尼康顯微鏡：熒光蛋白的成像參數(shù)
**發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白及衍生工具的廣泛用途相當(dāng)廣泛，并已成功地應(yīng)用在幾乎每一個(gè)生物學(xué)科從微生物系統(tǒng)生理學(xué)。這些**的探頭已經(jīng)證明是非常有用的記者在培養(yǎng)細(xì)胞和整個(gè)動(dòng)物的基因表達(dá)研究。熒光蛋白在活細(xì)胞中，*常用的跟蹤本地化和動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)，細(xì)胞器，和其他細(xì)胞區(qū)室，以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸示蹤劑。很容易地完成了多種技術(shù)，其中包括尼康顯微鏡，寬視場(chǎng)，共聚焦和多光子顯微鏡，熒光蛋白的定量成像曝光細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，提供了一個(gè)**的窗口。
復(fù)雜的熒光蛋白的光譜和物理性能影響任何定量測(cè)量的準(zhǔn)確性和效用。許多這些性質(zhì)，如摩爾消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，光漂白率，光譜公司的pH值的依賴，可以很容易地用純化的蛋白在體外測(cè)量。然而，其他重要的和實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵特性，包括發(fā)色團(tuán)的形成（成熟）和蛋白質(zhì)在體內(nèi)的降解率的時(shí)間過(guò)程，更難以確定。對(duì)于典型的實(shí)驗(yàn)中，*亮，*穩(wěn)定的單體熒光蛋白衍生物應(yīng)選擇，以減少施加復(fù)雜背景，在要求較低的應(yīng)用中光漂白校正的必要性。
在選擇成像實(shí)驗(yàn)中，水母和珊瑚市售的增強(qiáng)型變種，以及它們的衍生物的熒光蛋白載體，應(yīng)當(dāng)認(rèn)真考慮。這些是與青色（ECFP），綠色（EGFP），和黃色（EYFP）光譜區(qū)域，現(xiàn)在已經(jīng)被引入的新的單體的紅色發(fā)光熒光蛋白的熒光公司提供。如圖1中所示，獲得的圖像可以選擇使用各種市售熒光蛋白融合載體幾個(gè)不同的亞細(xì)胞位置。圖1中所示的探針的熒光發(fā)射光譜覆蓋的帶寬的幾乎180納米，具有極大值，范圍從440至618納米。這些探針是*亮，*穩(wěn)定的熒光蛋白的變體，并允許成像照明光漂白（下面討論）和光毒性的問(wèn)題，如在低光照水平，*大限度地減少。許多熒光蛋白變體（包括EGFP，ECFP和EYFP）可以在足夠高的濃度，可以干擾膜結(jié)構(gòu)的工件，或?qū)е虏徽_的假設(shè)，進(jìn)行定量*的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，如形成二聚體（FRET） 。
另外的本征亮度的熒光蛋白的基因工程中的表達(dá)水平是產(chǎn)生顯著明亮的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)從融合構(gòu)建另一個(gè)要考慮的因素。使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子的載體，以提高轉(zhuǎn)錄水平和適當(dāng)?shù)拿艽a子，以優(yōu)化翻譯的應(yīng)用是必不可少的，用于提高融合蛋白的表達(dá)水平，從而提高整體的信號(hào)電平。當(dāng)細(xì)胞的自體熒光，使得它難以區(qū)分背景熒光的熒光融合蛋白排放時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。
多種技術(shù)可以應(yīng)用到一種熒光蛋白融合產(chǎn)物的細(xì)胞中的表達(dá)水平和亮度增強(qiáng)。此外，丁酸鈉（大約1至5毫摩爾），向培養(yǎng)基中，將增加整體在穩(wěn)定的細(xì)胞系中表達(dá)的融合蛋白的基因的表達(dá)水平。此外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的使用是有吸引力的選擇，因?yàn)樗麄兘?jīng)常顯示穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表達(dá)水平高得多。應(yīng)該行使一定程度的謹(jǐn)慎，然而，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染由于可能過(guò)度表達(dá)的文物，包括蛋白質(zhì)聚集或飽和度蛋白靶向機(jī)械，導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)谋镜鼗?/span>*后，增加串聯(lián)熒光蛋白序列的數(shù)目（雙鍵或三）在克隆載體是一種替代方法，用于提高融合蛋白的亮度水平。
臨界熒光蛋白特性
大多數(shù)的市售熒光蛋白載體具有改進(jìn)的性能，由于優(yōu)化的密碼子使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的翻譯和位點(diǎn)定向誘變?cè)谳^高的溫度下，以提高效率的發(fā)色團(tuán)成熟。對(duì)于要求更高的成像應(yīng)用中，熒光蛋白的表達(dá)或物鏡豐度低，在探針的內(nèi)在屬性將可能是一個(gè)限制因素。因此，有必要充分了解熒光蛋白的固有特性，并運(yùn)用必要的控制，以*大限度地減少成像探針在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的文物。
