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的90％以上。與此相反，S -偏振的光的效率是80％，在450納米和幾乎呈線(xiàn)性下降到約45％，在675納米。因此，尼康DEES系統(tǒng)可以顯著提高光的通過(guò)，因此，靈敏度，在光譜檢測(cè)單元。頻譜寬度的情況下，必須進(jìn)行調(diào)整，可以進(jìn)行額外的試樣掃描相鄰探測(cè)器通道可以組合（稱(chēng)為分級(jí)），雙，三，或四重檢測(cè)頻帶的寬度。

雖然基于狹縫的光譜成像的共焦工具能夠在高分辨率成像的發(fā)射光譜，它們的速度相對(duì)較慢時(shí)相比，裝有與多陽(yáng)極光電倍增管的顯微鏡。即使是那些工具的功能鏡像狹縫部分的帶寬，以反映第二或第三倍增仍然遭受缺乏成像速度為活細(xì)胞成像所需的時(shí)間尺度。在許多情況下，*過(guò)200納米的狹縫系統(tǒng)測(cè)量頻譜可能需要幾分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，從而阻礙了光譜成像的標(biāo)本，在整個(gè)拍攝期間，經(jīng)過(guò)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)。光譜成像顯微鏡的性能，*的功能，提高靈敏度校正在基于多陽(yáng)極顯微鏡（參見(jiàn)圖9（b））。這些工具使用的基礎(chǔ)上可溯源的光源的發(fā)射線(xiàn)和亮度調(diào)整每個(gè)通道的波長(zhǎng)精度校正。此外，光纖元件的端部和檢測(cè)器的表面都涂有一種特有的防反射劑，以減少信號(hào)的損失，并實(shí)現(xiàn)高的光傳輸。*后，*的雙積分信號(hào)處理（DISP）技術(shù)已被添加到圖像處理電路，以提高電效率，防止信號(hào)損失，同時(shí)數(shù)字化器處理的像素?cái)?shù)據(jù)和復(fù)位。其結(jié)果，該信號(hào)被監(jiān)測(cè)整個(gè)像素的駐留時(shí)間，從而顯著改善的信號(hào)-噪聲比。事實(shí)上，這些技術(shù)相結(jié)合使32通道光譜成像（512×512像素）每秒24幀的速度足夠快，為各種各樣的活細(xì)胞成像應(yīng)用。

除了使用熒光發(fā)射光譜成像產(chǎn)生的lambda棧，這項(xiàng)技術(shù)也可以被擴(kuò)展到利用下的熒光激發(fā)光譜特性調(diào)查。基于激勵(lì)的lambda棧，可以通過(guò)改變使用單一探測(cè)器收集熒光激發(fā)波長(zhǎng)陪同收購(gòu)。由于這樣的事實(shí)，排放聚集在一個(gè)單一的通道，通常是高的信號(hào) - 噪聲比，并提出了一種用于數(shù)據(jù)處理的優(yōu)勢(shì)。激勵(lì)的lambda棧分析使用相同的線(xiàn)性分解算法設(shè)計(jì)用于發(fā)射的光譜數(shù)據(jù)（見(jiàn)下文）。在一般情況下，一個(gè)寬帶激光光源能產(chǎn)生廣泛的線(xiàn)與快速切換的需要，收集高分辨率的激發(fā)的lambda棧，但更簡(jiǎn)單的形式從不同的激光器可以實(shí)現(xiàn)使用多個(gè)單獨(dú)的線(xiàn)。激發(fā)光譜成像的主要缺點(diǎn)是相對(duì)緩慢的成像速度，來(lái)自順序波長(zhǎng)掃描的要求。因此，該技術(shù)是成像時(shí)，更實(shí)用，而不是固定的細(xì)胞和組織為活細(xì)胞成像。在未來(lái)，*連續(xù)白光激光共聚焦顯微鏡，光譜成像使用激勵(lì)棧應(yīng)該成為更多的主流。

