奧林巴斯顯微鏡：斜照明的介紹

任何誰曾經(jīng)考察了硬幣，明亮的光線直接觀察該救濟的硬幣表面上是很難看到這些照明條件下，由于從表面的鏡面反射的硬幣。另一方面，當(dāng)入射光被布置在低掠射角“打擊”的硬幣的一側(cè)上和亮度，由此產(chǎn)生的陰影效果的另一側(cè)（更靠近光）引起的硬幣的浮雕詳細地站出來在三維的清晰度。

外觀有點類似研究微觀標(biāo)本時，一個經(jīng)典的技術(shù)被稱為斜照明（有時稱為作為anaxial照明“）。直接受限制的光的聚光光錐到一個單一的方位角允許只從一側(cè)照射試樣，如在圖1中示出。凈效應(yīng)是偽救濟透露細節(jié)，否則幾乎看不見，無色的標(biāo)本。斜復(fù)合透射光顯微鏡照明的典型配置如圖1所示。下方的聚光透鏡系統(tǒng)中定位一個不透明的光具有小的狹縫（或扇區(qū)停止），被刪除的顯微鏡的中心光軸停止。從源通通過狹縫，并隨后通過系統(tǒng)從一個單一的方位角是離軸的聚光透鏡元件的照明光。斜光線，然后從一個非常具體的角度照射試樣的一側(cè)上，通過前透鏡元件的開口的邊緣附近（非常接近的透鏡架），并進入顯微鏡物鏡。集中的光線會聚在物鏡的后側(cè)焦點面，并且被定向到顯微鏡中間圖像平面，在那里他們通過目鏡觀察。

斜照明已被移動到的位置的周邊內(nèi)的物鏡孔徑（用目鏡望遠鏡或聚焦在物鏡的后焦平面的勃氏鏡，可以觀察到這種效果）所造成的零階。斜光的結(jié)果是把零階光通過一個周側(cè)的物鏡前透鏡元件從中心向試樣。這種轉(zhuǎn)變的零階的單面使一個或多個附加的衍射光的階數(shù)越高，要包含在物鏡的后焦平面的圖像的形成作出貢獻。只有衍射零階（通常稱為邊帶）的單面訂單被錄取的物鏡和衍射訂單在另一側(cè)，因為傾角照明，完全錯過物鏡。這個概念示于圖2，利用光線追跡和一個簡單的透鏡來表示的顯微鏡的物鏡。

一般情況下，透明的標(biāo)本時，在透射明視場顯微術(shù)，具有平行束的光線照射時，所產(chǎn)生的圖像的可見性差，沒有任何顯著程度的對比度。這是因為衍射的光的總和，由試樣的每一個細節(jié)的相位與當(dāng)兩者都在圖像平面的復(fù)合試樣的直接光通過四分之一波長。然而，從每個試樣點發(fā)出的衍射光包含邊帶（參見圖2）的任一側(cè)上的零階不偏離的光，這偏離四分之一波由邊緣位移。如果一個邊帶的衍射光被阻止到達圖像平面之間將發(fā)生的剩余的邊帶和直接的光以產(chǎn)生一個可見的圖像在中間像平面的顯微鏡，和相消干涉。斜照明是一個極好的機制，以實現(xiàn)所需的圖像形成過程中的邊帶抑制。

在圖2中，最上面的光線追跡的系統(tǒng)識別為一個標(biāo)準(zhǔn)的明場配置通過試樣進入顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的軸向光線的途徑。對稱分量的衍射光被錄取的物鏡和生產(chǎn)無顯著干擾（無論是建設(shè)性或破壞性）的免費模式直接在圖像平面上的光元件，導(dǎo)致圖像對比度和能見度較差。的衍射分量的邊帶的斜光（較低的光線追跡圖2中的系統(tǒng)）中，有幾個不捕獲由物鏡，但至少有一個高階分量與零階（二階邊帶一起被承認(rèn)（D-（ - 2） ）不包含在圖中的物鏡的后焦平面的清晰度增加的插圖）。在圖像平面的干擾產(chǎn)生一個圖像的檢體具有顯著更高的對比度和可見性。上面的物鏡的軸向和斜光的后側(cè)焦點面的衍射峰的外觀也顯示在圖中。由于只有兩個極大值圖像形成所必需的，斜光將產(chǎn)生一個可見的圖像。