光子引起的發(fā)色基團(tuán)破壞，這種現(xiàn)象稱為漂白，熒光蛋白通常是減少的速度和幅度相比，傳統(tǒng)的合成熒光，在類似的條件下，如熒光素和若丹明。這種漂白的阻力被認(rèn)為是排列緊密周圍的β -蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熒光蛋白生色團(tuán)的保護(hù)。無(wú)論如何，它仍然是重要的，嚴(yán)格執(zhí)行漂白定量成像實(shí)驗(yàn)的控制措施。
率的光漂白熒光蛋白可確定獲取隔時(shí)圖像的一系列標(biāo)記的對(duì)照細(xì)胞，然后通過(guò)定量測(cè)量，發(fā)射強(qiáng)度，它的表現(xiàn)通常是一個(gè)指數(shù)衰減逐漸喪失。光漂白的熒光損耗曲線（圖2中所示），然后，可以采用修正的成像實(shí)驗(yàn)。雖然不是一般意義上顯著的問(wèn)題，如果光漂白成為限制因素成像時(shí)的活細(xì)胞，抗淬滅劑如抗壞血酸，Trolox的，或Oxyrase（氧和自由基清除劑）可加入到培養(yǎng)基中。
漂白雖然往往是在熒光顯微鏡中的*終的限制因素，許多熒光蛋白衍生物的光漂白率是比較慢的（參見(jiàn)圖2）。另一個(gè)限制因素是熒光基團(tuán)的飽和度，這不會(huì)發(fā)生在寬視場(chǎng)顯微術(shù)，但可以是一個(gè)顯著的問(wèn)題，用激光掃描共聚焦激發(fā)強(qiáng)度足夠高，以達(dá)到飽和，有時(shí)工具。熒光飽和發(fā)生時(shí)，所有可用的分子都在不斷增加激發(fā)光處于興奮狀態(tài)，所以不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)增加熒光。在這種情況下，這是非常困難，校準(zhǔn)由于非線性，一個(gè)問(wèn)題，即只能通過(guò)降低激光輸入功率校正的熒光信號(hào)。
細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境條件，特別是pH值和高的局部濃度，其它一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子，可以改變熒光蛋白衍生物的亮度電平。例如，野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）顯示相對(duì)亮度均勻pH值為5至pH10，而增強(qiáng)型綠色和黃色熒光蛋白均在酸性pH值水平的驟冷，定位于細(xì)胞器（溶酶體）或降低其有效性亞細(xì)胞具有低pH值的內(nèi)飾。其他衍生工具，如ECFP和DsRedFP的是不太敏感的低pH值。然而，許多熒光蛋白融合的產(chǎn)品將被定位在生理pH條件下，這應(yīng)該不會(huì)嚴(yán)重影響熒光強(qiáng)度的區(qū)域附近的。
固有熒光蛋白，可能會(huì)顯著地改變定量成像（但不能準(zhǔn)確地在體外測(cè)定），發(fā)色團(tuán)的折疊動(dòng)力學(xué)，或導(dǎo)通時(shí)間之間的其他物理參數(shù)可以有*嚴(yán)重的后果。Aequorea victoria的水母（和大多數(shù)礁珊瑚）熒光蛋白的衍生物需要的氧化生色團(tuán)的形成，但氧氣不容易穿透致密的蛋白結(jié)構(gòu)，周圍的三肽熒光。因此，一個(gè)相當(dāng)大的延遲（通常*過(guò)幾個(gè)小時(shí)）之間可能出現(xiàn)的蛋白表達(dá)和熒光的外觀。不幸的是，它不是經(jīng)常容易區(qū)分，由于熒光蛋白表達(dá)（理想的測(cè)量），由于緩慢的發(fā)色基團(tuán)形成（一個(gè)工件）之間的延遲。相反的過(guò)程，成熟的熒光蛋白在體內(nèi)降解，也很難監(jiān)測(cè)，但壓倒性的證據(jù)表明，許多這些探頭都非常穩(wěn)定。
顯微鏡參數(shù)
寬視場(chǎng)，共聚焦和多光子熒光顯微鏡，無(wú)論是在直立或倒置配置的，是觀察熒光蛋白在活細(xì)胞和組織的理想工具。所需的照明源的范圍從含汞和氙弧放電燈的寬視場(chǎng)，在共聚焦和鎖模脈沖激光多光子顯微鏡（見(jiàn)表1）的氣體和半導(dǎo)體連續(xù)波激光器。綠色熒光蛋白及其變種很容易的汞燈或氬離子或氪氬氣體激光器發(fā)出的488納米線與明亮的藍(lán)色光譜線成像。此外，一臺(tái)主機(jī)的新的固態(tài)激光器的生產(chǎn)線的許多部分，包括在可見(jiàn)光譜的紫光和藍(lán)光區(qū)域，將被引入。熒光蛋白變體，具有轉(zhuǎn)移到藍(lán)色，紅色，和近紅外波長(zhǎng)的光譜通常以更高的效率，使用氙燈或金屬鹵化物燈，以及激光發(fā)射線緊密匹配的激發(fā)*大值成像的。無(wú)論光源，成像熒光蛋白的主要問(wèn)題是，提供足夠的激勵(lì)光，以合理的信號(hào)電平。
除了物鏡，下面討論的，熒光蛋白成像的兩個(gè)*重要的組成部分是發(fā)射濾波器和檢測(cè)器。在寬視場(chǎng)顯微鏡中，激發(fā)濾光器，二色鏡，和發(fā)射濾光器組合成一個(gè)光學(xué)塊的帶寬被用于激發(fā)所述光源由激發(fā)光濾光片。例如，汞燈時(shí)，需要具有高傳輸圖像的綠色熒光蛋白在450和490納米之間的激發(fā)帶通濾波器。更短的波長(zhǎng)帶為青綠色和藍(lán)色的變體是必要的，而更長(zhǎng)的波長(zhǎng)帶，用于黃色，橙色和紅色的衍生物。激光線的帶寬只有幾納米的大小，因此，通常不需要使用干涉濾光片的波長(zhǎng)選擇。二色鏡切波長(zhǎng)應(yīng)該清楚地分開(kāi)前有效地反射和發(fā)射后者的激發(fā)和發(fā)射光譜。有很少的保證金的錯(cuò)誤選擇合適的雙色鏡。另一方面，發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片，可以進(jìn)行微調(diào)，通過(guò)從20變到幾百納米的帶寬，這取決于實(shí)驗(yàn)要求。這些過(guò)濾器是*靈活的，在確定傳遞到檢測(cè)器的熒光發(fā)射強(qiáng)度的水平。編目表1中建議的過(guò)濾器組合的熒光蛋白的定量成像的列表。這些過(guò)濾器的建議，其中包括僅帶通的排放過(guò)濾器（實(shí)際上，忽略長(zhǎng)通濾光片的建議），應(yīng)被視為僅僅作為一個(gè)起點(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。
