徠卡顯微鏡：如何定義收集特定探頭發(fā)射的波段

由分束器或色散元件。來分隔多個排放量由它們的顏色，不同顏色的光，*引導(dǎo)到不同的空間方向，到達傳感器之前，引入帶通濾波器，以減少串音或刪除任何剩余激發(fā)光。經(jīng)典的，則此任務(wù)已離開共同的玻璃基帶通濾波器。***的設(shè)計使用光度計滑塊的多波段組件- SP的探測器。這個概念允許極其高效的感應(yīng)發(fā)射光，并同時提供了完整的可調(diào)諧。一個“副作用菜”選擇要錄制光譜掃描。有其他光譜的記錄裝置，根據(jù)由檢測元件的陣列的固定頻帶，但它們是不可調(diào)整的，較不敏感的。

圖 1：經(jīng)典的帶通濾波器的基礎(chǔ)上染色玻璃或干擾涂料。要更改的檢測頻帶，必須對過濾器進行交換。這需要很多的過濾眼鏡和一個機動的交換設(shè)備（?fotovika - Fotolia.com）。

從整個頻譜中選擇所需波段的一個完全不同的方法是使用機械裝置，折疊帶頻譜。如果光通過色散元件（棱鏡或光柵）中，組件的空間取決于他們的能量傳播。光子的能量對應(yīng)的顏色。在簡單的情況下，所得到的頻譜是一個白色的表面投影到可視化。很長一段時間，相紙被用于文檔和量化。如今，數(shù)字相機芯片實現(xiàn)光譜（分光器），用于查看和分析。

另外，也可以通過插入一個機械狹縫的白色表面的位置，并測量所傳輸?shù)哪芰浚x擇一個從整個頻譜的窄頻帶。的狹縫的位置可移到頻譜的能量分布（光譜儀）的位置的函數(shù)，然后測量。

為了測量整個發(fā)光物種的能量，其特征是它的顏色，一個可以打開的狹縫中間處，使窗口覆蓋發(fā)射和拒絕其他部分的光譜。這樣的裝置，它具有帶通濾波器在中心頻率和帶寬的優(yōu)點，可調(diào)諧性 - 它包括任何（單體），可以設(shè)計在給定的頻譜的帶濾波器的電勢。用適當(dāng)?shù)膫鞲衅鳎≒MT或路政署）相結(jié)合，這樣的設(shè)備是*通用的探測器共聚焦顯微鏡（*敏感的為好）。

正如到目前為止所描述的，這樣的頻帶光譜儀可以作為一個單通道實驗。然而，現(xiàn)代的熒光在生物醫(yī)學(xué)研究需要同時記錄多個通道。巧妙地解決了這個任務(wù)的解決方案是通過級聯(lián)機械狹縫裝置。在這種多頻帶檢測系統(tǒng)（進一步稱為“SP檢測器”），機械狹縫元素被表示為高反射鏡。的狹縫，將發(fā)送*信道所需的波長帶，但頻譜的其余部分被引導(dǎo)，幾乎沒有損失，隨后，再次有反射鏡滑塊頻帶選擇的檢測器。從理論上講，一個無限數(shù)目這種級聯(lián)的頻帶探測器是可能的。對于現(xiàn)實的原因，目前器件具有多達5個傳感器。

這個概念的美是高效率（狹縫傳輸100％，反映99％）和獨立自由光譜可調(diào)諧的所有頻段。此外，每個通道都配有它自己的傳感器，允許獨立的電子放大和基線設(shè)置。

