徠卡顯微鏡：共聚焦顯微鏡的來源白光激光束

共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想光源應(yīng)如何執(zhí)行？它應(yīng)具有足夠的強度，可調(diào)諧的顏色同時激發(fā)的一系列樣品。此外，它應(yīng)該是一個脈沖光源壽命熒光實驗。已經(jīng)發(fā)明這種源：白光激光器。它由一個高能量脈沖IR被饋送通過光子晶體光纖的光纖激光器，產(chǎn)生的光譜的連續(xù)。小bandlets選自該連續(xù)的聲光可調(diào)諧濾波器的裝置。該儀器提供足夠激烈，像一個普通的激光束 - 這是衍射極限照明的要求，可調(diào)焦的光。它允許通過頻譜從藍色到紅色的顏色的連續(xù)調(diào)諧。八并行可調(diào)顏色為標準。，它提供了一些額外的好處，這是由于由脈沖的能量發(fā)射。它本質(zhì)上是一種基于單光子熒光壽命成像源。并且它允許抑制在檢測信道的激發(fā)光通過玻璃 - 自由電子發(fā)射濾波。

*連續(xù)譜白光光源

古典激光光源通常只提供一個單一的窄的發(fā)射。某些氣體激光器可以同時發(fā)射了幾行。最**的例子是氬氣體激光器，這可能是有5條線中的藍綠色的范圍內(nèi)。其他類型的激光器，染料激光器一樣，是可調(diào)諧的，但一次只發(fā)射單一的顏色。此外，染料激光器是非常不穩(wěn)定的，需要一定的耐心才能正常運行。有全固態(tài)激光器是可調(diào)諧的，但僅限于紅外范圍（如鈦薩激光器）。除了其高復(fù)雜性和昂貴，他們也可以只發(fā)出單一波長的時間和調(diào)整過程是很慢的（多少秒）。

這種情況已經(jīng)完全改變了本發(fā)明，同時在很寬的范圍內(nèi)發(fā)射的光源，但仍像激光器在可聚焦。

這些源采用了光纖紅外激光發(fā)射光脈沖在大約80兆赫。這種化合物被用于作為“種子”，即提供了一個精確的時鐘，但具有相當(dāng)?shù)偷哪芰?。一個二極管泵浦的激光放大器中放大，其后的脈沖。放大激光也是基于光纖的，兩個系統(tǒng)都無縫耦合光纖熔接。放大器的輸出可能會達到約10 W的紅外光的平均功率，但切碎約脈沖。200 PS在80 MHz。這種高能量的脈沖，最后集中在一個所謂的光子晶體光纖（PCF）的入口表面的。這些纖維具有在纖維的中心的空心管的圖案的。強烈的非線性過程在單色光擴散成一種廣譜達到藍色或什至紫外線管圖案的表面，導(dǎo)致包括群速度色散（最多4 個順序排列），自陡，拉曼散射和等離激元的裂變。

根據(jù)不同的PCF的長度，單色紅外峰頻譜擴散到高達幾百納米。典型的纖維長度為0.5至2米。

圖 1：左：光子晶體光纖橫截面。空心管的中心圖案是復(fù)雜的非線性光子相互作用產(chǎn)生的光子能量廣泛的空間。
右：白色的激光所產(chǎn)生的放大紅外脈沖激光，這是美聯(lián)儲通過光子晶體光纖。PCF是一個堅實的*連續(xù)譜發(fā)生器。連續(xù)體的寬度取決于光子晶體光纖的長度-以及許多其他的工程細節(jié)。所有零件的基于光纖的固有的免維護。通過棱鏡產(chǎn)生的PCF的出口處的頻譜，并投射到一張紙上。

顏色和強度的兩維聲光調(diào)諧

就像在任何其他的顯微鏡，使用白色熒光照明源，白光激光共聚焦顯微鏡[需要一種手段來選擇顏色，具體地激發(fā)各種熒光染料。如果可能，多種顏色是非常有用的并行乘法染色樣品的激發(fā)。在寬視場熒光顯微鏡中，這個任務(wù)是由激發(fā)光濾光片。具有3個或4個傳輸頻帶dichroitic過濾器用于多染色樣品。

