奧林巴斯顯微鏡：熒光顯微鏡攝影的錯(cuò)誤

顯微攝影在熒光照明條件下，提出了一套獨(dú)特冒充顯微鏡的特殊問題的情況。曝光時(shí)間往往是非常長的（在某些情況下運(yùn)行多少秒到幾分鐘），試樣的熒光可能會(huì)在曝光過程中褪色，全黑的背景往往在不經(jīng)意間光信號(hào)米建議過度曝光。

此外，熒光的標(biāo)本發(fā)出他們自己的光，和顆粒位于所需的焦點(diǎn)平面的上方和下方往往輻射光造成圖像細(xì)節(jié)模糊。盡管熒光圖像可能會(huì)顯得明亮?xí)r，通過顯微鏡目鏡（由于人眼對(duì)光線的敏感度的精致），它們通常需要較長的曝光時(shí)間，以注冊(cè)令人滿意的圖像，在膠片上。很長的風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)雜的顯微攝影與熒光染料染色的標(biāo)本增加振動(dòng)和電影互惠故障影響，造成不良的顏色變化，在圖像的可能性。

雖然熒光顯微照相術(shù)的基本問題，通常是到達(dá)膠片的光很少，也有一些可以采取的步驟，以提高圖像質(zhì)量。用于熒光顯微鏡的物鏡應(yīng)該具有盡可能高的數(shù)值孔徑，實(shí)驗(yàn)中采用的波長的光具有高透射率。由于光強(qiáng)度（反射光的熒光）的數(shù)值孔徑的四次方變化，這些目標(biāo)可以顯著減少曝光時(shí)間在反射光中的熒光顯微鏡。光照強(qiáng)度也放大倍率的平方成反比，導(dǎo)致總放大倍數(shù)在膠片上保持到最低限度時(shí)，明亮的圖像。減少在膜平面上的倍率通常的低倍率照相目鏡的（或投影透鏡）的協(xié)助下使用。此外，當(dāng)使用一個(gè)三目頭時(shí)，通常是可取的相機(jī)轉(zhuǎn)移所有的光，而不是有觀看目鏡和相機(jī)之間的光分裂（通過一個(gè)分束器）。由于圖像強(qiáng)度膠片平面的距離的平方成反比，顯微鏡有更好的表現(xiàn)，那么這個(gè)距離盡量短。出于這個(gè)原因，由于廣泛可用的，大多數(shù)熒光顯微鏡被記錄在35毫米的薄膜（而不是更大的格式），當(dāng)使用傳統(tǒng)的顯微攝影來捕捉圖像。現(xiàn)代低噪聲溫度控制CCD的數(shù)碼相機(jī)正越來越多地用于取代膠片作為介質(zhì)的首選熒光顯微攝影。

低光照水平和熒光樣品的褪色是兩個(gè)的主要困難需要克服的熒光顯微照相。通常情況下，動(dòng)態(tài)熒光制劑性質(zhì)使得良好的顯微攝影必不可少的捕捉與樣品發(fā)生的事件的記錄，往往可以揭示細(xì)節(jié)不明顯檢查時(shí)通過目鏡觀察標(biāo)本。長時(shí)間曝光，所以常用于熒光，必然導(dǎo)致標(biāo)本的熒光強(qiáng)度在長時(shí)間照射互惠失敗和衰落。事實(shí)上，衰落特異性熒光特性往往是速度比背景，從而導(dǎo)致圖像的對(duì)比度的損失。

遭受稱為倒易律失效的效果當(dāng)超過或長或短的時(shí)間內(nèi)暴露在光線下時(shí)，所有的感光乳劑（包括黑白，彩色負(fù)片，彩色透明膠片）。倒易律涉及圖像的曝光時(shí)間和光強(qiáng)度的密度，使得存在在顯微鏡的照明強(qiáng)度之間的相互關(guān)系和膜所需的曝光時(shí)間。實(shí)際上，法律規(guī)定的曝光時(shí)間，以維持一個(gè)恒定的膜密度光強(qiáng)度成反比。光的強(qiáng)度較低，所需的曝光時(shí)間越長須交出了一份令人滿意的圖像。這種反向關(guān)系成立，對(duì)于大多數(shù)膜，如果適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間是1/500之間的第二個(gè)和1/2秒。

在熒光顯微鏡，常規(guī)要求低光水平超過1/2秒（通常從幾秒到幾分鐘不等）的風(fēng)險(xiǎn)。互易關(guān)系不再持有在這些條件下，膜將需要額外的曝光時(shí)間，以得到合適的圖像密度。這種現(xiàn)象被稱為互易律失效，一個(gè)術(shù)語，它僅表示曝光時(shí)間和光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系不再成立，并不表明薄膜乳液在性能方面的故障。

倒易律失效的一個(gè)副作用是，本已疲弱的樣品熒光進(jìn)一步減少通過漂白的標(biāo)本，和不正確的色彩再現(xiàn)，經(jīng)常出現(xiàn)由于為增加曝光時(shí)間。圖2中的圖像是該系列的熒光顯微照片，示出抗體熒光標(biāo)記與當(dāng)前流行的試劑，熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）時(shí)，成像的使用奧林巴斯WIB長通熒光立方體。的中心（圖2（b））中的單元格被拍到使用校正后的曝光時(shí)間調(diào)整為倒易律失效和柯達(dá)雷登顏色補(bǔ)償濾波器，以除去不希望的色移。在左側(cè)（圖圖2（a）），在同一視場顯示光漂白或褪色，由于長期暴露在照明源的熒光活性的影響。圖2（c）中的顏色變化和縮小圖像的強(qiáng)度，從而從倒易律失效是顯而易見的。

互易律失效，通?？梢院唵蔚赝ㄟ^黑白膠片的曝光時(shí)間或加工條件中增加補(bǔ)償，但是這并不總是與彩色負(fù)性和透明度薄膜的情況下。大多數(shù)彩色膠片有三種顏色敏感的染料層，其中每一個(gè)有一個(gè)稍微不同的特性曲線的位置和斜率在不同的反應(yīng)中得到的互易效應(yīng)可能造成不希望的顏色的變化或管型。通常情況下，暴露時(shí)間和色彩平衡過濾器使用彩色膠片時(shí)，必須進(jìn)行調(diào)整，以補(bǔ)償很長或短的風(fēng)險(xiǎn)。