斜照明是能夠解決非常精細的標(biāo)本很難區(qū)分使用傳統(tǒng)的明場技術(shù)的細節(jié)，那就是。當(dāng)斜光射線撞擊角“ob ”的物鏡的前鏡頭的顯微鏡的光學(xué)軸，和聚光鏡的前透鏡和物鏡之間的介質(zhì)的折射率是n，分辨率，照射波長（λ）之間的關(guān)系，并折射率可以被描述為：

分辨率(D) = λ/(n ? sin (ob)) + 數(shù)值孔徑 (NA)

一些作者等同的術(shù)語n ? sin (ob)的數(shù)值孔徑的照明，但是這是一個誤導(dǎo)的，因為方程并不打算意味著充分地從所有方位發(fā)出的光錐，但僅限于所產(chǎn)生的光的束anaxial從一個單一的方位角的照明。標(biāo)本細節(jié)的情況下，零階未衍射和第一級衍射邊帶光分開的距離等于物鏡孔徑的直徑是如此的精細，分辨力高兩倍，觀察到的軸向透射照明和被表示為等式：

分辨率（D）=λ/2NA

光學(xué)顯微鏡，以符合上述方程（利用斜光時）所需的條件，使得試樣周期性的細節(jié)的物鏡的分辨能力是有限的。在許多情況下，標(biāo)本信息利用明照明解決如此嚴(yán)重缺乏對比度，幾乎可以可視化或成像。的斜光觀察標(biāo)本的凈結(jié)果是通常分辨率的增加（超過中得到一個封閉的聚光鏡明照明孔徑光闌），并在圖像中的陰影，浮雕狀偽三維外觀的生產(chǎn)標(biāo)本。

斜照明技術(shù)是各種各樣的未染色的物體，如活細胞，晶體，硅藻，和類似的透明或半透明的標(biāo)本成像的理想選擇。然而，由此產(chǎn)生的圖像必須被視為謹(jǐn)慎解釋，因為從一個側(cè)面衍射訂單無助于形成圖像。潛在的錯誤圖像中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)可以嚴(yán)重限制斜光檢查和定量地描述了以前觀測到的標(biāo)本細節(jié)的實用性。這一事實應(yīng)始終考慮的斜光觀察標(biāo)本時。

可以通過各種技術(shù)實現(xiàn)的必要條件，這已被提高試樣的可見性，因為黎明顯微鏡的斜光，用一個簡單的透射光學(xué)顯微鏡。也許最簡單的方法是，以抵消聚光鏡的局部封閉的可變光闌的圖像的光源。前幾年，一些顯微鏡配備有聚光鏡具有偏心孔徑光闌（如圖3中所示，聚光鏡的透鏡系統(tǒng)，注意，不應(yīng)該被從顯微鏡光軸的中心位移）。該裝置被設(shè)計，以允許整個虹膜移動至關(guān)閉光闌開口的圓形偏離中心在一個水平面上，這樣將導(dǎo)致在零階移動到的物鏡的后側(cè)焦點面的外周。在高級模型中，整個膜片顯微鏡的軸線為中心轉(zhuǎn)動的方式，使斜光可以朝向?qū)⒃嚇訌娜魏畏轿?，以達到最佳的預(yù)期的效果，對于一個給定的試樣。

在實踐中，利用半封閉的聚光鏡虹膜式光圈技術(shù)，實現(xiàn)斜照明是那些阻礙了明場觀察的類似問題的困擾。結(jié)果是普遍虧損的分辨率和疊加的衍射環(huán)，環(huán)繞著混淆分鐘標(biāo)本細節(jié)的解釋。此外，源自貝克線和其它不希望的光學(xué)效果的試樣中所沒有的確切的重點復(fù)雜圖像區(qū)域。為了規(guī)避許多這些問題，已被用作一種有效的方法相結(jié)合的大聚光鏡的數(shù)值孔徑的斜光，耦合到視頻對比度增強，產(chǎn)生強烈類似于微分干涉差顯微鏡（DIC）與所觀察到的光學(xué)薄膜部。