從*連續(xù)發(fā)射的光束提供一個更靈活的解決方案。的聲光可調(diào)諧濾波器可以挑選出的頻譜單行（這實際上是一個狹窄的扁帶），并轉(zhuǎn)移到一個不同的方向。頻譜的其余部分將通過晶體直行。由于顏色的扁帶是由機械激發(fā)頻率控制的偏轉(zhuǎn)，從輸入頻譜可以選擇任何顏色的無級可調(diào)。該扁帶的寬度是約1 ... 3納米的波長而定。這樣的細帶中的能量是在幾毫瓦，這是足夠遠成像的和經(jīng)常使用的，即使對于FRAP實驗的范圍內(nèi)。通過添加更多的電子驅(qū)動器，以產(chǎn)生在晶體中的機械波，它是可以直接到1 為了同時一系列顏色。八色同步標準（但不是技術(shù)限制）。這些bandlets中的每一個都是可調(diào)諧的波長和強度。

這種組合使白光激光共聚焦顯微鏡激發(fā)WLL的理想來源。它將為所有已知的染料在可見光范圍內(nèi)激發(fā)，它允許記錄激發(fā)光譜探索新染料的光譜特性，尤其是在原位。和它給自由調(diào)整激發(fā)離峰，如果這是需要的發(fā)射收集的原因或提高分離相鄰的染料。

圖 2：采用的聲光可調(diào)諧濾波器，提取了一系列的各種顏色的bandlets的*連續(xù)譜源的白色發(fā)光?？烧{(diào)諧這些bandlets是在顏色和強度。同時使用了一些bandlets需要并行乘法染色樣品的激發(fā)。

聲光分束（AOBS）可以做的工作

圖 3：只自由可調(diào)諧分束裝置可有效地作為依賴于波長的激發(fā)和發(fā)射閥，用于當(dāng)使用一個可調(diào)諧源。聲光的分束器，可以無級調(diào)節(jié)，同時適應(yīng)任何給定的一系列激發(fā)顏色。

激發(fā)顏色自由可調(diào)性方面非常有利的啟動一個新的挑戰(zhàn)：什么樣的設(shè)備可以喂飽無級調(diào)諧到入射的光的熒光顯微鏡的光路中的光？最簡單的方法是使用一個灰色的分束器，但這將是：總是失去態(tài)激發(fā)能的目標部分的犧牲 - 盡管這是較小的問題。這種方法的嚴重缺點是寶貴的發(fā)射光的損失。即使使用灰分離器80/20（這將浪費的激光能量的4/5）的排放量的五分之一將被犧牲掉。

一個單一的分色鏡，即使有多個頻段，顯然不可能支持一個可調(diào)光源的好處。一個單一的排放慢調(diào)諧的一種方法，已經(jīng)商業(yè)化的非連續(xù)光源。該系統(tǒng)采用了約序列。10二向色反射鏡，將用于在其工作頻率 - 給只有10種，滿分為200的范圍內(nèi) - 而它們也可用于指定的波長的兩側(cè)。這使得一共有30種顏色，但明顯低于**的表現(xiàn)。

這種困境的一個**的補救辦法是使用聲光。聲光可調(diào)諧光束分離器（AOBS）是一種裝置，允許的光路與*過95％的效率，而頻譜的其余部分被引導(dǎo)到不同的方向，被送入一系列的顏色bandlets。在一個多扁帶的可調(diào)諧激光器的情況下，如操作AOBS使得激發(fā)的顏色傳遞順序作為激發(fā)光束路徑的進入1 。 

將被有效地傳遞到檢測路徑的完整的發(fā)射光譜。線程化所需的在樣品上的激發(fā)扁帶的透射光譜中的空隙的扁帶本身（因為它們所產(chǎn)生的相同的技術(shù)）相同的尺寸，同時可控制在它們的位置：只要一個曲調(diào)的激發(fā)顏色，適當(dāng)?shù)钠叫械碾娮诱{(diào)諧相應(yīng)的間隙。無需任何操作者的操作是必需的。