利用一個(gè)物鏡的，具有一個(gè)非常小的數(shù)值孔徑（例如，40倍的物鏡NA = 0.65，相對(duì)于相同的放大倍率的物鏡具有一個(gè)數(shù)值孔徑（NA）為0.85，0.95，或1.0）產(chǎn)生一個(gè)圖像顯示的亮度不足，因而延長的曝光時(shí)間。數(shù)值孔徑是一個(gè)客觀的集光能力的措施，這意味著高數(shù)值孔徑物鏡可以捕捉更大數(shù)額的生色團(tuán)所產(chǎn)生的微弱的熒光發(fā)射。做熒光顯微攝影時(shí)，務(wù)必使用可用的最高物鏡的數(shù)值孔徑。使用過度的目標(biāo)和照相目鏡倍率也將導(dǎo)致亮度降低。為了彌補(bǔ)這一點(diǎn)，總是采用盡可能最低的倍率照相目鏡的和最高的數(shù)值孔徑物鏡，在一個(gè)給定的倍率。例如，一個(gè)60倍俯視復(fù)消色差透鏡物鏡具有的數(shù)值孔徑為0.95（亮度指數(shù)= 22.6），優(yōu)選的數(shù)值孔徑等于0.85（亮度指數(shù)= 14.5），即使工作距離的螢石物鏡是一個(gè)60X平場螢石物鏡的兩倍，復(fù)消色差透鏡。此外，由于高數(shù)值孔徑的物鏡的景深較淺的，它們的使用可能避免對(duì)比從上方或下方的焦點(diǎn)平面減少聚焦排放的影響。同樣的，一個(gè)的2.5倍照相將提供更多的照度大于3.3倍或5倍的目鏡。激光掃描共聚焦顯微鏡是專為從根本上消除了聚焦光，并給予更清晰的熒光圖像分辨率稍好。

如細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中的典型的熒光應(yīng)用不僅關(guān)注的試樣的亮度，而且具體試樣的熒光的特性的背景熒光的比值。單分子熒光事件和其他低光實(shí)驗(yàn)自發(fā)熒光和/或內(nèi)部反映內(nèi)部物鏡的能力產(chǎn)生巨大的差異，圖像小的結(jié)構(gòu)與熒光量子產(chǎn)率較低，這一點(diǎn)尤為重要。為了最大限度地提高在設(shè)計(jì)用于熒光顯微鏡的物鏡的信號(hào) - 噪聲比（試樣的熒光強(qiáng)度高于背景），制造商使用石英等特種玻璃的配方中具有高的透射率從紅外到紫外的整個(gè)頻譜。這些物鏡是非常低的自發(fā)熒光，利用特殊的光學(xué)水泥和防反射涂層，旨在通過熒光激發(fā)波長的擴(kuò)展范圍。更高的數(shù)值孔徑耦合到先進(jìn)的玻璃配方，提供現(xiàn)代化的熒光物鏡的能力的波長處激發(fā)標(biāo)本下降到340納米的光具有更高的傳輸值，以獲得更明亮的熒光圖像。

共同的放大倍率及數(shù)值孔徑的的名義物鏡亮度值的比較示于表1。這些數(shù)值是根據(jù)下列公式計(jì)算：

其中，NA是物鏡的數(shù)值孔徑和傳動(dòng)比被推定為100000。從這個(gè)等式中，很明顯，對(duì)于相同的放大倍率，圖像亮度的照明場和次級(jí)熒光隨物鏡的數(shù)值孔徑，而且隨著放大倍數(shù)的增加而減小。盡可能從標(biāo)稱值的5-10％的實(shí)際數(shù)值孔徑為一個(gè)特定的物鏡和放大倍率值可能會(huì)有所不同。如上所討論的，是由物鏡發(fā)送的面板亮度，也依賴的內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)，如玻璃透鏡元件，內(nèi)部反射和眩光，和鏡片涂料的數(shù)量。通常，它是要犧牲比較高的復(fù)消色差透鏡物鏡增強(qiáng)后的圖像顯示的亮度更高的數(shù)值孔徑的螢石物鏡訂單中的校正色差的光學(xué)矯正。

使用高數(shù)值孔徑聚光鏡盡可能透射光熒光，以避免光損失和隨附長的曝光時(shí)間。此外，當(dāng)使用舊顯微鏡臺(tái)下鏡，購買有一面鏡子，鍍鋁表面，而不是一個(gè)鍍銀鏡（銀會(huì)反射紫外線光很差）。通常情況下，暗視野聚光油浸可以被取代的標(biāo)準(zhǔn)明場冷凝器發(fā)送熒光應(yīng)用。當(dāng)使用浸油，適用于非熒光的油狀物之間的頂部的聚光鏡和底部的顯微鏡載片上透鏡和物鏡前透鏡和蓋玻片之間。這種類型的油都是現(xiàn)成的從商業(yè)廠商數(shù)量。

漂白，或染料的光解，迅速 降低熒光探針用于染色標(biāo)本和編制暴露最低照度水平是可能的，應(yīng)盡量減少。這種效應(yīng)是由于主要是由光動(dòng)力之間的熒光染料和氧的相互作用，其中涉及促進(jìn)從單線基態(tài)，稱為系間竄越的處理相對(duì)長壽命三重激發(fā)態(tài)的染料分子。一旦已經(jīng)被提升到激發(fā)態(tài)的發(fā)色團(tuán)，它變得更加化學(xué)反應(yīng)，并可能參與不可逆的化學(xué)反應(yīng)，包括分解，聚合，氧化（主要由單重態(tài)氧）或與另一個(gè)分子反應(yīng)。與氧氣的反應(yīng)通常會(huì)導(dǎo)致漂白發(fā)色團(tuán)，這取決于細(xì)胞內(nèi)的單線態(tài)氧的濃度和其他內(nèi)部的細(xì)胞成分，如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，或小分子的生色團(tuán)接近。計(jì)算表明，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧以上的距離超過500埃生色團(tuán)的光解。