可以被配置通過偏心聚光鏡光圈雖然斜光顯微鏡制造商目前出售的聚光鏡，大多數(shù)不具備這種能力。另一項技術(shù)涉及從顯微鏡光軸的鎢燈絲的橫向位移，如在圖4中示出。在圖4中的圖（a）是一個集中的長絲，已經(jīng)被翻譯燈箱顯微鏡的后部的燈的位置調(diào)整到右側(cè)的圖像。當(dāng)擴散過濾器被插入到光路（圖4（b）條）時，光被擴散到具有正確的方向與傾斜的方法觀察的照明用漸變填充聚光鏡光圈。優(yōu)化灰******調(diào)可以實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，通過放置在一個位置，以覆蓋大約一半的聚光鏡孔徑光闌（如在圖4中示出）的燈絲圖像。然而，細心的的燈絲位置和聚光鏡光圈調(diào)整，加之?dāng)U散屏幕的利用率具有不同的混濁，應(yīng)允許顯微鏡的顯著度緯度，以微調(diào)調(diào)制圖像的對比度。

建立不同程度的斜光甲更普遍采用的替代扇區(qū)站（圖5）是利用較低的聚光鏡的透鏡元件和孔徑光闌位置之下。許多顯微鏡都配有聚光鏡的底部附近的位置的過濾器保持器，用于插入一個扇區(qū)停止提供一個理想的位置。在圖5中的一些機構(gòu)停止設(shè)計的說明。部門停止在過去，從顯微鏡制造商提供的，但它們是今天越來越難以找到。然而，簡單的停止可以由不透明的紙或紙板的截面切斷，以適應(yīng)過濾器托架，或貼在所述聚光鏡的底部。

每個扇區(qū)站有一個部分，阻擋光（在圖5中的標(biāo)記的停止），另一個區(qū)域，只允許斜光通過（在圖5中標(biāo)記的通），照射試樣。停止通段的大小往往隨物鏡的數(shù)值孔徑，并適當(dāng)大小的確定在很大程度上是一個實驗性的努力，在顯微鏡的部分以達到最佳的平衡。扇區(qū)停止可旋轉(zhuǎn)的過濾器固定器內(nèi)，從各種角度，或（更方便），一個圓形的旋轉(zhuǎn)階段，試樣旋轉(zhuǎn)360度，以達到預(yù)期的傾斜照明效果，可以采用照射試樣。這些建議可以作為一個準(zhǔn)則，但個別的顯微鏡聚光鏡和扇區(qū)停止構(gòu)造，同時觀察試樣上的圖像效果優(yōu)化斜光，提高對比度和細節(jié)進行最后的調(diào)整。

斜光可以顯著提高標(biāo)本的對比，相比傳統(tǒng)的明場技術(shù)，示出由圖6中的數(shù)字圖像。在圖6中的試件（a）是已使用最大對比度調(diào)整孔與聚光鏡明照明成像的牛動脈細胞。試樣很明顯，幾乎是不可見的，詳細是很難區(qū)分明照明。與此相反，當(dāng)試樣被照亮?xí)r，傾斜使用部門停止聚光鏡附近的光圈（圖6（b）條）下，對比度顯著增加，許多細胞的細節(jié)，包括核和偽足的位置，成為可見。這種特殊的試樣難以成像的對比度增強技術(shù)的顯微鏡（包括相襯，微分干涉對比，暗場，或霍夫曼調(diào)制對比度）無關(guān)。

一種較為容易的標(biāo)本圖像的小鼠腎臟厚截面圖6（c）和6（D）。在明照明（圖6（C）），有些標(biāo)本細節(jié)是可見的，但具體的特點是很難區(qū)分和整體形象受到嚴(yán)重缺乏對比。利用扇區(qū)停止照射試樣傾斜相反，產(chǎn)生了顯著的改善，如在圖6（d）圖中所示。在這個數(shù)碼影像分鐘標(biāo)本細節(jié)變得可見，這在以前是很難觀察到，在明照明。