光譜成像是一種新興的一個(gè)功能**的分析工具，在多光子顯微鏡，激勵(lì)源通常是一個(gè)連續(xù)可調(diào)的近紅外激光脈沖。的潛在能力，有效地分離的熒光基團(tuán)與多光子技術(shù)是借助于一個(gè)事實(shí)，即許多具有高度重疊的發(fā)射光譜公司的熒光基團(tuán)具有不同的多光子激發(fā)的顯著少的重疊光譜。在這種情況下，線(xiàn)性分解應(yīng)該有分開(kāi)的能力，熒光探針，否則將有太多的發(fā)射重疊待解決。熒光探針檢查時(shí)，如具有非常相似的排放概況的Alexa Fluor 488，熒光，和SYTOX綠色，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于光譜重疊其激發(fā)型材比在他們的排放概況，這樣的前景顯得尤為重要。多光子技術(shù)也可能有用的分離選定的熒光團(tuán)的發(fā)射從藍(lán)色和綠色光譜區(qū)域的自體熒光。

實(shí)施可變帶通檢測(cè)和激光掃描共聚焦顯微鏡提供了更大的靈活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)*過(guò)傳統(tǒng)干涉濾光片微調(diào)的排放檢測(cè)帶寬一般成像光譜歧視的*新進(jìn)展。在許多情況下，成功地分離的熒光發(fā)射阻礙了一個(gè)事實(shí)，即所選擇的熒光基團(tuán)的*佳濾波器的儀器沒(méi)有配備。上面所討論的每一個(gè)光譜成像配置提供了能夠自由地配置，這使研究者設(shè)計(jì)定制的帶通設(shè)置幾乎任何熒光的檢測(cè)波長(zhǎng)范圍。例如，使用的尼康C1si的或A1共聚焦儀，V型過(guò)濾軟件選項(xiàng)能夠分箱四個(gè)所選通道從一個(gè)或多個(gè)所需的發(fā)射波長(zhǎng)范圍（參見(jiàn)圖10），以生成圖像。這是可以做到，無(wú)論數(shù)據(jù)是否被*終目的地進(jìn)行線(xiàn)性分解分析。因此，現(xiàn)代的共聚焦顯微鏡成像光譜提供了一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)，為消除熒光光譜重疊在常規(guī)成像場(chǎng)景，還提供能力，可以輕松地創(chuàng)建自定義發(fā)射帶通配置他們開(kāi)發(fā)新的熒光探針。

光譜圖像處理

典型的lambda棧從廣角或激光掃描共聚焦顯微鏡收購(gòu)?fù)ǔ０瑤资f(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)人光譜（取決于圖像尺寸），集合中的每個(gè)像素之一。由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集是非常大的，因此太復(fù)雜，直觀地解釋。一套全面的軟件工具是必需的光譜圖像數(shù)據(jù)的處理和顯示，這方面的需求已經(jīng)解決了一些算法已發(fā)表 的文獻(xiàn)。此外，所有市售共聚焦顯微鏡成像光譜伴隨著*的專(zhuān)有軟件包專(zhuān)門(mén)使用儀器采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和演示。光譜圖像的分析，可以執(zhí)行基于光譜特征或存在于數(shù)據(jù)集的圖像特征（有時(shí)兩個(gè)），但大多數(shù)數(shù)學(xué)方法涉及被統(tǒng)稱(chēng)為線(xiàn)性分解或線(xiàn)性分解算法。的lambda棧軟件分析可以應(yīng)用于熒光探針的任意組合，但圖像堆棧組成的吸收染料或反射光的光譜特征，必須被轉(zhuǎn)換成光密度值，然后再應(yīng)用線(xiàn)性分解算法。

原來(lái)的光譜圖像分析算法設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的主要目的是為了分配單獨(dú)簽名衛(wèi)星圖像中捕獲的對(duì)象。*有用的圖像分析這一類(lèi)的數(shù)學(xué)方法被稱(chēng)為主成分分析（PCA），監(jiān)督分類(lèi)分析（SCA），多元曲線(xiàn)分辨（MCR），線(xiàn)性分解（LU）。這些算法是基于這樣的假設(shè)，所測(cè)量的信號(hào)從每一個(gè)波長(zhǎng)（或顏色）的線(xiàn)性正比于該波長(zhǎng)的試樣的百分比或濃度。這種假設(shè)通常是正確的，當(dāng)吸收染料或熒光探針的濃度低，但結(jié)果明顯偏離線(xiàn)性的濃度達(dá)到飽和水平。在這種情況下，修正項(xiàng)必須被應(yīng)用。要明確注意的另一個(gè)重要的一點(diǎn)是，每個(gè)熒光團(tuán)或吸收染料具有**的光譜特征，可獨(dú)立確定用于在分配適當(dāng)?shù)呢暙I(xiàn)從該探針或染料在lambda堆棧中的個(gè)別像素作為參考。收集準(zhǔn)確的參考光譜是任務(wù)關(guān)鍵的一步，應(yīng)仔細(xì)進(jìn)行光譜圖像分析開(kāi)始之前。