光漂白的影響減到最小，熒光顯微鏡，可結(jié)合其他技術(shù)，都是非破壞性的熒光染料，如微分干涉相差（DIC）的，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度（HMC），傳送暗場照明，相位相反的。我們的想法是找到感興趣的特定區(qū)域的樣品中的非破壞性的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，然后，不不確定試樣的情況下，切換顯微鏡熒光模式。這種類型的一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3和4中。圖3（a）示出了使用相位對(duì)比光學(xué)成像的3T3成纖維細(xì)胞的單層組織培養(yǎng)。細(xì)胞行成立由美國國立衛(wèi)生行瑞士小鼠胚胎細(xì)胞，這是高度接觸抑制和有用的研究，涉及形成肉瘤病毒和白血病病毒傳播。的顯微照片，圖3（b）顯示了相同的視場，但是這一次成像，使用熒光照明（汞蒸氣燈和一個(gè)奧林巴斯吳過濾器立方體）的細(xì)胞染色的熒光染料4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI ），具有最大發(fā)射波長在461納米，這是用來選擇性地染色細(xì)胞核和染色質(zhì)的核酸特異性染料。圖3（c）示出這兩種技術(shù)的組合使用，以產(chǎn)生熒光染3T3細(xì)胞核的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器內(nèi)部的相位對(duì)比度的圖像疊加在一個(gè)美麗的顯微照片。此圖片是記錄一個(gè)專門的螢石物鏡相環(huán)的設(shè)計(jì)允許同時(shí)觀察熒光和相襯的物鏡是一致的。

又如各種技術(shù)的綜合，使用微分干涉相差（DIC）的這段時(shí)間，如圖4所示。（a）是圖4中所示的薄邊的隱球菌感染的貓的腦組織，想像使用DIC的光學(xué)和一個(gè)全波的相位差板。注意偽三維外觀的顯微照片。圖4（b）示出相同的視場，但成像熒光照明和一個(gè)奧林巴斯WIB過濾器立方體。圖4（b）中的細(xì)胞進(jìn)行染色與熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）和剛果紅（發(fā)射波長分別為520和614納米，最大值）的組合。這兩種技術(shù)的結(jié)合使用，以產(chǎn)生圖4（c），它示出了感染的貓的腦組織中的熒光和DIC照明。

光漂白的速度取決于幾個(gè)因素，包括發(fā)色團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)性，細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)環(huán)境，和激發(fā)光的強(qiáng)度和波長。一些熒光染料易于漂白，而有些則是相對(duì)不敏感，穩(wěn)定更長的時(shí)間。在許多情況下，試樣可以恢復(fù)的漂白效果，尤其是當(dāng)它是保持涼爽，在黑暗的環(huán)境。漂白應(yīng)區(qū)別于另一個(gè)熒光工件稱為淬火，發(fā)生了競爭過程，如高溫，高氧氣濃度的鹽或鹵素化合物的存在下，分子聚集的熒光強(qiáng)度的降低（或在某些情況下，增強(qiáng)）。有時(shí)身體的能量轉(zhuǎn)移到其他受體分子居住的淬火結(jié)果激發(fā)熒光染料，這種現(xiàn)象被稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這種特殊的現(xiàn)象已成為一個(gè)較新的技術(shù)，測量距離遠(yuǎn)低于在光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率的基礎(chǔ)。生色團(tuán)中的雜質(zhì)也可能降低熒光強(qiáng)度由漂白或淬火。

漂白可以最小化通過減少曝光時(shí)間（如上文所討論），或通過降低能量的激發(fā)（燈的亮度），但這些補(bǔ)救措施都伴隨著的不良影響減少了發(fā)色基團(tuán)的熒光發(fā)射能量。中性密度過濾器可以被放置在光路中，光到達(dá)之前激發(fā)光濾光片，從而減少激發(fā)光的強(qiáng)度，并減少試樣的觀察過程中的衰落的影響。許多熒光顯微鏡都配有一個(gè)快門系統(tǒng)耦合到中性密度濾光片，使激發(fā)光強(qiáng)度降低觀察和標(biāo)本操縱期間，但使顯微鏡可以輕松地切換到全功率照明顯微攝影。這也有利于在可能的情況下，去氧標(biāo)本（但不是活細(xì)胞或組織），如?酸丙酯和其他市售的抑制劑，其為使用特定的抗淬滅試劑。能淬滅單線態(tài)氧的化學(xué)品也可以減少漂白的效果。的例子是2 -巰基乙胺，1,4 -二氮雜雙環(huán)-2,2,2 -辛烷（DABCO），diphenylisobenzofuran，p -苯二胺的，和氨基酸的組氨酸。衰落的影響也可以被降低，在某些情況下，通過改變安裝介質(zhì)的pH濃度。

圖5（a）示出了幾種市售的抗淬滅試劑的熒光衰落抑制率。藍(lán)色曲線顯示未處理樣品熒光強(qiáng)度迅速下降，而紅色和綠色的曲線表明抗淬滅試劑略有不同效率的衰減率減少。標(biāo)本是有袋類腎組織培養(yǎng)細(xì)胞（PTK2）與任一熒光素-5 -異硫氰酸酯（FITC）或羅丹明鬼筆環(huán)肽（兩種染料具有類似的衰落特性）染色。抗淬滅試劑分別為p -苯二胺（綠色曲線）或n -丙基沒食子兒茶素沒食子酸酯（紅色曲線）。試樣二次熒光衰減率通常取決于使用熒光染料的不同而不同，即使在相同的條件下觀察。為特定的應(yīng)用提供具有最低的衰落速度選擇熒光染料，可以通過以下方式獲得了最好的結(jié)果。這個(gè)概念示于圖5（b）三種熒光染料若丹明（黃色曲線）的花青染料Cy3（紅色曲線），F(xiàn)ITC（綠色曲線），其中比較有袋類腎細(xì)胞衰落速度的差異。若丹明，一個(gè)無處不在的染料有許多應(yīng)用程序，顯示一個(gè)非常緩慢的的褪色速率（圖5（b），黃色曲線）在這些條件下是最好的熒光染料在使用本系統(tǒng)的顯微攝影。