一些流行的綠色熒光蛋白的過(guò)濾器集的性能的影響，可以判斷圖像進(jìn)行比較，從相同的視場(chǎng)捕獲的單個(gè)濾波器的組合，如在圖3中示出。標(biāo)本是貼壁培養(yǎng)的胚胎大鼠胸主動(dòng)脈與一個(gè)向量，包含一個(gè)紅移的（增強(qiáng)）綠色熒光蛋白的變種，EGFP人類細(xì)胞質(zhì)β -肌動(dòng)蛋白結(jié)合的基因融合蛋白轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞。融合蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出其納入日益增長(zhǎng)的微絲，使可視化的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器組合（見(jiàn)圖3）用熒光顯微鏡。胸主動(dòng)脈成肌細(xì)胞也沾上Mitotracker有：紅CMXRos（線粒體紅色熒光）和Hoechst 33258（細(xì)胞核中的DNA;藍(lán)色熒光）。請(qǐng)注意信號(hào)的情況下，與活塞從藍(lán)色和紅色的熒光基團(tuán)，賦予帶通濾波器（圖3（a）和圖3（b）），但顯著程度的橙紅色的熒光所產(chǎn)生的線粒體探頭與賦予長(zhǎng)通濾光片（圖圖3（c））。帶寬的30納米（活塞），50納米（賦予BP），和*過(guò)100納米（賦予LP），帶通和長(zhǎng)通的GFP過(guò)濾組合，也可與多種合成熒光受光激發(fā)在可見(jiàn)光譜的藍(lán)色部分。
雖然綠色熒光蛋白一般可以與標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾器組合成像，如果強(qiáng)度足夠高，使用專門的過(guò)濾器（見(jiàn)圖3），將使微調(diào)信號(hào)采集，包括或排除其他組件。一個(gè)專門的過(guò)濾器組合的GFP定量成像應(yīng)該使用排放窄帶通濾波器，以*大限度地提高熒光蛋白對(duì)背景信號(hào)（通常是自發(fā)熒光）。一個(gè)狹窄的帶通發(fā)射光濾光片，尖銳的藍(lán)綠色熒光蛋白的信號(hào)（圖3（a））與優(yōu)先傳遞到該檢測(cè)器上（圖3（b）），或綠色橙色綠黃色（圖3（c） ）細(xì)胞自體熒光和其他熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的背景。自體熒光通常具有非常廣泛，而綠色熒光蛋白的發(fā)射光譜相對(duì)較窄。原則上，*窄的帶通濾波器的選擇應(yīng)比其他的背景信號(hào)增加熒光蛋白發(fā)射的歧視。然而，*佳的濾波器的通帶，將被限制了所需的信號(hào)與噪聲的比和檢測(cè)器的特征，如下面所討論。每個(gè)成像的情況，應(yīng)確定*佳的帶通。此外，雖然圖3中所示，所選擇的特定的過(guò)濾器的組合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白不僅依賴于信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)也對(duì)的熒光發(fā)射光譜輪廓的蛋白質(zhì)變體（見(jiàn)表1）成像。
藍(lán)色熒光蛋白變種可以在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡使用標(biāo)準(zhǔn)DAPI過(guò)濾器組合激發(fā)過(guò)濾器公司，在330至380納米范圍內(nèi)成像，截止波長(zhǎng)385至400納米，無(wú)論是帶通或長(zhǎng)波發(fā)射濾光片色鏡（420納米以上）。這些過(guò)濾器的組合是非常有用的青色熒光蛋白，然而，與激發(fā)的藍(lán)紫光（400到440納米）的圖像的熒光基團(tuán)的過(guò)濾器，以產(chǎn)生*佳的圖片。青色熒光蛋白的二色性反射鏡切割之間的波長(zhǎng)455和460納米，以及傳輸460和500納米之間的光的發(fā)射濾光片。許多藍(lán)紫色的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)通和帶通濾波器的組合可以的成功形象青色熒光蛋白衍生物（包括天藍(lán)和AmCyan1），，但顯微鏡和售后市場(chǎng)濾清器的廠家也提供了專門為這些探頭的自定義設(shè)置。
雖然黃色熒光蛋白衍生物（包括增強(qiáng)，金星和水晶）通常使用過(guò)濾器組合設(shè)計(jì)FITC和綠色熒光蛋白產(chǎn)生可接受的圖像，得到更好的結(jié)果時(shí)，吸收和發(fā)射波長(zhǎng)稍長(zhǎng)的配置文件顯示這些濾波器參數(shù)優(yōu)化探頭。為黃色熒光蛋白的理想的組合是與跨越490至510納米的帶通區(qū)域的激發(fā)濾光片，二色性反射鏡與截止波長(zhǎng)為515納米的，和發(fā)射濾波器通過(guò)在520和550納米之間的波長(zhǎng)。à長(zhǎng)波發(fā)射濾波器與截止波長(zhǎng)為515納米或略高也將產(chǎn)生黃色熒光蛋白的良好形象。