當(dāng)暗視野的技術(shù)，在該標(biāo)本具有高度斜光照明從所有方位相比，非對稱的斜光產(chǎn)生圖像，其特征是高度依賴于入射角的照明。斜光所產(chǎn)生的圖像邊緣垂直的方向入射照明可見，在這個意義上是不對稱的，而不是位于這個方向平行（或接近）。這個概念是圖7中所示的兩個試樣在不同的方位相對于斜光入射的角度。包括由薄的單晶晶片的鋁酸鑭，通常采用作為襯底的外延薄膜的鈣鈦礦得到的相同的視場（旋轉(zhuǎn)90度），圖7（a）和圖7（b）中的試樣高溫超導(dǎo)陶瓷沉積。。這些晶體的孿生阻礙融合的薄膜形成，導(dǎo)致膜的性能有不利影響。在圖7（a）示出的數(shù)字圖像生成孿晶域時，晶體取向的斜入射的光的雙軸線平行的縱向的偽浮雕。與此相反，當(dāng)晶體和雙軸旋轉(zhuǎn)了90度，因此，它是垂直于入射光線（圖7（b）），孿生域變得顯而易見。這是一個壯觀的顯示斜光照下的紋理效果觀察試樣取向限制。

與此類似，但戲劇性的少，得到的結(jié)果是，在幾個方向角的斜光觀察半透明山羊頭發(fā)標(biāo)本。當(dāng)?shù)陌魻畹陌l(fā)絲的長軸方向平行于入射的斜光（圖圖7（c）），在其中心部分和邊緣的毛發(fā)纖維的結(jié)構(gòu)的細節(jié)被顯露出來。此細節(jié)不存在時，頭發(fā)纖維是定向為垂直于照明軸（圖7（四）），并且觀察到一個顯著性差異，在兩者之間的取向角的纖維的表觀厚度。纖維取向平行于入射照明似乎是遠遠厚于那些面向垂直于光源。因此，顯而易見的是，斜光技術(shù)不能可靠地收集通過該方法從圖像中產(chǎn)生的忠實的測量數(shù)據(jù)。

通過斜照明技術(shù)帶來的表觀立體效果并不代表實際的試樣的幾何形狀或地形，和不應(yīng)該被用來進行測量試樣的尺寸。斜光圖像的真正價值是揭示轉(zhuǎn)換的折射率或其它光學(xué)路徑差，使試樣內(nèi)的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)安排，可以更清楚地理解。這項技術(shù)可以被應(yīng)用到多種材料出現(xiàn)明照明幾乎看不見的或透明的，不能被污染或其他化學(xué)或熱處理，以提高對比度。的活的生物體的研究和在體外受精過程，如玻璃或丙烯酸類纖維，化學(xué)晶體，和其他未染色的材料，可以促進一個容易控制的傾斜照明系統(tǒng)的利用率。

折光指數(shù)測定用斜照明

斜光有時也使用作為貝克的線路測試，以確定是否檢體的折射率比周圍介質(zhì)中的較高或較低的替代。如果試樣被安裝在培養(yǎng)基中，結(jié)果從anaxial照度低的折射率，遮光將出現(xiàn)在相反的一側(cè)，從該光入射檢體，反之亦然，如在圖8中示出。對于這兩個圖，在圖8中，描繪兩個大小相等的斜光線進入周圍介質(zhì)的試件通過在同一入射角。在點A上的左手圖中，光的傳播比在B點在較大面積的試樣，使該區(qū)域附近的試樣上的A點比B點附近的區(qū)域出現(xiàn)較暗的。在這些條件下，會出現(xiàn)陰影或試樣的一側(cè)比另一側(cè)觀察時，通過顯微鏡的目鏡（A'和B'，在圖8的左上部分）的顏色稍深。這是的情況下，當(dāng)樣品的折射率比周圍介質(zhì)高。