為進(jìn)一步減少衰落，最好是在一個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的試樣進(jìn)行初步觀察，然后快速移動(dòng)到“新鮮”字段以曝光之前。這種做法可能會(huì)有助于規(guī)避漂白和/或褪色效果。這也有利于做到既在部分黑暗的房間環(huán)境的觀察和顯微攝影。雖然化學(xué)方法和細(xì)致的顯微鏡可以減少漂白，最有效的補(bǔ)救措施是提高檢測靈敏度（加上激發(fā)能量減少）使用微光CCD數(shù)碼相機(jī)專為熒光顯微鏡。

漂白的發(fā)生，導(dǎo)致被稱為FRAP，這是一個(gè)縮寫，漂白后熒光恢復(fù)的技術(shù)。這種技術(shù)是基于激光短脈沖串和隨后的恢復(fù)引起的熒光染料擴(kuò)散到漂白區(qū)域的熒光觀察漂白時(shí)。

阻擋過濾器的設(shè)計(jì)，吸收特定波長的激發(fā)輻射的反射或傳輸，試樣，并且只發(fā)送選擇的可見光熒光。屏障過濾器的截止波長范圍內(nèi)是至關(guān)重要的，因?yàn)樵谠S多情況下，它必須能夠發(fā)送不遠(yuǎn)處值用來照亮試樣的激發(fā)光的可見光的波長。因?yàn)槟な欠浅Ｃ舾械淖贤夂涂梢姽獠ㄩL在380-450納米的區(qū)域，它是特別重要的屏障過濾器阻止在此范圍內(nèi)的所有不想要的波長。更短的波長，以保證除去額外的紫外線阻斷過濾器，如柯達(dá)雷登過濾器數(shù)字2A，2B或2E，應(yīng)加入的光學(xué)路徑。所有這些濾波器完全吸收紫外線，但其較低的波長可見的藍(lán)色光的吸收有少許差別。補(bǔ)充紫外線過濾器的主要屏障過濾器之前，應(yīng)放置在光路中，以阻止輻射可能誘發(fā)自體熒光的主要屏障過濾器，特別是如果這種過濾器是黃色，橙色或紅色。如果阻擋過濾器切斷的頻譜在太長的波長，試樣的熒光顏色將受到影響，并可能會(huì)受到影響，尤其是當(dāng)只有通過過濾器的長波長部分的透射熒光圖像的光線強(qiáng)度。

熒光顯微攝影的色彩平衡中的錯(cuò)誤，可能有許多的起源。圖6中的顯微照片示出了一些問題時(shí)，從自體熒光和不正確的過濾過程中出現(xiàn)的顏色退化的熒光照明下的成像標(biāo)本。樣品是單層成纖維細(xì)胞在組織培養(yǎng)中生長和彩色與7 - 氨基-4 - 甲基香豆素-3 - 乙酸（AMCA），明亮的紫外線興奮的染料共軛體的發(fā)光波長為445納米的最大（在短期波長藍(lán)色區(qū)域）。AMCA的最佳激發(fā)波長為345納米的，這需要通過一個(gè)顯著量的紫外光的激發(fā)濾光片。在適當(dāng)條件下的照明和過濾，出現(xiàn)染色標(biāo)本染色細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分豐富的和深藍(lán)色的顏色（用Olympus吳濾波器的多維數(shù)據(jù)集的成像），圖6（b）所示。當(dāng)太多的紫外線光通過的屏障過濾器被使用時(shí)，一個(gè)藍(lán)色的演員和背景顏色經(jīng)常是存在的試樣（圖圖6（a）所示），次級(jí)熒光顏色的顯微照片中的退化。配售輔助紫外線和/或短的藍(lán)色波長屏障過濾器，在顯微鏡的光學(xué)路徑的某處，是緩解這一問題的首選方法。

用熒光染料染色的標(biāo)本往往會(huì)產(chǎn)生不希望的量，特別是短波長的藍(lán)色自體熒光染色組織切片。正如上文所述，該自體熒光必須被吸收的屏障過濾器，以避免二次熒光發(fā)射的熒光染料標(biāo)記的試樣所產(chǎn)生的降解。柯達(dá)雷登濾波器2A和2E，吸收短波長的藍(lán)色輻射，是適于在本申請(qǐng)中使用。顯微鏡制造商和售后市場供應(yīng)商也提供微調(diào)截止屏障過濾器的過濾器非常有用。

安裝媒體的內(nèi)在的自體熒光，也可引起不同的問題與圖6（a）中所示的顯微照片。許多流行的永久安裝的培養(yǎng)基配方表現(xiàn)出不希望的副作用的自體熒光，并且不應(yīng)該被用于熒光定量工作。相反，臨時(shí)裝片用純甘油，甘油 - 水混合物，或無熒光浸泡的油被用來制作標(biāo)本。顯微鏡制造商提供專業(yè)的光學(xué)矯正的目標(biāo)，這些目標(biāo)的標(biāo)本觀察甘油。自體熒光產(chǎn)生的安裝媒體通常為淡藍(lán)色或綠色，并會(huì)導(dǎo)致退化的二次熒光標(biāo)本。如果屏障過濾器不會(huì)刪除多余的安裝媒體所產(chǎn)生的自發(fā)熒光，有時(shí)柯達(dá)雷登色彩補(bǔ)償濾鏡可以添加的途徑來緩解這一問題。（黃色）CC20Y通過使用一個(gè)過濾器，例如，可以除去大多數(shù)媒體所產(chǎn)生的淡藍(lán)色和淡綠色熒光可以與CC20M（品紅）濾波器中。使用更高密度的過濾器（CC30及以上），往往會(huì)導(dǎo)致二次熒光吸收。