橙色和紅色熒光蛋白的光譜剖面跨越一個(gè)大的波長(zhǎng)區(qū)域，不幸的是，沒(méi)有一個(gè)單一的過(guò)濾器組合，是理想的成像的整個(gè)集合這些熒光。紅色熒光蛋白的熒光蛋白變體往往是與TRITC標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾器的組合，以及許多長(zhǎng)通和帶通設(shè)置吸收可見(jiàn)光譜的綠色區(qū)域中的其他探測(cè)器設(shè)計(jì)的可視化。的橙色熒光蛋白成像（魔橙和橙色CoralHue）應(yīng)在500至540納米的區(qū)域與激發(fā)濾光片，加上雙色鏡的截止波長(zhǎng)約550納米，帶通濾波器，它具有發(fā)射波長(zhǎng)560至600納米之間。幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的綠色激發(fā)濾光片組合松散符合要求，但必須設(shè)計(jì)為專門的濾波器參數(shù)優(yōu)化此類別中的特定熒光成像。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)紅色熒光的蛋白質(zhì)（mCherry，HcRed1，mRaspberry mPlum），通常可以與黃色激發(fā)濾光片組合成像。例如，尼康Y-2E / C的設(shè)置，具有一個(gè)帶通中的540至580納米，二色性反射鏡與截止波長(zhǎng)為595納米的，和一個(gè)帶通發(fā)射600納米和660納米之間的過(guò)濾器捕獲光子激發(fā)濾光片，可以可用于許多這些紅色的探針。顯微鏡和過(guò)濾器制造商所提供的自定義過(guò)濾器組合。
在激光共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)的選擇限制在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)為每個(gè)儀器可用的激光線。典型的顯微鏡都配有兩個(gè)或多個(gè)激光器，跨越紫羅蘭（405和440納米），藍(lán)色（457，477和488納米），綠色（514和543納米），黃橙色（568和594納米），并紅（633和647納米）光譜區(qū)域。可以有效地使用這些激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)表1中列出的熒光蛋白，這取決于可用的適當(dāng)?shù)亩苑瓷溏R和發(fā)射濾光片。多光子顯微鏡，也可利用圖像*流行的熒光蛋白的衍生物，在受限制的空間體積，這些工具的特征。
熒光蛋白過(guò)濾組合參數(shù)
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表1
表1給出的是一個(gè)匯編顯示一些*流行的，潛在有用的熒光蛋白變種物業(yè)。隨著每個(gè)熒光蛋白的*佳激光波長(zhǎng)線，以及建議的出發(fā)點(diǎn)的激發(fā)和發(fā)射濾波器帶寬（中心波長(zhǎng)）的通用名稱和/或首字母縮寫列出。也包括在表中的相對(duì)亮度和推薦的二色鏡參數(shù)。是來(lái)自于該產(chǎn)品的摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，EGFP的值除以計(jì)算出的亮度值。創(chuàng)建此房產(chǎn)已被科學(xué)和商業(yè)的文獻(xiàn)資源，目的不是要全面，而是代表熒光蛋白的衍生物，在文獻(xiàn)中得到相當(dāng)?shù)闹匾?，可能證明是有價(jià)值的研究工作。
通常優(yōu)選的定量顯微鏡的檢測(cè)器是光電倍增管和冷卻的電荷耦合器件（CCD）攝像系統(tǒng)。由于光電倍增管成像儀，光柵掃描（用于在激光共聚焦顯微鏡）必須執(zhí)行整個(gè)標(biāo)本逐點(diǎn)建立形象。或者，CCD圖像傳感器中的光電二極管陣列，產(chǎn)生二維圖像的大小的限制，僅由單個(gè)二極管元件的數(shù)量。除了 從信號(hào)對(duì)噪聲的考慮，檢測(cè)器系統(tǒng)的*重要的方面是它的線性度和偏移。CCD陣列是兩個(gè)光電倍增管和高線性度和較高的高端相機(jī)系統(tǒng)，使調(diào)整的偏移量（通常被稱為黑電平），盡一切倍增配置。在實(shí)踐中，應(yīng)調(diào)整偏移量讀取為零時(shí)，從檢體沒(méi)有熒光發(fā)射。如果有一個(gè)非零偏移系統(tǒng)中，它不會(huì)未能取得定量的圖像之間的差異。
在激光掃描共聚焦顯微鏡，光電倍增管通常具有較低的動(dòng)態(tài)范圍（8位或256級(jí)灰度）和檢測(cè)效率（15％?30％）相比，到一個(gè)冷卻的CCD攝像系統(tǒng)。雖然這將是可取的，以增加檢測(cè)效率，8位的動(dòng)態(tài)范圍通常不是一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槊總€(gè)像素一般少于255個(gè)光子收集每個(gè)掃描（即使是很好的染色標(biāo)本）。盡管如此，倍增的響應(yīng)，同時(shí)加上適當(dāng)?shù)募す馄鞯目捎眯耘c背景抑制性能***的線性度，使共聚焦顯微鏡的熒光蛋白定量成像的*佳選擇。多光子顯微鏡，從而消除相差的光損傷的焦平面上，以避免色差，提供了高分辨率的三維測(cè)量，熒光蛋白成像也是一種非常有用的工具。
*重要的參數(shù)是定義定量成像的效用的信號(hào)-噪聲比（簡(jiǎn)稱S / N）。這個(gè)值是在現(xiàn)代商業(yè)熒光顯微鏡一般的散粒噪聲是來(lái)自于由檢測(cè)器收集的光子數(shù)的平方根被定義為。幾個(gè)系統(tǒng)誤差可能被引入在檢測(cè)系統(tǒng)中，但它們通常是比較小的散粒噪聲的CCD和光電倍增管。例如，如果一個(gè)檢測(cè)器收集每像素100個(gè)光子，噪聲將被預(yù)期為10（100）的平方根，或10％的信號(hào)。同樣地，對(duì)于噪聲（100）的10,000的每個(gè)像素的光子的信號(hào)，是信號(hào)只有1％。這些例子反映了典型的信號(hào)電平，在熒光顯微鏡中，在檢測(cè)電路中引入的誤差通常低于1％。一次出現(xiàn)時(shí)，它似乎是顯而易見(jiàn)的，*高的信號(hào)-噪聲電平是*可取的，但在現(xiàn)實(shí)中，因素，例如：光漂白，熒光團(tuán)的飽和度，樣品中的熒光基團(tuán)的數(shù)目和空間分辨率極限所得到的信號(hào)噪比。