試樣具有較低的折射率比周圍介質(zhì)中（圖8所示的右手側(cè)）時，會發(fā)生相反的效果。在這種情況下，將試樣的陰影或黑暗的一面的一側(cè)最接近的斜光機構(gòu)停止。當(dāng)檢體和周圍介質(zhì)具有相同的折射率，則試樣將是透明的（或不可見的），將沒有任何的斜光折射效果。這種折射率測定方法的靈敏度是高度依賴于聚光鏡焦距，可變光闌的位置，并停止扇區(qū)的幾何形狀（如果使用的話）。在一般情況下，最好的結(jié)果是得到的聚光鏡時，小心地集中和一個偶數(shù)場的照度來實現(xiàn)。

在反射光的斜射照明

反射或入射光斜照明，微分干涉相襯場和暗場技術(shù)雖然大部分流離失所者，往往是有用金屬等標(biāo)本在冶金領(lǐng)域的檢查。光斜照明的透射和反射的基本配置之間的比較如圖9所示。圖9（a）的圖中示出的主要光學(xué)軸的軸向（明場），斜場和暗場透射照明。一個簡單的透鏡模擬顯微鏡物鏡和黃色的箭頭表示假設(shè)光線要實現(xiàn)所期望的照明模式在各自的角度取向。的角度θ是指到二分之一的物鏡的孔徑角。沿顯微鏡光軸的光線代表的軸向照明，而那些躺在之間的軸和極限角θ由物鏡前透鏡和形式的斜光拍攝。光線入射斜角大于θ不進入的物鏡和代表暗場照明。

列于圖9（b）中的主光路的反射光或落射照明。軸向（明場）在平行的方向上，以顯微鏡光軸的垂直照明燈的半反射鏡，它是通過物鏡系統(tǒng)和到標(biāo)本反射的反射照明進入。與此相反，斜落射照明反射到樣品上安裝的物鏡的邊緣以45度的棱鏡或反射鏡。這些光線穿過物鏡前透鏡元件的外周，在傾斜碰撞試樣，但被反射，折射和衍射的背面通過物鏡。的情況一樣，在圖9（a）中的值θ代表的二分之一，通過該物鏡的孔徑角軸向和斜光的 所有光線被定向。具有更高的角度的光線代表暗場落射照明，可以來源于外部光源或環(huán)形的反射鏡或透鏡系統(tǒng)周圍的物鏡。在圖9中，示出只有一個成像射線各照明模式，但在現(xiàn)實中，這些光線會在所有方向傳播。

斜的反射或落射照明是適用于檢驗，定期或線性結(jié)構(gòu)的表面上的金屬，陶瓷，玻璃，聚合物，和其他不透明的標(biāo)本。為獲得最佳效果，應(yīng)在90度角觀察下的結(jié)構(gòu)的長度方向的定位的方位角的照明。該技術(shù)是非常有用的減免了在檢查的表面結(jié)構(gòu)（特別是在較低的放大倍率），并可以被用來表明是否在試樣表面上的結(jié)構(gòu)是通過確定相對方位角的照明陰影的位置的腔體或突起。在斜反射照明，標(biāo)本應(yīng)通過完整的傾斜角度和方位與儀器，以獲得最佳的分析研究。如果可能的話，應(yīng)該旋轉(zhuǎn)的圓形舞臺，并且標(biāo)本通過一個360度的角度旋轉(zhuǎn)，捕捉到所有必要的表面細節(jié)。應(yīng)當(dāng)指出，因為斜光可產(chǎn)生偽影，例如顏色的條紋和方向?qū)Ρ榷鹊娘@微鏡應(yīng)的傾斜圖像的明照明，然后再嘗試解釋結(jié)果中得到的。

先進的斜低照度技術(shù)

斜照明，包括相襯和霍夫曼調(diào)制對比度的幾個顯微技術(shù)，利用顯微鏡的基本光學(xué)參數(shù)。具體而言，這些方法是基于的事實，聚光鏡和物鏡孔是在主要的共軛平面，聚光鏡孔徑所產(chǎn)生的每一個點上的照射光束被衍射的試樣以不同的角度（根據(jù)它的空間頻率）的。另一個基本概念，利用這些技術(shù)，是物鏡后孔的事實，傅里葉光學(xué)顯微鏡平面。