在一個(gè)典型的基于熒光的光譜成像實(shí)驗(yàn)，通常有幾種熒光團(tuán)存在于試樣中，每一個(gè)標(biāo)簽不同的結(jié)構(gòu)。整個(gè)在此試樣中的圖像，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或作為混合物根據(jù)其空間的分布范圍內(nèi)的物鏡的細(xì)胞器或大分子的熒光團(tuán)。線(xiàn)性分解分析的目的是從每個(gè)熒光基團(tuán)的每一個(gè)像素的圖像，以確定的相對(duì)貢獻(xiàn)。在大多數(shù)情況下，該算法的正確使用，需要個(gè)別單獨(dú)制備的對(duì)照樣品，可用于所有的實(shí)驗(yàn)中所用的熒光團(tuán)的發(fā)射光譜中的記錄。對(duì)照樣品的試驗(yàn)片（如安裝介質(zhì)和細(xì)胞類(lèi)型）使用相同的技術(shù)制備的，并必須被記錄，可使用相同的儀器設(shè)置（增益，濾波器，物鏡，激光功率等），所分析的試樣。保持嚴(yán)格控制編制樣本和記錄參考光譜的重要性不能被夸大。

線(xiàn)性分解的lambda棧的另一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是，所有的熒光基團(tuán)分離的光譜必須是互相區(qū)分，它們也必須是線(xiàn)性無(wú)關(guān)的，使得沒(méi)有其他的線(xiàn)性組合，可以生產(chǎn)從光譜。這個(gè)假設(shè)是不平凡的，由于線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)有可能會(huì)受到未知的或無(wú)意的相互作用，如熒光團(tuán)之間的合作，本地化，淬火，和環(huán)境波動(dòng)的能量轉(zhuǎn)移（FRET）的事實(shí)。考慮在這種情況下，一個(gè)工件，熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體熒光團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度的降低伴隨著它的頻譜稍有變化，隨著發(fā)光強(qiáng)度增加和潛在的受體熒光光譜蝕變可導(dǎo)致。然而，在任何情況下，熒光共振能量轉(zhuǎn)移的影響通常是非常小的，但應(yīng)考慮成像時(shí)，有可能接受FRET的熒光探針相互作用。作為一個(gè)一般的經(jīng)驗(yàn)法則，線(xiàn)性分解軟件執(zhí)行時(shí)*好使用標(biāo)本表現(xiàn)出了很高的正在審議的所有熒光信號(hào)信噪比。

相關(guān)線(xiàn)性分解計(jì)算的基本概念是相對(duì)簡(jiǎn)單的。光譜圖像中的每個(gè)像素被歸類(lèi)為代表的混合物中的熒光基團(tuán)信號(hào)（強(qiáng)度）的測(cè)量光譜（I（λ） ）時(shí)，可以去卷積成的比例，重量或濃度（C）的每個(gè)單獨(dú)的熒光基團(tuán)的參考光譜（? （λ） ），當(dāng)值的總和。因此，每一個(gè)純粹的熒光基團(tuán)的參考光譜描述作為R_i(λ)，其中i = 1,2,3 ..... n表示的熒光基團(tuán)（C_i）的索引。對(duì)于一個(gè)特定的熒光基團(tuán)的數(shù)目（n）的，這種關(guān)系可以表示為： 

I(λ) = C₁?R₁(λ) + C₂?R₂(λ) + C₃?R₃(λ) + ........ + C_n?R_n(λ)

或者更簡(jiǎn)單的：

I(λ) = ∑_i C_i?R_i(λ)

在實(shí)踐中，被確定為（I）的光譜圖像中的每個(gè)像素的信號(hào)強(qiáng)度，并記錄，可在采集過(guò)程中的已知的熒光基團(tuán)的lambda棧和參考光譜的獨(dú)立測(cè)量中只有一個(gè)單一的使用相同的樣品的熒光基團(tuán)標(biāo)記的單獨(dú)的控制標(biāo)本制備技術(shù)和儀器設(shè)置。從試樣中的各種熒光團(tuán)的總光譜貢獻(xiàn)可以被確定為一個(gè)簡(jiǎn)單的線(xiàn)性代數(shù)矩陣行使的每個(gè)點(diǎn)，在上述公式中所描述的測(cè)量光譜，通過(guò)計(jì)算各自的貢獻(xiàn)。對(duì)于許多市售的線(xiàn)性分解的軟件產(chǎn)品的，將溶液通過(guò)以下方式獲得輸入?yún)⒖脊庾V和通過(guò)使用逆*小二乘法擬合的方法，*大限度地減少測(cè)量之間的平方差和計(jì)算的光譜。

