徠卡顯微鏡：選擇你的激發(fā)波長(zhǎng)
熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM）被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用量化測(cè)量FRET（福斯特共振能量轉(zhuǎn)移）發(fā)生的兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的間隔由幾納米。FLIM也被用來(lái)在大陣列的應(yīng)用范圍從組織成像熒光探測(cè)環(huán)境。雖然時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）熒光壽命定量方法的選擇，它要求包括：i）一個(gè)脈沖激光源，2）光子計(jì)數(shù)卡，及iii）一個(gè)快速檢測(cè)的專用儀器。這種技術(shù)要求呈現(xiàn)TCSPC收購(gòu)很難執(zhí)行和/或縮小選擇可用熒光。
徠卡TCS SP5 X克服了這些限制，因?yàn)樗Y(jié)合了脈沖白光激光（WLL）的*快光電倍增管（PMT），允許可調(diào)光譜檢測(cè)。該系統(tǒng)是高度靈活的和用戶友好的FLIM的實(shí)驗(yàn)。在本文中，我們說(shuō)明了它的潛力，兩個(gè)生物應(yīng)用：交互研究和自發(fā)熒光多光譜成像。
技術(shù)說(shuō)明
20世紀(jì)90年代中后期以來(lái)的首份報(bào)告的光子晶體光纖產(chǎn)生*備受關(guān)注。它允許相干白光生產(chǎn)抽高非線性光子晶體光纖的*短激光脈沖（或皮秒）。由于其廣泛的光譜，這個(gè)源常用的光譜和它*近還實(shí)施商業(yè)顯微鏡系統(tǒng)：徠卡TCS SP5 X.
配備了一個(gè)聲光光束分束器（AOBS），這個(gè)系統(tǒng)提供了一個(gè)很容易調(diào)諧范圍為470至670nm的脈沖激光光源，允許在其*大吸收激發(fā)的熒光基團(tuán)的大面板。為了確定，WLL是否是一個(gè)合適的來(lái)源FLIM的實(shí)驗(yàn)，我們運(yùn)行校準(zhǔn)基于雙光子FLIM的測(cè)量驗(yàn)證協(xié)議。值得注意的是，我們測(cè)量系統(tǒng)的儀器響應(yīng)函數(shù)，得到的半峰全寬為約300 ps的，**兼容細(xì)胞和組織中的熒光壽命測(cè)量的。然后，我們測(cè)試的能力FLIM的應(yīng)用兩大領(lǐng)域：我）相互作用的研究FRET及ii）組織的自體熒光成像。要解決這兩種情況下，我們采用了以下的實(shí)驗(yàn)條件：
使用徠卡TCS SP5 X焦和內(nèi)部PMT進(jìn)行終身收購(gòu)。光子計(jì)數(shù)使用的貝克爾和Hickl的SPC830卡和SPCImage的生命周期分析是用于執(zhí)行。
兩個(gè)激勵(lì)源用于FRET測(cè)量：卡默萊昂ULTRA2鈦寶石激光在920納米（8分子量：客觀回到瞳），在488 nm和WLL。檢測(cè)通之間設(shè)置500和540 nm和300秒的采集時(shí)間。
對(duì)于convalaria截面成像，我們還使用了兩種不同的激發(fā)源：405脈沖激光二極管和WLL。激發(fā)和檢測(cè)通報(bào)告中的第三個(gè)數(shù)字。采集時(shí)間設(shè)置為60秒每幅圖像。
圖 1A：非線性光子晶體光纖橫截面
圖 1B：白光光譜Leica TCS SP5中的X（AU）上測(cè)得470和670納米之間。
多功能性FLIM-FRET實(shí)驗(yàn)
Leica TCS SP5中的十列出一個(gè)脈沖的WLL和*快探測(cè)器光譜選擇。我們開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)，還配備了一個(gè)光子計(jì)數(shù)卡（SPC830，貝克爾和Hickl等）和鈦：薩激光（變色龍ULTRA II），一個(gè)國(guó)家的**的源TCSPC實(shí)驗(yàn)。FLIM的特別適用于可視化和測(cè)量FRET發(fā)生在納米尺度的組織或細(xì)胞之間的相互作用的蛋白質(zhì)。因此，為了驗(yàn)證作為源FLIM的WLL，我們進(jìn)行的TCSPC實(shí)驗(yàn)正面和負(fù)面的FRET引用交替使用Ti：Sa和WLL作為激勵(lì)激光源在同一細(xì)胞。正如圖2中所示，兩個(gè)激勵(lì)源提供一致的結(jié)果，并允許定量的熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)量。WLL可以被用來(lái)作為一個(gè)多功能的源FLIM的FRET實(shí)驗(yàn)。此外，在TCSPC模式的壽命精度直接依賴于獲取的光子的數(shù)量。在使用本系統(tǒng)時(shí)，我們可以優(yōu)化收集光子的數(shù)目由i）優(yōu)化激發(fā)波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)的*大吸收和ii）選擇了理想的檢測(cè)范圍內(nèi)沒(méi)有，受體熒光bleedthrough的*大供體發(fā)射。
圖 2：既負(fù)（MB-EGFP）和陽(yáng)性（MB-EGFP-mCherry）FRET參考使用WLL或鈦：薩激光熒光壽命成像。使用40倍，1.25 NA油浸目標(biāo)進(jìn)行收購(gòu)。比例尺：40微米。
多光譜壽命成像顯微鏡（MSLIM）
結(jié)合的AOBS和光譜使用內(nèi)部的PMT的選擇，該系統(tǒng)允許同時(shí)就激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)選擇的通用性高。如前所示，相關(guān)的光譜和壽命測(cè)量（纖細(xì)）是一種很有前途的技術(shù)和**的歧視多標(biāo)記的樣品和檢測(cè)分子間的相互作用內(nèi)部異質(zhì)性和自體熒光媒體，如組織。一個(gè)WLL的使用進(jìn)一步擴(kuò)展的可能性的研究復(fù)雜的熒光信號(hào)。事實(shí)上，人們現(xiàn)在可以執(zhí)行多光譜的壽命成像的顯微鏡（MSLIM）通過(guò)調(diào)整兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)（WLL，通過(guò)AOBS）和觀察范圍（移動(dòng)的狹縫前面的內(nèi)部PMT）。在這里，我們提出了一個(gè)例子自發(fā)熒光MSLIM使用固定convalaria幻燈片。
圖 3：連續(xù)熒光壽命成像的convalaria橫截面采用各種激勵(lì)（灰色條）和觀察（虛線框）波長(zhǎng)窗口。勵(lì)磁實(shí)現(xiàn)使用的WLL，除了在405 nm的激發(fā)，這是通過(guò)使用脈沖激光二極管。使用了10倍，NA 0.3干目標(biāo)進(jìn)行收購(gòu)。比例尺：500微米。