自體熒光的細(xì)胞和組織文化展出往往能限制的能力來檢測熒光探針在染色和固定制劑。固定的組織所顯示的自體熒光的程度往往會(huì)有所不同，這取決于樣品制備和使用的實(shí)驗(yàn)條件下檢測熒光。黃素輔酶（FAD和FMN）和減少吡啶核苷酸（NADH）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自體熒光的主要來源。二次熒光熒光染色植物細(xì)胞往往掩蓋了自發(fā)熒光木質(zhì)素（綠色自發(fā)熒光），如葉綠素（紅色自發(fā)熒光）和卟啉。有時(shí)可以克服這個(gè)問題可以與固定的細(xì)胞和組織的0.1％的溶液與硼氫化鈉的磷酸鹽緩沖生理鹽水30分鐘染色前徹底清洗。

當(dāng)用于染色標(biāo)本的發(fā)色團(tuán)的波長的吸收和發(fā)射光譜的激發(fā)和/或發(fā)射波長的濾光片不匹配，則次級(jí)熒光通常會(huì)受到影響，如在圖6（c）所示。在此示例中，一個(gè)不正確的發(fā)射具有過短的波長截止濾波器被用來傳遞由樣品發(fā)出的熒光二次。因?yàn)榇蠖鄶?shù)的這種熒光的光譜在藍(lán)色區(qū)域（455納米）為中心，只有泥濘的紅長波長的色調(diào)通過過濾器。要更正此問題，一個(gè)新的障礙，應(yīng)選擇過濾器。彩色膠片曝光過度，可以沿著互惠的錯(cuò)誤，也會(huì)造成最終圖像中的二次熒光顯著的顏色變化。

對(duì)比度錯(cuò)誤經(jīng)常出現(xiàn)配置錯(cuò)誤或錯(cuò)誤的過濾器組合使用時(shí)，在熒光顯微鏡，光學(xué)顯微鏡火車。這些錯(cuò)誤的幾個(gè)在圖7中，這說明所造成的的激發(fā)濾光片不當(dāng)選擇和熒光浸油二次熒光圖像的對(duì)比度差。標(biāo)本是一個(gè)橫截面的日本楓樹葉柄使用奧林巴斯全身振動(dòng)過濾立方體一個(gè)的螢石10倍目標(biāo)進(jìn)行自體熒光成像。在理想的條件下，在圖7（b）中呈現(xiàn)的圖像，將通過以下方式獲得。然而，當(dāng)激發(fā)光濾光片有太大的帶寬（允許不需要的波長通過），圖像失去的對(duì)比結(jié)果在圖7中所示的顯微照片（一）。選擇正確的過濾器的組合，需要了解的發(fā)色團(tuán)（次）用于染色試樣的激發(fā)和發(fā)射光譜的值。在這種情況下，激發(fā)光濾光片通過波長550納米，由試樣發(fā)出的熒光，并嚴(yán)重地影響圖像的對(duì)比度與綠色二級(jí)干擾。

控制在熒光顯微鏡標(biāo)本的對(duì)比需要，所有光學(xué)元件的自體熒光的顯微鏡，他們不應(yīng)該顯著程度的散射光。這包括內(nèi)部的玻璃鏡片，鏡，過濾器，和分光鏡。目標(biāo)應(yīng)提供高的圖像質(zhì)量，同時(shí)高效率地傳輸光下降到近紫外范圍內(nèi)。過濾器必須發(fā)送所需的波長，同時(shí)阻止其他可能會(huì)干擾觀察二次熒光。因?yàn)榧ぐl(fā)光比樣品熒光強(qiáng)度大得多，完全消除這種光的熒光圖像的任務(wù)是不是很容易，需要仔細(xì)選擇激發(fā)波長范圍窄（通常為10至75納米的過濾器組合提供帶寬）。當(dāng)使用高數(shù)值孔徑的浸沒目標(biāo)時(shí)，至關(guān)重要的是，浸油污染物，可能會(huì)表現(xiàn)出熒光。圖7（c）舉例說明了自體熒光浸油產(chǎn)生的對(duì)比度差。盡管浸油的使用有助于提高圖像的亮度，部分地通過消除不確定的光的損失所造成的反射表面（特別是，蓋玻片和玻璃透鏡元件），熒光誘導(dǎo)自體熒光的混合不需要的波長的污染物，與從二次熒光標(biāo)本。這有增亮的同時(shí)，降低了圖像的對(duì)比度，這兩者都是不希望的背景的不幸結(jié)果。

文物在樣品制備，也將產(chǎn)生對(duì)比的問題，在熒光顯微鏡。早期的先驅(qū)熒光常常利用非特異性的熒光染料，由于這樣的事實(shí)，染料分子被隨機(jī)地分布在整個(gè)試樣的非常明亮的圖像。新的改進(jìn)和高度特異性的熒光染料的熒光技術(shù)已導(dǎo)致染色的目標(biāo)地區(qū)，具有明顯弱于熒光染料結(jié)合少得多，因?yàn)闃?biāo)本展出。這些新的方法，需要更仔細(xì)的樣品制備，以避免不必要的熒光文物。染色前部的非熒光染料中的檢體競爭結(jié)合位點(diǎn)的選擇性熒光染料，以幫助它往往是有幫助的。標(biāo)本應(yīng)徹底清洗，除去未結(jié)合的熒光，放置在酸前清洗玻璃非熒光顯微鏡載玻片。通過加入化學(xué)添加劑，以減少光漂白的熒光染料的環(huán)境中優(yōu)化有助于減少或消除試樣衰落。此外，重要的是仔細(xì)選擇安裝介質(zhì)的化學(xué)成分和pH值，以獲得最佳的圖片，次級(jí)熒光。也應(yīng)該是無熒光的蓋玻片和浸油，如上所述。