為了確保*好的機(jī)會(huì)獲得成功的結(jié)果，應(yīng)用線(xiàn)性分解算法時(shí)，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)條件必須得到滿(mǎn)足。其中一個(gè)*重要的考慮是，以確保光譜檢測(cè)信道的數(shù)目是至少等于標(biāo)本中存在的熒光團(tuán)的數(shù)目。如果以滿(mǎn)足本說(shuō)明書(shū)中，可能會(huì)導(dǎo)致多個(gè)解決方案來(lái)計(jì)算光譜分離的和**的結(jié)果可能無(wú)法。線(xiàn)性分解的另一個(gè)關(guān)鍵要求是，所有標(biāo)本中存在的熒光團(tuán)必須在計(jì)算中考慮或結(jié)果可能會(huì)偏向占主導(dǎo)地位（*濃）熒光不太集中的物種的費(fèi)用。具有諷刺意味的是，不會(huì)影響包括在計(jì)算不匹配任何在lambda棧熒光光譜線(xiàn)性分解結(jié)果（零貢獻(xiàn)，將被分配到缺少的熒光）。*后，自體熒光和/或高背景水平也應(yīng)該被定義光譜（如果可能的話(huà)），并用作為一個(gè)額外的熒光基團(tuán)，以達(dá)到*佳的結(jié)果。可選地，也可以計(jì)算的誤差項(xiàng)和輸出作為一個(gè)錯(cuò)誤的殘差圖像。

加入熒光基團(tuán)光譜的線(xiàn)性在圖11中示出了兩種不同的混合物，但高度假設(shè)的熒光基團(tuán)，具有發(fā)射*大值居住在橙黃色（熒光基團(tuán)1）和橙紅色（熒光團(tuán)2）光譜區(qū)域重疊。在圖11中的黑色曲線(xiàn)（a）至圖11（c）表示的求和的兩個(gè)熒光基團(tuán)在不同濃度的光譜：圖11（a）一個(gè)為1;圖11（b）0.5?1，以及圖11（三）為1?0.5。雖然在圖11中的光譜給出代表只有3個(gè)熒光基團(tuán)的組合的例子，可以很容易地進(jìn)行預(yù)測(cè)的總和的頻譜為每一種可能的組合，這兩個(gè)熒光基團(tuán)僅僅通過(guò)增加強(qiáng)度作為濃度的函數(shù)。需要注意的是峰的總和的光譜的變化的比例的成分的熒光基團(tuán)，例如，*大為594毫微米，在圖11（a）中在圖11（b）中的598納米，589納米（三）在圖11中。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是線(xiàn)性分解利用整個(gè)光譜曲線(xiàn)（次），不只是峰值位置。**的算法，如那些用于光譜核型分析和共聚焦顯微鏡，還可以處理復(fù)雜的曲線(xiàn)分析和糾正分鐘的光譜移動(dòng)。

兩個(gè)熒光基團(tuán)，類(lèi)似于在圖11中的標(biāo)記的檢體分析的頻譜內(nèi)容時(shí)，*簡(jiǎn)單的方法是從任何特定的像素之和與所有可能的組合，居住在光譜的參考圖書(shū)館的總和的頻譜相匹配。作為一個(gè)例子，如果測(cè)得的求和頻譜的黑色曲線(xiàn)，在圖11（a）是一個(gè)非常接近的比賽，它表示的像素包含從各熒光團(tuán)50％的貢獻(xiàn)，它們均勻混合，在檢體（至少在該象素）。同樣，如果在圖11（b）的總和的頻譜相匹配的黑色曲線(xiàn)，可以假定，該像素包含66％的熒光基團(tuán)和33％的熒光基團(tuán)1。因此，它可以被歸納，通過(guò)比較代表的總和的測(cè)量光譜與參考圖像中的預(yù)測(cè)的光譜庫(kù)軟件應(yīng)用的*佳擬合參數(shù)的矩陣的線(xiàn)性分解操作。一旦已經(jīng)確定時(shí)，每個(gè)熒光的光譜貢獻(xiàn)的lambda?？梢员环指舫蓡蝹€(gè)圖像的每個(gè)熒光基團(tuán)，如在圖12中示出。