圖2：SP探測器采用高傳輸性能和白色玻璃棱鏡。被分離成頻帶的頻譜通過可動反射鏡滑塊。這允許在任何可能的子集光譜，然后記錄，可作為檢測信道的頻譜被分割。

引入后的SP檢測器，以及其他的設(shè)計被出版，試圖匹配的多頻帶的方法的好處。其中之一采用陣列檢測器，通常多陽極的光譜投射到其上的光電倍增管。雖然這些設(shè)備有可能增加記錄的信號的數(shù)目，更簡單地說，它們具有顯著的缺點：多陽極數(shù)組的使用減少由于分部必要的機械分離收集的光子。他們遭受的光學(xué)和電子串?dāng)_，他們沒有辦法提供單獨調(diào)整放大功率。本質(zhì)上是固定的頻帶，即不可調(diào)的，因此沒有適應(yīng)各種今天所使用的熒光染料的發(fā)射特性的影響 - 在今后不斷增加的復(fù)雜性的。設(shè)備不輸出信號被分配到各個排放種類，但只是固定的頻譜的分?jǐn)?shù)。因此，它們強制元分解算法，以獲得有意義的信道數(shù)據(jù)的裝置所記錄的數(shù)據(jù)的后處理。（配SP檢測器，信號分配給發(fā)射物種，解混一個選項來清除剩余的重疊在這里）。

陣列檢測器也強制要求的發(fā)射光譜線性色散。因此，采用棱鏡陣列檢測器的系統(tǒng)中是不可能的。出于這個原因，光柵被使用，它在性能上有重大的缺點。光柵沒有平面（白）輸出，但發(fā)揮*大閃耀波長。因此被低估更長和更短的波長收集的數(shù)據(jù)。光柵也強烈依賴于偏振的，非偏振光的（這是典型的生物熒光發(fā)射）的效率降低約50％-70％（于表現(xiàn)*好的顏色）。已作出嘗試修復(fù)這個缺陷與額外的光學(xué)元件。光柵的第三個問題是輸入能量的事實，不僅在一個單一的光譜，也可進入^第 0 階和高階的光分散，釋放。這就降低了整體的效率，在所有光柵。在這里，已經(jīng)引入了附加的光學(xué)裝置，為了解決這個問題。

在這些設(shè)備都是基于記錄光譜的想法。然而：不需要熒光成像光譜進行記錄，非常罕見的情況下除外。低效獲得的光譜需要重新計算提供有意義染料信息。SP探測器不會受到高階損失，也不偏振依賴性。它提供了完全可調(diào)的檢測帶，個別放大。它允許線性分解的情況下，這是有益的， -作為一個額外的好處-它可以記錄在高分辨率光譜。

圖 3：單獨的點式探測器（SP檢測器）允許調(diào)整樣品中的各種染料的排放量中的動態(tài)差異。檢測窗口可調(diào)的動態(tài)范圍是單獨的適應(yīng)性（多陽極陣列解決方案相反）。

在過去，熒光顯微鏡，幾乎總是配備玻璃屏障過濾器過濾器。非常早期的熒光顯微鏡透射系統(tǒng)建成，也就是說，它們在透射光下操作。這種技術(shù)完全取代落射光束路徑（入射光）。入射光的系統(tǒng)有一個更好的激發(fā)和發(fā)射的分離，這是一項重要的要求，作為熒光的光只有約10 ^-4 10 ^-10倍的照明。屏障過濾器必須滿足兩個任務(wù)：*，盡可能阻止盡可能多的寄生光（剩余激發(fā)光路徑達到檢測樣品中由于反射或光學(xué)元件）。其次，阻擋過濾器是用來進一步縮小所收集的色頻帶的信道信號，以提高特異性，如果樣品中含有多個熒光物種（減少串?dāng)_）。

玻璃過濾器可以由染色玻璃材料，這是可以在許多不同的顏色。然而，染色玻璃的性能取決于所使用的化合物，沒有選項設(shè)計以外的各種化學(xué)品的混合，接近所需的傳輸特性的光譜特性。設(shè)計更加靈活，是基于干涉效應(yīng)的多層膜沉積在透明玻璃的過濾器。這種涂層提供的選項設(shè)計更多或更少的任何可見光譜內(nèi)的帶通。更復(fù)雜的涂料可以作為多頻帶過濾器，具有三個或四個波段的傳輸與反射部分之間，允許多個激發(fā)和檢測。

雖然*的多層鍍膜技術(shù)上*，此類設(shè)備的限制是他們的intunability。以服務(wù)為眾多的染料和染料組合，一個系統(tǒng)必須配備這種過濾器具有將被插入到光束路徑根據(jù)需要，通過手動或電動操作的集合。這使得基于過濾器的系統(tǒng)非常靈活，慢慢適應(yīng)。