在大多數(shù)情況下，以等于比例之間存在的熒光蛋白標(biāo)簽，以及稠合的細(xì)胞靶蛋白。因此，在單元格中的熒光分子的濃度，可以計(jì)算出從作為參考標(biāo)準(zhǔn)使用已知濃度的重組熒光蛋白的細(xì)胞總熒光。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白通常采用用于此目的，因?yàn)樗墓夥€(wěn)定性和亮度。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)EGFP的濃度，已知量的標(biāo)記可以被嵌入在聚丙烯酰胺平板細(xì)胞表達(dá)融合構(gòu)建一起拍攝。參考的標(biāo)準(zhǔn)也已開(kāi)發(fā)用于計(jì)算密度的膜結(jié)合蛋白，通過(guò)將準(zhǔn)確數(shù)量的組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白包被的磁珠。蛋白表達(dá)的定量分析，隨著越來(lái)越多的熒光蛋白用敲的方法在整個(gè)生物標(biāo)記分子利用，將成為越來(lái)越有用的技術(shù)。
選擇物鏡熒光蛋白成像
用于成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)協(xié)議時(shí)，雖然它可能是*重要的考慮，物鏡的選擇往往是*少量的思想。在確定可用的空間分辨率的圖像傳感器收集的光的量是*重要的物鏡的參數(shù)。在一般情況下，物鏡是由三個(gè)主要的標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)值孔徑，放大倍數(shù)和光學(xué)矯正的程度定義。*不重要的參數(shù)放大倍率，盡管普遍的看法相反。放大倍數(shù)確定一個(gè)對(duì)象將出現(xiàn)在目鏡或探測(cè)器只大，但不發(fā)揮作用，分辨率（*小的細(xì)節(jié)，可以清楚地觀察）或亮度（將要收集的熒光信號(hào)的量）的圖像。
分辨率和亮度的數(shù)值孔徑，這是*重要的標(biāo)準(zhǔn)選擇一個(gè)物鏡的函數(shù)。的數(shù)值孔徑定義，將進(jìn)入物鏡前透鏡的光的量，所以應(yīng)選擇盡可能高的數(shù)值孔徑成像的熒光蛋白進(jìn)行定量。圖像采集（任何形式的）背后的一般原則很簡(jiǎn)單：作為信號(hào)噪聲比的增加，所以圖像質(zhì)量。這個(gè)概念是特別關(guān)鍵的激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，其中收集的光子數(shù)量往往是相當(dāng)小的（通常只有幾每像素）的圖像集合。因此，謹(jǐn)慎選擇適當(dāng)?shù)奈镧R是優(yōu)化光子收集策略時(shí)特別有用。請(qǐng)注意，圖像的整體亮度的平方除以放大倍率的物鏡的數(shù)值孔徑的四次方成正比。
圖4中所示的數(shù)值孔徑的原理的分辨率和圖像的亮度方面的重要性的一個(gè)例子。樣品是培養(yǎng)貼壁的人骨肉瘤上皮細(xì)胞（U2OS線）轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合到線粒體靶向的核苷酸序列從人類細(xì)胞色素C氧化酶亞基VIII。的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯后的線粒體定位信號(hào)是負(fù)責(zé)細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的熒光蛋白嵌合體在整個(gè)運(yùn)輸和分配。管狀線粒體隨后可以可視化使用熒光顯微鏡。
在圖4中，使用具有相同的光學(xué)校正（方案螢石）和數(shù)值孔徑（1.3）的物鏡成像的相同的視場(chǎng)，但與從40倍到100倍的放大倍率。雖然在圖4中收集的圖像的像素和使用的檢測(cè)器的條件的數(shù)是相同的，線粒體是明亮的成像時(shí)，通過(guò)40倍物鏡（圖4（a））。相比之下，更高的放大倍率60X和100X的物鏡（圖4（b）和圖4（c），分別），100倍的圖像幾乎不產(chǎn)生逐漸變暗的圖像。此物鏡，仍然可以使用的圖像試樣，但檢測(cè)器的增益，必須顯著增加，導(dǎo)致惡化的信號(hào) - 噪聲比，并通常次于圖像。請(qǐng)注意，物鏡的分辨能力（圖圖4（d）通過(guò)第4（f））是可比較的，因?yàn)樵谙嗤臄?shù)值孔徑值。
從圖4中的數(shù)據(jù)，將收集到的基本概念之一是避免過(guò)度的放大倍率，選擇物鏡時(shí)的熒光蛋白成像（和其他的熒光團(tuán)，為此事）。簡(jiǎn)單地增加數(shù)字放大（變焦），圖像采集過(guò)程中使用40倍的物鏡結(jié)果共聚焦顯微鏡中的圖像大小相當(dāng)于100倍的鏡頭（圖4（d）及（f）條）。這兩個(gè)物鏡的分辨率是一樣的，因?yàn)樗麄冇邢嗤臄?shù)值孔徑值。不應(yīng)被視為相對(duì)次要的放大倍率參數(shù)表明，使用60倍或100倍的物鏡是不是有利。事實(shí)上，選擇高倍率的物鏡通常是必要的，當(dāng)使用寬視場(chǎng)顯微鏡的成像非常小的物體，如過(guò)氧化物酶體或分泌顆粒，。由于圖像的大小相對(duì)于檢測(cè)器尺寸起著重要的作用，在確定空間的采樣頻率，確定的*佳放大倍率的數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)（CCD像素的大小和中間倍率）的參數(shù)。因此，物鏡的*佳選擇通常取決于儀器的光學(xué)結(jié)構(gòu)的，除了一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)的具體要求。