圖12（a）和12（b）是一對(duì)的光譜混合和未混合的圖像，分別貼壁培養(yǎng)的數(shù)生長(zhǎng)期印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞，它們被固定在聚甲醛和標(biāo)有：綠色SYTOX（細(xì)胞核）的Alexa Fluor 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（絲狀肌動(dòng)蛋白）的Alexa Fluor 514標(biāo)記的山羊二次抗體針對(duì)兔小學(xué)PMP-70抗體，過(guò)氧化物酶體膜蛋白（過(guò)氧化物酶）。一個(gè)尼康C1si的共聚焦顯微鏡使用了2.5毫米衍射光柵耦合激發(fā)使用488納米氬離子激光器（圖12（a））470至550納米的波長(zhǎng)范圍內(nèi)使用收集排放。拉姆達(dá)堆疊的線(xiàn)性未混合和pseudocolored的，（細(xì)胞核，紅色），（肌動(dòng)蛋白，藍(lán)色），過(guò)氧化物酶體（綠色），以產(chǎn)生*終的圖像，如圖12（b）中所示。在圖12（c）和圖12（d）所示的明場(chǎng)圖像獲取使用一個(gè)固定的人肝組織標(biāo)本與曙紅和蘇木精染色。一個(gè)尼康80I顯微鏡配備一個(gè)量子色動(dòng)力學(xué)（古奇和HOUSEGO的）恒指高光譜成像探測(cè)器和安道爾IXON EMCCD用來(lái)捕捉一個(gè)明場(chǎng)圖像的混合試樣（圖12（c）條）。線(xiàn)性分解后，更清楚地辨別兩種染料標(biāo)記的檢體的特定區(qū)域（圖圖12（d）），通過(guò)將假色。

雖然光譜成像和線(xiàn)性分解成為一個(gè)重要的工具，用于分析復(fù)雜的混合物頻譜重疊的激光掃描共聚焦顯微鏡的熒光探針，這種技術(shù)也越來(lái)越多地被應(yīng)用到病理組織和細(xì)胞吸收染料染色標(biāo)本上進(jìn)行的測(cè)量和成像使用傳統(tǒng)明視場(chǎng)顯微鏡。為了吸收染料進(jìn)行線(xiàn)性分解分析，可以使用類(lèi)似的算法已被過(guò)濾后的數(shù)據(jù)以補(bǔ)償因素，適用于吸收而不是發(fā)射光譜。在熒光測(cè)量相比，明場(chǎng)分析技術(shù)要求的吸收收集的數(shù)據(jù)對(duì)每一個(gè)像素的光譜的光源光透過(guò)樣品的檔案必須分開(kāi)。透射光照明效果，必須測(cè)量作為一個(gè)額外的參考。合成染料的吸收光譜是線(xiàn)性依賴(lài)于濃度（比爾 - 朗伯定律所決定的）。在數(shù)學(xué)上，吸收染料的線(xiàn)性的不混溶的計(jì)算是使用熒光探針的那些相似，并可以由下面的公式表示： 

A(λ) = ∑_i ε_i(λ) ? C_i ? L_i

比爾-朗伯方程所決定的，甲染料物種的吸光度（一） ， C 是濃度，以及L是試樣的光程長(zhǎng)，這通常是在微米染色的組織內(nèi)的測(cè)量。執(zhí)行計(jì)算之前，必須測(cè)定的光密度，為每個(gè)傳輸?shù)臏y(cè)量值的吸收的植物種。應(yīng)當(dāng)指出的光密度轉(zhuǎn)換的發(fā)送數(shù)據(jù)中的引入顯著的噪聲電平可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)電平低時(shí)，為特定的吸光物質(zhì)，因而復(fù)雜的解混結(jié)果。在這種情況下，*好是進(jìn)行頻譜分析通過(guò)僅包括峰值附近的吸收區(qū)域。類(lèi)似的線(xiàn)性分解熒光探針的情況下，為每個(gè)污垢在試樣中的濃度可以在圖像中的每個(gè)像素進(jìn)行計(jì)算，如果合適的參考吸收光譜已被被獨(dú)立地確定。