自體熒光和/或試件的固有特性的結(jié)果，或通過染色中的錯(cuò)誤可能會(huì)發(fā)生非特異性熒光。典型的這種類型的錯(cuò)誤在圖8（a）中示出，其示出了大鼠結(jié)腸組織染色的薄截面的混合物的熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）和4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI） 。在顯微照片的整體偏藍(lán)是由于自體熒光和非特異性熒光的組合，由于與DAPI熒光染料overstaining。適當(dāng)?shù)膬煞N染料染色，然后徹底洗滌后的試樣的結(jié)果列于圖8（b）的顯微照片。類似于圖8（a）中所示的錯(cuò)誤所造成的使用太廣泛的激發(fā)帶寬，可以得到糾正，有較窄的帶寬的使用的過濾器的一個(gè)可逆的錯(cuò)誤。另外，激發(fā)濾光片的組合可以有選擇地產(chǎn)生一組特定的波長，或屏障過濾器可以進(jìn)行調(diào)整，以通過只有較長的波長。圖8（c）顯示大鼠結(jié)腸薄切片染色時(shí)正常，但現(xiàn)在缺乏一個(gè)紅色在光學(xué)通路抑制濾波器引起的淡紅色背景。這個(gè)錯(cuò)誤可以被放置在光路中的適當(dāng)?shù)囊种茷V波器校正。

熒光顯微攝影還患有其他形式的光學(xué)顯微術(shù)和顯微攝影遇到的常見問題。這些措施包括光學(xué)和膠片平面，顯微鏡立場振動(dòng)，灰塵和碎片的污染，曝光不足，曝光過度，色彩平衡錯(cuò)誤，鏡面反射（常見的長時(shí)間曝光和架空室內(nèi)照明）之間的焦距調(diào)整不當(dāng)引起的聚焦誤差，漸暈，和光學(xué)顯微鏡誤配準(zhǔn)。這些錯(cuò)誤的例子在我們的一節(jié)題為“ 熒光顯微攝影與彩色投影膠片的錯(cuò)誤，在顯微攝影節(jié)的奧林巴斯顯微鏡資源中心顯微鏡底漆。

熒光顯微攝影的相機(jī)和膠卷 -薄膜技術(shù)的改進(jìn)提高膠片的速度和分辨率的改善，但也有沒有彩色膠片目前唯一適用于熒光顯微攝影。單獨(dú)的彩色膠片的特定屬性，包括單獨(dú)的乳劑層的特性曲線屬性耦合的染料，和用于熒光激發(fā)和發(fā)射的光的光譜響應(yīng)往往相差很大，從膜膜，有時(shí)很難控制和再現(xiàn)。這些問題導(dǎo)致難以維持準(zhǔn)確的色彩渲染和曝光使用膠片的彩色顯微攝影。

是復(fù)雜的熒光的標(biāo)本的亮度范圍內(nèi)的事實(shí)，通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于可準(zhǔn)確地記錄在膠片曝光測量的熒光顯微照相。過分的亮點(diǎn)，將導(dǎo)致失去精致的細(xì)節(jié)和色彩飽和度，曝光不足而產(chǎn)生很暗的圖像不顯示功能，隱藏在陰影區(qū)域。要么過度或曝光不足的背景下，這通常是非常暗色或黑色的，不作為關(guān)鍵。三種主要方法被利用，以確定曝光時(shí)，使用熒光性：亮度測量的CCD，光電二極管或光電倍增管，在曝光過程中連續(xù)測量（光電倍增管），和最不理想的方法，試驗(yàn)和錯(cuò)誤。設(shè)計(jì)用于熒光的的現(xiàn)代顯微攝影系統(tǒng)的設(shè)施的能力來衡量的照明強(qiáng)度，并計(jì)算基于該讀取的曝光時(shí)間。對(duì)于常規(guī)熒光顯微攝影，有些相機(jī)有決定曝光時(shí)間硅藍(lán)色探測器的細(xì)胞，而另一些光電倍增管計(jì)量探測器測量極其微弱的標(biāo)本。

重要的是要考慮幾個(gè)因素，在選擇的檢測器系統(tǒng)用于熒光顯微攝影。這些包括檢測器的噪聲電平的信號(hào)與噪聲之比的圖像，空間和時(shí)間分辨率，幾何失真，線性度，和光譜靈敏度。在確定正確的曝光熒光標(biāo)本，最好是使用相機(jī)的CCD或光電倍增測光系統(tǒng)，能夠精確的低光測量。點(diǎn)測光的能力是有價(jià)值的實(shí)際測量面積的熒光，沒有不想要的測光通常黑暗的背景包圍的熒光的材料。另一種技術(shù)涉及到使用的曝光調(diào)節(jié)控制，以減少曝光時(shí)間，否則將被過分延長測量的視場的黑暗背景。在這方面，奧林巴斯和尼康相機(jī)有內(nèi)置的算法，減少暴露，如果將相機(jī)設(shè)置為熒光模式。當(dāng)光線不足的（通常大部分的時(shí)間用熒光），設(shè)置發(fā)送所有的光三目棱鏡膜面減少曝光時(shí)間。

在理想的情況下，點(diǎn)測光應(yīng)包括顯微攝影系統(tǒng)，以幫助確定曝光時(shí)只有幾個(gè)明亮的物體是可見的，否則黑暗的背景上。在整個(gè)視場對(duì)于集成光測量的，沒有點(diǎn)測光，曝光時(shí)間應(yīng)削減一半或計(jì)量讀數(shù)的四分之一（在一個(gè)黑暗的背景上分散的熒光物體），暗視野顯微鏡的情況很像。如果點(diǎn)測光的光傳感器是在一個(gè)固定的位置的視在中間，試樣必須首先被移動(dòng)到視野中心，以獲得合適的曝光測量的區(qū)域，然后移往組成的顯微照片。高端相機(jī)系統(tǒng)允許翻譯點(diǎn)測光傳感器，使顯微鏡曝光測量前確定顯微照片組成。定位后的試樣進(jìn)行顯微攝影，點(diǎn)測光傳感器可以被移動(dòng)到最亮的區(qū)域曝光測量的視場中，不影響試樣。當(dāng)使用點(diǎn)測光，使熒光物體一定是大到足以填補(bǔ)當(dāng)場記錄準(zhǔn)確的曝光讀數(shù)。