高度校正的物鏡（復(fù)消色差透鏡）的使用應(yīng)慎重考慮，并盡量避免。色差和平整度的字段中包含的物鏡的典型的光學(xué)校正透鏡元件需要額外的矯正的程度的增加（例如，從螢石復(fù)消色差透鏡）。每增加一個(gè)透鏡，總的傳輸?shù)墓馔ㄟ^(guò)物鏡減小，這進(jìn)一步限制了能夠到達(dá)探測(cè)器的信號(hào)的量。雖然高度校正透鏡的所需的專門的應(yīng)用程序，如，高signal-to-noise比（并因此是一種特別的質(zhì)量圖像）將更難獲得，多色成像，尤其是成像時(shí)的調(diào)光器的熒光蛋白質(zhì)，如HcRed或ECFP。綜上所述，40x的螢石物鏡的（數(shù)值孔徑為1.3），優(yōu)選為包含單一的熒光蛋白的成像標(biāo)本，但多色實(shí)驗(yàn)（兩個(gè)或更多的熒光蛋白），復(fù)消色差透鏡進(jìn)行色彩校正的目的是必要的。
多色熒光蛋白成像
全彩色調(diào)色板的熒光蛋白的發(fā)展背后的主要推理是同時(shí)跟蹤兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞活動(dòng)。鑒于日益增長(zhǎng)的熒光蛋白的變種數(shù)量目前可用的（見(jiàn)表1），*佳配對(duì)可能不是很明顯。廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光蛋白和它們的顏色位移的遺傳變異體所表現(xiàn)出的公司通常需要專門的設(shè)計(jì)考慮因素時(shí)，這些**的探針同時(shí)使用兩個(gè)或更多的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。首要關(guān)注的是潛在的出血通過(guò)工件（實(shí)際上，從一個(gè)探針熒光外溢進(jìn)入通道配置為第二個(gè)探頭）從重大通常表現(xiàn)出的熒光蛋白組合的光譜重疊程度。
滲色（通常稱為交叉或串?dāng)_）可以發(fā)生在兩個(gè)不同的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射。熒光探針檢查時(shí)，發(fā)生流血通過(guò)向藍(lán)端的頻譜（波長(zhǎng)較短）的神器，而*明顯的是在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（紅端）排放。綠色熒光蛋白可以作為一個(gè)例子，通?？梢詸z測(cè)到通過(guò)紅色發(fā)射濾波器，但一般不使用綠色濾波器成像紅色熒光蛋白。出于這個(gè)原因，多色成像的熒光蛋白進(jìn)行的*長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射探頭想像*，使用的激發(fā)波長(zhǎng)不交叉的波長(zhǎng)更短的探針。EYFP信號(hào)例如圖像EYFP和EGFP在同一單元中，使用氬離子激光，將首先收集在514納米的譜線，*出吸收的檔案EGFP，和排放聚集有530 - 550納米帶通濾波器。不是特別關(guān)鍵的，因?yàn)橹挥蠩YFP被激發(fā)的發(fā)射濾波器的帶寬。綠色熒光蛋白成像從477納米氬離子激光線，連同一個(gè)很窄的490至500納米帶通發(fā)射濾波器使用第二次掃描。該過(guò)濾器應(yīng)正確定位，，到排除EYFP熒光，并允許特定EGFP（有點(diǎn)乏味的任務(wù)）的信號(hào)捕獲。雖然的488納米氬離子激光的峰值更接近的EGFP的激發(fā)*大值，它太接近到發(fā)射濾波器的帶通區(qū)域，從而與圖像采集的激光反射光的干擾的可能性。
成像兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光蛋白質(zhì)時(shí)要考慮的一個(gè)重要點(diǎn)是帶過(guò)濾器的多色成像，需要認(rèn)真注意，以控制出血通過(guò)熒光發(fā)射到意想不到的渠道。然而，應(yīng)該指出的是，顯著限制濾波器的帶寬發(fā)生在信號(hào)噪聲（因?yàn)樵摷蠋捠艿絿?yán)重限制）和由于需要單獨(dú)收集策略的時(shí)間分辨率為代價(jià)的。其次，專門的光學(xué)設(shè)計(jì)，往往特別是實(shí)驗(yàn)，通常是必需的，以達(dá)到*佳的成像條件。例如，綠色熒光蛋白變異體的黃色衍生物的存在下收集所需的專門的過(guò)濾器的組合標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦顯微鏡中并不普遍。由于熒光蛋白的數(shù)量和光譜剖面變化的持續(xù)增長(zhǎng)，需要特定的過(guò)濾器組合將相應(yīng)增加。
圖5中所示的一系列的同時(shí)與兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光蛋白融合到亞細(xì)胞定位的物鏡轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中拍攝的圖像。圖5（a）在HeLa細(xì)胞標(biāo)記EYFP（核），的ECFP（高爾基），DsRed2FP（線粒體），三個(gè)探頭清楚地分隔廣角熒光濾波器組合用于捕捉圖像（尼康CFP YFP HYQ和Cy3 HYQ）。負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞（OK）轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（微管），ECFP（核），DsRed2FP（線粒體）和成像標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾器組合的特色在圖5（b）。同樣地，在圖5（c）圖中的兔腎細(xì)胞（RK-13 行），轉(zhuǎn)染EYFP（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)），ECFP（過(guò)氧化物酶）和成像尼康CFP和YFP HYQ過(guò)濾器集。非洲水的貓鼬細(xì)胞（APM）在圖5（d）所示的細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（微管蛋白）和DsRed2FP（核），人骨肉瘤細(xì)胞（U2OS線;圖5條（e）），標(biāo)有相同的核探頭沿與ECFP（線粒體）。*后，在圖5（f）轉(zhuǎn)染的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞系）（過(guò)氧化物酶）和DsRed2FP（線粒體）與EGFP。所有精選如圖5的圖像被抓獲使用廣角熒光顯微鏡和尼康濾波器的優(yōu)化組合適當(dāng)?shù)臒晒獾鞍住?/span>