熒光模式進(jìn)行比較明場(chǎng)吸 收染料光譜成像，吸收染料標(biāo)本通常不隨時(shí)間而褪色，而檢查熒光標(biāo)本非常行為可導(dǎo)致漂白。吸收染料染色的標(biāo)本通常具有小于2.0的光密度（OD）為單位的動(dòng)態(tài)范圍為0.05 ，0.05 OD是很難區(qū)分背景，對(duì)應(yīng)于約1％的透光性，這是相對(duì)較暗的2.0光密度單位。吸收?qǐng)D像也聚光鏡數(shù)值孔徑光闌由于眩光分配錯(cuò)誤，如果沒(méi)有正確調(diào)整。此外，吸收染料成像還需要整個(gè)成像系統(tǒng)的透徹理解。例如，如果由一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的鎢鹵燈發(fā)出的近紅外光（熱）沒(méi)有被阻塞（實(shí)際上，波長(zhǎng)大于720納米），可以檢測(cè)由CCD攝像系統(tǒng)，并添加到作為噪聲的強(qiáng)度計(jì)數(shù)。在理想的情況下，一個(gè)寬的帶通濾波器以除去不需要的波長(zhǎng)的光路應(yīng)包括在紫外線(xiàn)和近紅外線(xiàn)的阻斷。進(jìn)一步吸收染料成像范圍內(nèi)的一個(gè)事實(shí)，即*大曝光時(shí)間必須小于飽和所需的檢測(cè)器。與此相反，熒光曝光時(shí)間通常是有限由檢測(cè)器的熱噪聲。

光譜成像應(yīng)用

光譜成像提供了必要的基礎(chǔ)和工具，以調(diào)查在各種各樣的應(yīng)用，包括活細(xì)胞成像，核型分析，常規(guī)熒光成像，藥物研發(fā)，檢測(cè)分子間的相互作用，組織病理現(xiàn)象。分子正在調(diào)查收集部分或完整的光譜信息的能力使混合熒光和吸收染料的檢測(cè)和鑒別，即使在探頭的情況下，表現(xiàn)出類(lèi)似的顏色和高度重疊的光譜剖面。這種**的技術(shù)允許調(diào)查標(biāo)記多種細(xì)胞和組織的物鏡，保證通過(guò)出血和明顯的合作定位不會(huì)干擾在圖像分析。此外，加上線(xiàn)性分解光譜成像所提供的信息可用于區(qū)分合法信號(hào)和工件產(chǎn)生的固色劑，轉(zhuǎn)染試劑，安裝中折射率波動(dòng)。光譜成像也成為消除自發(fā)熒光和監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)分子間的相互作用所產(chǎn)生的共振能量轉(zhuǎn)移的一種重要方法。

光譜核型分析，熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，光譜成像*流行 的應(yīng)用之一，已經(jīng)看到了廣泛的接受。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，使用多達(dá)五種不同的熒光團(tuán)來(lái)標(biāo)記每個(gè)的24人染色體，該技術(shù)也可以適用于來(lái)自其他物種的染色體。每個(gè)染色體被標(biāo)記為不同的熒光基團(tuán)的組合，如Cy5標(biāo)記，F(xiàn)ITC，若丹明，的Alexa Fluor染料，或者任何的ATTO染料的。組合標(biāo)記結(jié)果在2 ^N - 1種可能的組合。因此，使用庫(kù)存總量只有5個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生31個(gè)可能的染料組合，可以很容易地辨別與分析軟件（參見(jiàn)圖13（a））。在分析過(guò)程中，圖像掃描波長(zhǎng)，分割的空間分布，則每個(gè)像素的分類(lèi)的基礎(chǔ)上的五個(gè)熒光光譜和每個(gè)染色體的公知的熒光基團(tuán)的組合的表的參考圖書(shū)館。分類(lèi)分析的結(jié)果，一般在將顯示在單獨(dú)的顏色，每個(gè)顏色表示不同的染色體上（如圖圖13（b）中示出）。所獲取的光譜數(shù)據(jù)的高特異性，使一個(gè)成功的分類(lèi)在大多數(shù)染色體制劑，即使在使用復(fù)雜的組織切片。通過(guò)增加第六染料偶聯(lián)物探針針對(duì)特定地區(qū)，或所有染色體短臂探針，獲得額外的信息可以自動(dòng)核型分析。在實(shí)踐中，往往是結(jié)合光譜核型分析用DAPI綁扎。