一些顯微攝影的攝像系統(tǒng)提供一個(gè)永久的上演的光的一部分的分束器組件，光度計(jì)，它允許在實(shí)際曝光過程中的光測量，以補(bǔ)償衰落。這是一個(gè)方便的方法來調(diào)整曝光時(shí)間，以避免光漂白工件的飛，但它的缺點(diǎn)下減少向膜的光強(qiáng)度，因此需要更長的曝光時(shí)間。更先進(jìn)的計(jì)算機(jī)輔助攝像系統(tǒng)能夠方便地存儲(chǔ)在計(jì)費(fèi)系統(tǒng)的存儲(chǔ)器中的預(yù)編程的查找表，以補(bǔ)償通過互易律失效和衰落。倒易律失效的相機(jī)系統(tǒng)電腦自動(dòng)修正工作將根據(jù)以下公式來計(jì)算曝光：

T_c是校正后的曝光時(shí)間，T _m是計(jì)量時(shí)間（未校正）， 和p是從安置在系統(tǒng)的查找表的單個(gè)膜的互易值確定的常數(shù)。此系統(tǒng)是有限的數(shù)量和類型，計(jì)費(fèi)系統(tǒng)的初始編程過程中被添加到查找表膜的互惠數(shù)據(jù)。

沒有的整體測光系統(tǒng)，確定曝光時(shí)間必須由試錯(cuò)。此方法涉及在不同的曝光時(shí)間，通過加強(qiáng)遞增一個(gè)半到一個(gè)完整的f制光圈（包圍）的一系列的試驗(yàn)曝光。處理后的電影，曝光，產(chǎn)生最好的結(jié)果仔細(xì)說明，并提供進(jìn)一步的顯微攝影使用相同的顯微鏡配置的基礎(chǔ)。標(biāo)本的照明或顯微鏡設(shè)置的更改將需要另一系列的曝光括號(hào)來確定新的最佳曝光時(shí)間。如果只的物鏡放大倍率改變時(shí)，新的曝光時(shí)間，可以計(jì)算出與先前記錄的括號(hào)數(shù)據(jù)。許多顯微攝影做熒光顯微鏡支架的風(fēng)險(xiǎn)，無論是過去，由三個(gè)或更多的時(shí)間間隔下，做出一定的，他們將爭取在一個(gè)正確的曝光設(shè)置。保持良好的書面記錄曝光及相關(guān)設(shè)備的數(shù)據(jù)可以減少或消除需要未來的包圍。決定曝光時(shí)使用的試驗(yàn)和錯(cuò)誤的方法，它是明智的連續(xù)監(jiān)測顯微鏡燈泡輸出偏差照明燈老化發(fā)生。使用這種方法確定曝光的顯微鏡往往依賴于單反相機(jī)拍攝以熒光照明。有了這些相機(jī)在曝光過程中快門和取景鏡，運(yùn)動(dòng)可能會(huì)引起振動(dòng)，導(dǎo)致不清晰的圖像。此問題通?？梢酝ㄟ^使用遙控快門開關(guān)和/或提高反射鏡前曝光規(guī)避。在某些相機(jī)，自拍定時(shí)器操作的發(fā)行的反射鏡，它允許振動(dòng)停止曝光之前的時(shí)間。

顯微鏡配備專門為熒光照明往往有在系統(tǒng)或照明系統(tǒng)的分劃板調(diào)焦望遠(yuǎn)鏡，使顯微鏡可視化顯微照相光柵疊加在隱約可見標(biāo)本靠住一個(gè)非常黑暗的背景。奧林巴斯和尼康都在他們的高端顯微鏡，提供了選擇的十字線和電影幀顏色查看標(biāo)本提供光罩。顯微鏡可以選擇紅色或黃色的照明分劃板。紅色的光環(huán)維持觀察者的眼睛的暗適應(yīng)具有的優(yōu)點(diǎn)，在藍(lán)色和綠色的二次熒光觀察時(shí)，提供了極好的對(duì)比度。對(duì)于紅色熒光并同時(shí)相襯或DIC時(shí)，應(yīng)選擇黃色標(biāo)線片，以最大限度地提高對(duì)比度。一些制造商提供了一個(gè)與照明取景光罩，調(diào)焦望遠(yuǎn)鏡自動(dòng)相機(jī)外殼的重視，并允許在黑暗背景場的拍框尺寸觀看。

當(dāng)選擇膜熒光顯微攝影，電影速度（ASA或ISO等級(jí)）是一個(gè)變量，應(yīng)慎重考慮。ISO等級(jí)越高，在其他條件相同的情況下，要登記在膠片上獲得滿意的圖像的光量越少。熒光顯微鏡中使用的照明光源需要日光平衡的膠片乳劑準(zhǔn)確地呈現(xiàn)標(biāo)本二次熒光顏色。大多數(shù)主要的電影制造商提供了廣泛的日光片在不同的ISO評(píng)級(jí)透明度和彩色負(fù)片格式。柯達(dá)日光EKTACHROME柯達(dá)克羅姆ISO 200或400或200，都在35毫米大小，正面的透明薄膜，顯示足夠的速度，良好的色彩還原和接受的解決辦法。提供FUJICHROME PROVIA在400和1600的ISO等級(jí)，是一個(gè)極好的透明膠片的色彩飽和度和分辨率方面。其他廠家做比較透明膠片，但我們建議避免使用彩色負(fù)片，如果在所有可能的。

對(duì)于黑白膠片，柯達(dá)提供了T-MAX 400，中粒膜，這是一個(gè)最好的熒光應(yīng)用的一個(gè)很好的罰款。一些黑白膠片標(biāo)準(zhǔn)彩色負(fù)片化學(xué)品（**1）可以處理。其中包括T-MAX 400CN，柯達(dá)KODAK ADVANTIX和Ilford XP-2超級(jí)，提供所有這一切都是在ISO 400的評(píng)級(jí)。請(qǐng)記住，更快的膜允許更短的曝光時(shí)間的增加晶粒尺寸在犧牲。表2列出了基本的膜的性能，以供參考。