在霍夫曼調(diào)制相襯顯微鏡，的斜光技術(shù)的一個復(fù)雜的衍生物，聚光鏡光圈配有具有狹縫的狹縫掩模的開口邊緣附近的定位。的物鏡的后側(cè)焦點面包含，互補的第二掩模，稱為一個調(diào)制器，它包括三個區(qū)域，具有不同程度的透射率。通過聚光鏡狹縫的斜光被投射到調(diào)制器的中央?yún)^(qū)域，在此區(qū)域中形成圖像的狹縫。中央?yún)^(qū)域的光密度，使進入的光通過調(diào)制器發(fā)送的區(qū)域只有15％的，而較深的（但較?。┑膮^(qū)域只有1％的光傳送。面積最大的調(diào)制器的板包括第三區(qū)域，該區(qū)域是透明的，并傳遞基本上所有的入射光（減去丟失，由于反射和吸收的）。因此，調(diào)制器的物鏡板（掩膜）衰減非衍射的零級光（即通過該區(qū)域的15％的傳輸）由試樣衍射的光朝向暗界（1％的透射）而被阻塞。試樣相差的黑暗的部門的掩模衍射的光傳遞不變的，造成的陰影鑄態(tài)圖像在外觀上類似的微分干涉對比，從而提高折射率的梯度，或試樣中的光程差所產(chǎn)生的。

與此相關(guān)的技術(shù)，被稱為單邊帶邊緣增強或升中試利用一個可調(diào)節(jié)的半停止在聚光鏡的前焦面閉塞的部分聚光鏡孔徑。位于物鏡共軛后側(cè)焦點面甲互補的空間濾波器衰減和控制通過顯微鏡發(fā)送的未衍射光束的相移。的衰減程度和背景（直接波）的相移，相對的光圈遮蔽區(qū)域由半停止試樣的光散射和衍射的，是可調(diào)的。再次用這種技術(shù)生成的圖像在外觀上類似于微分干涉法通過以下方式獲得，但單邊帶的方法，DIC的不同，不要求極化的光學(xué)元件，以夾持試樣。該系統(tǒng)可以進行調(diào)整，以標(biāo)本中檢測到非常微小的相位差，以及在高分辨率下的折射率各向異性。該方法利用了一個事實，即只有一個必須被捕獲的兩個衍射邊帶，以獲得有關(guān)的信息的空間頻率中的試樣，使人們產(chǎn)生該特定的衍射角。圖10中提出的，單邊帶邊緣增強對比度優(yōu)于提供的其他流行的對比度生成模式提供了一個高空間頻率的調(diào)制傳遞函數(shù)。

結(jié)論

時發(fā)生在其邊緣照亮顯微鏡的物鏡的光學(xué)效果，根據(jù)鏡頭的質(zhì)量，校正像差，標(biāo)本的特點有很大的不同。當(dāng)照明光束落在物鏡孔徑以外的部分，因為它在斜光，其結(jié)果是減少了零級光的強度相對的邊帶的強度，和物鏡孔徑的邊緣處產(chǎn)生的衍射圖案。出于這個原因，在照明錐應(yīng)限制到小于物鏡孔徑，以避免衍射的工件（如干涉條紋）。仔細的實驗與聚光鏡的照明方法應(yīng)確保在限制孔徑均勻的照明領(lǐng)域。

有幾個優(yōu)點斜光時相比，微分干涉對比，相位相反的。不混淆的一個標(biāo)本的固有雙折射的斜光圖像，是與DIC的情況下，但相了解清楚地觀察到在定向陰影的圖像從斜光。一個很好的例子是脊椎動物的神經(jīng)軸突，這是更清楚的斜光，由于其高雙折射髓鞘產(chǎn)生過多的對比度DIC成像。此外，設(shè)備成本明顯比無論是DIC，相襯，或霍夫曼調(diào)制對比斜射照明，因為唯一的要求是一個正確配置的明視場顯微鏡。在某些情況下，斜光技術(shù)，使圖像的顯微鏡深入組織層比是可能并發(fā)DIC。最后，決議沒有妥協(xié)過，達到與明視場，可以顯著增強和對比度。