雖然*亮的熒光蛋白類的綠色和黃色的（見(jiàn)表1），它們的光譜的極大值相隔僅由平均為20至25納米。多色實(shí)驗(yàn)中使用成對(duì)的綠色和黃色熒光蛋白是可能的，但放氣通過(guò)過(guò)濾器的組合之間，成為一個(gè)顯著的問(wèn)題。其結(jié)果是，不經(jīng)常使用的綠色和黃色的組合在一起。其中*流行的雙探頭組合是青色和黃色熒光蛋白（ECFP和EYFP，參見(jiàn)圖5）。盡管ECFP比EBFP更亮，其使用呈現(xiàn)兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)在該ECFP被有效地激發(fā)的氬離子激光器的457納米線，探針不容易地（如在圖2中示出）的光漂白劑。
結(jié)合綠色或黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白衍生物可以產(chǎn)生一個(gè)有用的，可以容易地分離與發(fā)射光譜探針配對(duì)。然而，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇紅色熒光蛋白的變種，由于成熟率差異。此外，因?yàn)镈sRed的及其衍生物形成四聚體在體內(nèi)預(yù)留，他們可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的效果的生物學(xué)系統(tǒng)被調(diào)查的蛋白質(zhì)（如比預(yù)期的其他細(xì)胞器聚集或本地化）。目前尚無(wú)有效的經(jīng)驗(yàn)法則可以預(yù)測(cè)是否將紅色熒光蛋白衍生物作為融合標(biāo)簽，一些蛋白質(zhì)可能齊聚，而別人不會(huì)容忍。對(duì)于僅使用熒光蛋白（圖5（a）和圖5（b））相結(jié)合，青色，黃色（或綠色），DsRed的三重標(biāo)記提供了一個(gè)很好的解決方案。
有幾個(gè)時(shí)，必須考慮使用兩個(gè)或更多的上下文中的活細(xì)胞成像的熒光蛋白的妥協(xié)。例如，與另外的要求不同的采集圖像的條件下，由于每種顏色的數(shù)據(jù)采集速率減慢。尋址熒光流血通過(guò)變得越來(lái)越復(fù)雜，特別是因?yàn)榘l(fā)射光譜的熒光蛋白往往是相當(dāng)廣泛的（往往重疊）。此外，因?yàn)榱餍械臒晒獾鞍撞煌南鄬?duì)亮度（表1），每種顏色可能需要不同的信號(hào)的積分時(shí)間。青色和藍(lán)色熒光蛋白是相當(dāng)暗淡，可能需要較長(zhǎng)的收集期間，明亮的綠色和黃色熒光蛋白飽和。因此，重要的是平衡的實(shí)驗(yàn)參數(shù)（實(shí)際上，快速收集與*佳分離）與熒光蛋白的選擇。例如，快速，高效的圖像捕捉相結(jié)合EYFP和DsRedFP是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因?yàn)檫@些熒光蛋白可以共享一個(gè)單一的激勵(lì)設(shè)置，而ECFP和EYFP可以提供更高的光譜分離度。
成像光學(xué)熒光筆熒光蛋白
熒光筆熒光蛋白利用光學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮的幾個(gè)重要方面，關(guān)于活細(xì)胞成像，顯微鏡配置，載體構(gòu)建，和蛋白質(zhì)的選擇，以優(yōu)化圖像采集參數(shù)。這些**的探頭主要用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這往往需要保持細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡舞臺(tái)上長(zhǎng)時(shí)間處于亞健康狀態(tài)。各種專門的加熱成像室制作舞臺(tái)插入市售的長(zhǎng)期細(xì)胞在顯微鏡維修，但研究者也必須考慮一些必要的輔助要求，如二氧化碳源，輕緊顯微鏡外殼，和振動(dòng)隔離。總之，成功形象長(zhǎng)時(shí)期的活細(xì)胞必要的實(shí)驗(yàn)條件下，應(yīng)仔細(xì)著手與光學(xué)熒光筆蛋白實(shí)驗(yàn)前成立。
幾個(gè)光學(xué)熒光筆熒光蛋白可以成功地使用傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡技術(shù)成像，但嚴(yán)重的定量調(diào)查，涉及的漂白方法和光敏往往必須配備專門的激光系統(tǒng)的多光子共聚焦顯微鏡進(jìn)行。具體而言，PA-GFP，PS-CFP，楓，EosFP，Dronpa所有需要近紫外或紫色的照明光活化或光轉(zhuǎn)化，但成像的蛋白質(zhì)所需的較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光源（藍(lán)色和綠色激發(fā)）。因此應(yīng)配備的紫外或紫色激光，以及可見(jiàn)光激光器，發(fā)射藍(lán)色和綠色光譜線，共聚焦顯微鏡。