相比之下，在熒光顯微攝影的最關(guān)心的問題之一，不僅依賴于顯微鏡的配置，而且還取決于所選擇的膜的物理特性，由熒光染料的發(fā)展過程中，曝光的詳細(xì)信息，以及檢體本身相對(duì)于染色的效率漂白或褪色。顏色透明薄膜可以由一個(gè)或幾個(gè)光圈值（獎(jiǎng)金考慮互惠褪色時(shí)）曝光不足，然后將處理在第一顯影劑增加對(duì)比度和色彩飽和度的處理時(shí)間延長。許多黑白膠片可以產(chǎn)生相反的變化，依賴于開發(fā)混合條件和處理時(shí)間。膜熒光顯微攝影決議確定主要由光學(xué)顯微鏡（主要是物鏡的數(shù)值孔徑），以及它是如何配置的參數(shù)，但也有點(diǎn)依賴電影的特點(diǎn)和發(fā)展方式。然而在實(shí)踐中，電影的分辨率只有成為一個(gè)因素顯微鏡時(shí)沒有表現(xiàn)最佳的ISO感光度是如此之高，糧食成為一個(gè)因素。

數(shù)字成像技術(shù)的最新進(jìn)展，已經(jīng)徹底改變了捕獲使用電荷耦合器件（CCD）的顯微照片。當(dāng)成像乘熒光染色標(biāo)本，數(shù)碼相機(jī)提供了一個(gè)很好的解決方案，并正在迅速成為許多photomicrographers的首選媒體。三芯片集成彩色CCD攝像機(jī)的價(jià)格已經(jīng)下降到一個(gè)合理的范圍，并耦合到的幀接收器或數(shù)字視頻卡和計(jì)算機(jī)時(shí)，提供了一個(gè)極好的方法，收集，進(jìn)行數(shù)字化處理，編輯，存儲(chǔ)熒光圖像。

很多標(biāo)本必須顯示弱熒光高性能CCD探測器規(guī)格。目前，最好的選擇是背照式的框架或隔行傳輸設(shè)備，它配備了散熱片和/或外部冷卻水庫。這些相機(jī)有很多的量子效率接近或超過90％，并允許多個(gè)圖像讀出之前的連續(xù)收購。從一到五秒鐘運(yùn)行的圖像采集周期，根據(jù)讀出速率，視頻采集參數(shù)，CCD分辨率。符合這些規(guī)范的一個(gè)典型的CCD相機(jī)是的光電子 MagnaFire數(shù)字成像攝像系統(tǒng)專為科學(xué)應(yīng)用程序。該相機(jī)具有3英寸SONY ICX085AL隔行傳輸CCD數(shù)組的大小為1300×1030像素尺寸為6.7微米（平方米）。60分貝動(dòng)態(tài)范圍的信號(hào)-噪聲比，文件的位深度為24，32或48位顏色，每個(gè)像素/秒的有16000電子阱的深度的4個(gè)電子的暗電流，并增強(qiáng)了相機(jī)的性能密封氣體珀?duì)柼鸆CD冷卻。彩色圖像的形成是通過多個(gè)光學(xué)玻璃分色彩色濾光片。達(dá)等廠商也提供了廣泛的適用于幾乎每一個(gè)需要熒光和常規(guī)光學(xué)顯微鏡的數(shù)碼相機(jī)（如圖9所示），一個(gè)典型的CCD相機(jī)。

以下幾點(diǎn)總結(jié)熒光顯微攝影的重要方面。

• 使用高數(shù)值孔徑物鏡配備近紫外光是透明的玻璃或石英透鏡。另外，用最低的放大投影鏡頭成為可能，以限制總的放大倍率。

• 透射光的熒光反射光熒光首選。如果這是不可能配置的反射光顯微鏡，使用透射光的暗視野冷凝器。

• 優(yōu)化通過仔細(xì)選擇膜參數(shù)，配置適當(dāng)?shù)娘@微鏡標(biāo)本的對(duì)比，并通過精心選配生色激發(fā)適當(dāng)?shù)募?lì)和阻隔過濾器和二次熒光性能。

• 從光路取出三目分束器的棱鏡，在曝光過程中，使100％的光到達(dá)膠片平面。還可以使用35毫米膠片，避免更大的電影格式。

• 選擇日光平衡透明度薄膜試樣顏色，分辨率和對(duì)比度的最佳演繹。推過程的透明度薄膜增強(qiáng)對(duì)比度和色彩飽和度。

• 光源必須提供高強(qiáng)度輻射的頻譜很窄的范圍內(nèi)，一般在10和50納米。最好的選擇是氙氣和汞蒸氣燈或調(diào)諧到特定波長的激光。

• 顯微鏡的光學(xué)列車，包括透鏡，反射鏡，過濾器，分光鏡，浸泡媒體，顯微鏡載玻片和蓋玻片，應(yīng)該是免費(fèi)autofluorescing組件。

• 如果不觀看或攝影熒光標(biāo)本，阻止激發(fā)光漂白，使用過濾器的滑塊或快門照明避免試件破壞。

• 總是提供一個(gè)熱過濾器之間的照明器和熒光過濾器，這可能是多余的熱量損壞。

• 監(jiān)控?zé)糸W爍的跡象，并更換時(shí)，光照強(qiáng)度變得不均勻。保持適當(dāng)?shù)目评照彰鳠艉痛怪闭{(diào)整照明。

• 仔細(xì)準(zhǔn)備標(biāo)本染色后徹底清洗并去除多余的發(fā)色團(tuán)。

總之，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)大，在許多醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室。熒光顯微鏡的主流已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)幾乎完全轉(zhuǎn)變，從利用透射光入射光，伴隨著許多新的和不同的熒光染料通過引入。這已經(jīng)促使許多新的和多樣化的熒光顯微鏡應(yīng)用的動(dòng)力。