的聲光可調(diào)諧分束器，因此最終的耦合裝置，用于可調(diào)諧多色激發(fā)。

激發(fā)和發(fā)射光譜的強度和熒光壽命

光譜檢測儀（SP）是專為帶寬和完全控制中心檢測到的發(fā)射譜帶顏色。這可以保證*的吞吐量（傳動效率高）和*分離。作為一個副作用，SP檢測器允許記錄的發(fā)射光譜，以及 - （5個通道）可以同時或依次（多達400個），或這兩種方法以混合模式。在過去，被綁定到安裝在系統(tǒng)中的激光器所發(fā)出的幾行的發(fā)光顏色。隨著白光激光器（WLL），情況已經(jīng)完全改變：顏色1nm的精度可調(diào)，順利激發(fā)譜是整個可見光譜。在與SP的檢測器，它能夠適應(yīng)伺服控制的激發(fā)波長的組合，這種測量是完全自動進行。它是合理可行的實施聲光分束器引導(dǎo)激發(fā)和發(fā)射光。

有一個可調(diào)的激發(fā)和一個可調(diào)諧發(fā)射，下一個步驟是創(chuàng)建一個二維的強度相關(guān)的地圖[。這拉姆達方地圖是特別有用的復(fù)雜混合物的熒光染料時，需要分開。這也是一般價值熒光染料時，需要的特點-要么是因為他們的新發(fā)現(xiàn)或設(shè)計，或者是因為由于微環(huán)境條件下，感興趣的頻譜改變。

特點是熒光發(fā)射強度和熒光壽命。要確切衡量壽命，脈沖光源是必需的。幸運的是，白色光的激光是一種脈沖源，脈沖頻率適合的典型的熒光壽命（0.5 ... 5納秒的范圍內(nèi)）的需要。如果需要更長的脈沖間隔，脈沖選擇器降低脈沖頻率。當(dāng)然，白色光可調(diào)諧激光直接呈現(xiàn)終身激發(fā)光譜，包括下一個合乎邏輯的后果：一個二維激發(fā)發(fā)射終身地圖。

圖 4：記錄，可將6個不同顏色的有孔玻璃珠。左：假色由一個激發(fā)發(fā)射λ-方掃描記錄，可在有孔玻璃珠的凸起。右：偽三維視圖的激發(fā)發(fā)光的地圖（熒光橫向）。人們可以很容易地找到六種不同的熒光染料（箭頭）的峰值。

光門 - 全色電子屏障過濾器

最后一件事啟用了*的技術(shù)?；旌咸綔y器（HyDs）非常敏感，快速，覆蓋一個大的動態(tài)范圍。他們提供了一個門控操作模式。在脈沖白光激光的結(jié)合，它是現(xiàn)在可以只在光脈沖之間的時間間隔來檢測熒光發(fā)射 - 只是由門混合檢測器的收集沒有在激光脈沖的信號。然后，檢測到的信號是純熒光，并且不包含任何反射光。這一做法，剩余反射的顏色對抗輕松拿下。有沒有必要限制排放留出了足夠的空間，以激發(fā)顏色集合。它甚至有可能激發(fā)下方直接測量 - 和*越，然后允許反斯托克斯發(fā)射特性。

脈沖和光譜可調(diào)白光激光光源，結(jié)合聲光可調(diào)分束器，可調(diào)SP探測器和門控混合探測器是一個巧妙結(jié)合*的技術(shù)。而且，雖然這句話聽起來可能有點穿，它適合在這里：它***的概念和操作共聚焦顯微鏡。

圖 5：通過門控檢測，也能夠非常有效地，純粹只記錄從樣品中的熒光?；旌咸綔y器（HyDs）作為**的傳感器在這方面。在收集數(shù)據(jù)期間被分配的激發(fā)脈沖，并因此只有發(fā)射的熒光收集。左圖：錄制的綠色熒光激發(fā)后，在492 nm處。排放收集490-600納米。主信號的反射光作為激發(fā)波長為的集發(fā)射頻帶內(nèi)。右圖：相同的激發(fā)波長和發(fā)射集合帶，但光門。沒有反射光被記錄下來。純的和明確的熒光發(fā)射，，不管發(fā)射帶。