當(dāng)下*流行的激光光學(xué)熒光筆配置，雖然紫外線高能量的氬氣，二極管泵浦固態(tài)二極管405納米，488納米氬離子，和一個(gè)543納米的氦氖，氦鎘激光可作為光敏（牢記潛在的細(xì)胞損傷工件可以用紫外線照射）。其他有用的成像激光器包括一些新的二極管和氦 - 氖模型和多光譜氪 - 氬系統(tǒng)。*好的多儀器配置與寬帶鈦藍(lán)寶石激光器的波長(zhǎng)范圍在750納米到1100納米之間的可調(diào)輸出。
在圖6中示出的是光轉(zhuǎn)化的PS-CFP2 使用405納米二極管激光器的成像和轉(zhuǎn)換，以及氬離子488納米的譜線成像的和跟蹤的人的β -肌動(dòng)蛋白的熒光蛋白融合產(chǎn)物與光轉(zhuǎn)換蛋白。融合構(gòu)建質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染表達(dá)打成絲狀肌動(dòng)蛋白在活細(xì)胞成像室負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞（OK）。圖6（a）示出了單電池的光轉(zhuǎn)化之前，用二極管激光器成像。感興趣的區(qū)域周圍畫一大截的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)（圖6（b）條;紅色框），然后用40％的激光功率在405納米照明。當(dāng)二極管和氬離子激光器（圖6（b）條），成像的光轉(zhuǎn)換PS-CFP2融合蛋白，清晰可見(jiàn)的綠色熒光，對(duì)照未轉(zhuǎn)化的探針（藍(lán)色）。10分鐘后（圖圖6（c）），光轉(zhuǎn)換的肌動(dòng)蛋白已經(jīng)開(kāi)始，并入感興趣的區(qū)域之外的長(zhǎng)絲，并在30分鐘時(shí)（圖6（2））的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)與光學(xué)熒光筆標(biāo)記。
*有效的控制下進(jìn)行的聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF），它可以很方便地用來(lái)定義圓形，橢圓形，矩形或手繪選擇照射照明光轉(zhuǎn)換和光活化過(guò)程中的具體區(qū)域的劃分標(biāo)本。AOTF還可以進(jìn)行微調(diào)激光功率水平調(diào)節(jié)強(qiáng)度試樣，并能夠使用的技術(shù)被稱為高速通道切換或multitracking的順序掃描標(biāo)本。這種方法使排放的順序激發(fā)和收集一些熒光探針，以避免出血，通過(guò)文物，更準(zhǔn)確地單獨(dú)的發(fā)射光譜。
定義地區(qū)的廣角鏡的興趣，提出了更大的挑戰(zhàn)。研究級(jí)顯微鏡通常配備照亮選定區(qū)域中的試樣，可以進(jìn)行調(diào)整的可變光圈，雖然用少得多的精度比共聚焦顯微鏡的聲光可調(diào)諧濾波器的系統(tǒng)。廣角儀器也必須配置專門的熒光濾光片組合以圖像的幾個(gè)光學(xué)熒光筆蛋白。相比之下，共聚焦和多儀器更適合定量分析細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，利用光電轉(zhuǎn)換和光活化技術(shù)比寬視場(chǎng)顯微鏡，因此應(yīng)為這些應(yīng)用的*。
產(chǎn)生足夠高的熒光信號(hào)電平為*佳的圖像采集也是使用光學(xué)熒光筆時(shí)要考慮的一個(gè)重要因素。在這方面，可以采用的吸收摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的值的本機(jī)和光轉(zhuǎn)換蛋白物種，以此來(lái)衡量，以確定相對(duì)的亮度水平。例如，楓和mEosFP都具有相似的光譜帶寬配置的可見(jiàn)光光譜中的綠色（母語(yǔ)）和紅色（光轉(zhuǎn)換）地區(qū)。然而，楓的固有綠色形式大約有綠色mEosFP由于到一個(gè)更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的熒光發(fā)射強(qiáng)度或亮度電平的兩倍。因此，在光電轉(zhuǎn)換之前，成像信號(hào) - 噪聲比楓遠(yuǎn)高于mEosFP。光電轉(zhuǎn)換后，這兩種蛋白具有類似的亮度水平（見(jiàn)表1），并產(chǎn)生媲美的圖像。
在當(dāng)前可用的光熒光筆蛋白，Dronpa，楓，mEosFP的是*亮的，其次是PA-GFP，在亮度電平的光轉(zhuǎn)換楓物種類似，但顯著低于天然蛋白。市售的PS-CFP2變種是大約一個(gè)半光亮如楓，而火種和PS-CFP蛋白質(zhì)，無(wú)論是在本土和光轉(zhuǎn)換形式，是***暗的光熒光筆，收益率只有約25％的亮度電平表現(xiàn)出的光轉(zhuǎn)換的楓（表1）。后者熒光筆生物物鏡具有低豐度的水平，或需要高成像速度的調(diào)查計(jì)劃時(shí)，應(yīng)考慮的一個(gè)因素，在成像過(guò)程中，表現(xiàn)出顯著較低的信號(hào)信噪比。
結(jié)論
熒光蛋白成像工具，目前的電池使的細(xì)胞生物學(xué)家隨時(shí)監(jiān)控在活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)，蛋白質(zhì)，細(xì)胞器和細(xì)胞的行為提供了許多新的見(jiàn)解。這樣做，這些顯著的探頭已經(jīng)迎來(lái)穩(wěn)態(tài)和動(dòng)力學(xué)顯微技術(shù)可以用來(lái)破譯途徑和機(jī)制的生物過(guò)程在細(xì)胞生物學(xué)的新時(shí)代。再加上突飛猛進(jìn)的發(fā)展中的活細(xì)胞成像顯微鏡系統(tǒng)，包括微光電子倍增CCD相機(jī)，旋轉(zhuǎn)盤共聚焦儀器，狹縫掃描顯微鏡，舞臺(tái)設(shè)置在整個(gè)可見(jiàn)光的熒光蛋白成像和光學(xué)熒光筆和近紅外光譜區(qū)的與近實(shí)時(shí)精度。