中遇到的復(fù)雜的信號(hào)FRET顯微鏡由過(guò)量的所要求的熒光基團(tuán)，以便進(jìn)行共振能量轉(zhuǎn)移光譜重疊所混淆。因此，在除了分開(kāi)多色固定和活細(xì)胞中的熒光光譜的光譜成像的能力，該技術(shù)是*適合解開(kāi)供體和受體熒光團(tuán)的發(fā)射的貢獻(xiàn)FRET成像。FRET分析由于其高圖像捕獲率，這往往是必要的，當(dāng)調(diào)查毫秒級(jí)的時(shí)間尺度上進(jìn)行操作的熒光蛋白的生物傳感器，特別適合用于現(xiàn)代高性能共聚焦顯微鏡，配備多陽(yáng)極探測(cè)器。32通道多陽(yáng)極探測(cè)器，光譜成像的共聚焦顯微鏡，可以獲取整個(gè)光譜響應(yīng)來(lái)自FRET熒光團(tuán)在單次掃描。不過(guò)，即使光譜成像是能夠同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射信號(hào)的FRET，該技術(shù)是不能區(qū)分通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的受體發(fā)射信號(hào)來(lái)源于直接激發(fā)。因此，適當(dāng)控制使用供體和受體蛋白分別表示有必要進(jìn)行定量分析。在光譜成像是用來(lái)評(píng)估FRET熒光蛋白表達(dá)的生物傳感器作為一個(gè)單一的多肽的情況下，控制是不那么重要。

其中*關(guān)鍵的工件，導(dǎo)致在活細(xì)胞成像信號(hào) - 噪聲的減少是自體熒光，來(lái)自若干來(lái)源，包括自然熒光的生物分子（如NADH，核黃素，和彈性），DNA轉(zhuǎn)染試劑，文化傳媒，和外源性藥物（藥物和生化）的成像介質(zhì)。成像時(shí)，細(xì)胞和組織已準(zhǔn)備與多聚甲醛固色劑誘導(dǎo)的自體熒光也特別問(wèn)題，神器可以干擾全身顯像在特定的組織（大腦和皮膚）。此外，植物組織在整個(gè)可見(jiàn)光譜區(qū)域，趨于表現(xiàn)出高度的內(nèi)在的自體熒光。光譜成像的***的應(yīng)用程序之一是消除自發(fā)熒光標(biāo)記標(biāo)本弱發(fā)射熒光團(tuán)或那些稀疏定位的。在大多數(shù)情況下，自發(fā)熒光可以作為一個(gè)單獨(dú)的熒光基團(tuán)具有不同的光譜輪廓（在對(duì)照樣品中*容易地確定），可以從感興趣的信號(hào)，未混合的處理，因此可以減少或完全消除從*終的圖像（參見(jiàn)圖13 （c）和13條（d））。重要的是要注意減少自發(fā)熒光的水平在更長(zhǎng)的波長(zhǎng)在活細(xì)胞成像，所以慎重選擇發(fā)射的橙色和紅色區(qū)域的熒光團(tuán)可以幫助減少這種神器。

多吸收染料染色的標(biāo)本進(jìn)行病理檢查，在光照下成像光譜成像和廣角鏡線(xiàn)性分解*的候選人。許多常見(jiàn)的合成吸收污漬和染料用于染色細(xì)胞涂片和組織切片具有復(fù)雜的光譜重疊，具有顯著的水平。然而，在明場(chǎng)成像的信號(hào)通常是強(qiáng)，漂白是*小的或不存在的。光譜成像可以使用標(biāo)有幾種染料產(chǎn)生單獨(dú)的圖像，目前標(biāo)本只有一個(gè)單一的染料染色時(shí)會(huì)出現(xiàn)與明標(biāo)本。然后，可以進(jìn)行后處理，以確定于特定結(jié)構(gòu)的染料的共定位。光譜成像的明標(biāo)本中遇到的*嚴(yán)重的文物發(fā)生，當(dāng)成像染料，含有沉淀物，而不是吸收散射光或時(shí)細(xì)胞和組織overstained的。

光譜成像的實(shí)踐意義

光譜成像技術(shù)和線(xiàn)性分解實(shí)驗(yàn)協(xié)議的情況下，優(yōu)化利用儀器的功能和軟件參數(shù)，確保不會(huì)無(wú)意中介紹危及文物的潛力，取得優(yōu)異的成績(jī)。總之，大多數(shù)光譜成像實(shí)驗(yàn)的成敗往往取決于研究者的控制下的變量。*重要的方面是（關(guān)鍵任務(wù)），以獲得準(zhǔn)確的參考光譜控制熒光樣品，忠實(shí)地代表真正的光譜。此外，必須采取非常謹(jǐn)慎，以確?？刂坪蜏y(cè)試試樣相同的條件下制備熒光濃度方面，文化傳媒，固色劑，洗緩沖區(qū)，安裝媒體，光學(xué)質(zhì)量的玻璃載玻片和蓋玻片。儀器參數(shù)也應(yīng)該是相同的控制，并根據(jù)調(diào)查的樣本。這些措施包括使用相同的物鏡，浸油，激光電源，光電倍增管的設(shè)置，針孔的直徑，二色鏡，波長(zhǎng)掃描范圍，像素停留時(shí)間。在理想條件下，其中的熒光基團(tuán)的空間分布的許可證，可以獲取參考圖像中的試驗(yàn)片的非重疊區(qū)域。

即使*的線(xiàn)性分解算法能夠解決光譜的熒光基團(tuán)，具有一個(gè)顯著的重疊程度，在大多數(shù)軟件產(chǎn)品的能力區(qū)分具有幾乎疊加的光譜的熒光基團(tuán)的限制。這種現(xiàn)象是一種罕見(jiàn)的發(fā)生，通常僅見(jiàn)于密切相關(guān)的熒光蛋白質(zhì)和合成色素衍生物。例如，氧雜蒽衍生物的Alexa Fluor 488和熒光素都具有類(lèi)似取代基的主要區(qū)別在于，前者是磺化的，以增加溶解度。這兩個(gè)熒光基團(tuán)的譜峰是僅由一個(gè)單一的納米分離的排放曲線(xiàn)幾乎是完全重疊。因此，它是無(wú)法區(qū)分的Alexa Fluor 488和熒光光譜成像和線(xiàn)性分解。但是，請(qǐng)記住，這是一個(gè)不尋常的情況下，用于標(biāo)記細(xì)胞和組織的*常見(jiàn)的熒光基團(tuán)，可以很容易地使用這個(gè)**的技術(shù)解決。

盡可能接近匹配的熒光濃度和/或控制和測(cè)試標(biāo)本的熒光蛋白的表達(dá)水平，將有助于確保令人滿(mǎn)意的結(jié)果光譜成像。在一般情況下，研究者應(yīng)努力盡可能達(dá)到*高的信號(hào)噪聲水平。由于光譜成像儀器的各個(gè)通道上的范圍從約2到10納米的帶寬，儀器的靈敏度總是有限的能寄存器，每個(gè)波長(zhǎng)帶中的檢測(cè)器的光子的數(shù)量。因此，可接受的光譜分辨率為5納米或以下的熒光團(tuán)分離時(shí)，才有可能使用明亮的熒光標(biāo)記標(biāo)本。不幸的是，在非常高的分辨率（5納米以下），典型的生物標(biāo)本往往表現(xiàn)出標(biāo)有熒光基團(tuán)，是非常暗淡或有稀疏定位時(shí)的噪聲信號(hào)和圖像質(zhì)量不佳。因此，*佳的線(xiàn)性分解的結(jié)果，得到時(shí)，檢測(cè)信道的寬度盡可能大。

在其他光譜成像實(shí)驗(yàn)關(guān)注的背景水平高，過(guò)多的探測(cè)器和光學(xué)系統(tǒng)的噪聲，以及自發(fā)熒光。高背景發(fā)生不正確的有針對(duì)性的熒光團(tuán)，overstaining，激光線(xiàn)的噪音，安裝媒體的不均勻性，浸油不匹配，雜散光，以及自發(fā)熒光。在大多數(shù)情況下，背景水平相減技術(shù)，可減少使用后的頻譜數(shù)據(jù)收集。檢測(cè)器和光噪聲成為問(wèn)題的成像時(shí)，弱熒光探針，但通?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)信道的數(shù)量減少和更大帶寬的掃描有效地消除。自體熒光是*好的處理，包括它作為一個(gè)單獨(dú)的熒光通道線(xiàn)性分解過(guò)程中有一個(gè)**的光譜剖面。總之，仔細(xì)注意儀器配置的詳細(xì)信息，樣品制備技術(shù)，以及選擇*佳熒光光譜成像實(shí)驗(yàn)的成功結(jié)果的關(guān)鍵。