尼康顯微鏡：熒光蛋白的成像參數(shù)

迄今發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白及衍生工具的廣泛用途相當(dāng)廣泛，并已成功地應(yīng)用在幾乎每一個生物學(xué)科從微生物系統(tǒng)生理學(xué)。這些獨(dú)特的探頭已經(jīng)證明是非常有用的記者在培養(yǎng)細(xì)胞和整個動物的基因表達(dá)研究。熒光蛋白在活細(xì)胞中，最常用的跟蹤本地化和動態(tài)的蛋白質(zhì)，細(xì)胞器，和其他細(xì)胞區(qū)室，以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸示蹤劑。很容易地完成了多種技術(shù)，其中包括寬視場，共聚焦和多光子顯微鏡，熒光蛋白的定量成像曝光細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，提供了一個獨(dú)特的窗口。

復(fù)雜的熒光蛋白的光譜和物理性能影響任何定量測量的準(zhǔn)確性和效用。許多這些性質(zhì)，如摩爾消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，光漂白率，光譜公司的pH值的依賴，可以很容易地用純化的蛋白在體外測量。然而，其他重要的和實驗的關(guān)鍵特性，包括發(fā)色團(tuán)的形成（成熟）和蛋白質(zhì)在體內(nèi)的降解率的時間過程，更難以確定。對于典型的實驗中，最亮，最穩(wěn)定的單體熒光蛋白衍生物應(yīng)選擇，以減少施加復(fù)雜背景，在要求較低的應(yīng)用中光漂白校正的必要性。

在選擇成像實驗中，水母和珊瑚市售的增強(qiáng)型變種，以及它們的衍生物的熒光蛋白載體，應(yīng)當(dāng)認(rèn)真考慮。這些是與青色（ECFP），綠色（EGFP），和黃色（EYFP）光譜區(qū)域，現(xiàn)在已經(jīng)被引入的新的單體的紅色發(fā)光熒光蛋白的熒光公司提供。如圖1中所示，獲得的圖像可以選擇使用各種市售熒光蛋白融合載體幾個不同的亞細(xì)胞位置。圖1中所示的探針的熒光發(fā)射光譜覆蓋的帶寬的幾乎180納米，具有極大值，范圍從440至618納米。這些探針是最亮，最穩(wěn)定的熒光蛋白的變體，并允許成像照明光漂白（下面討論）和光毒性的問題，如在低光照水平，最大限度地減少。許多熒光蛋白變體（包括EGFP，ECFP和EYFP）可以在足夠高的濃度，可以干擾膜結(jié)構(gòu)的工件，或?qū)е虏徽_的假設(shè)，進(jìn)行定量先進(jìn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，如形成二聚體（FRET） 。

另外的本征亮度的熒光蛋白的基因工程中的表達(dá)水平是產(chǎn)生顯著明亮的細(xì)胞內(nèi)信號從融合構(gòu)建另一個要考慮的因素。使用具有強(qiáng)啟動子的載體，以提高轉(zhuǎn)錄水平和適當(dāng)?shù)拿艽a子，以優(yōu)化翻譯的應(yīng)用是必不可少的，用于提高融合蛋白的表達(dá)水平，從而提高整體的信號電平。當(dāng)細(xì)胞的自體熒光，使得它難以區(qū)分背景熒光的熒光融合蛋白排放時，這一點(diǎn)尤為重要。

多種技術(shù)可以應(yīng)用到一種熒光蛋白融合產(chǎn)物的細(xì)胞中的表達(dá)水平和亮度增強(qiáng)。此外，丁酸鈉（大約1至5毫摩爾），向培養(yǎng)基中，將增加整體在穩(wěn)定的細(xì)胞系中表達(dá)的融合蛋白的基因的表達(dá)水平。此外，瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的使用是有吸引力的選擇，因為他們經(jīng)常顯示穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表達(dá)水平高得多。應(yīng)該行使一定程度的謹(jǐn)慎，然而，瞬時轉(zhuǎn)染由于可能過度表達(dá)的文物，包括蛋白質(zhì)聚集或飽和度蛋白靶向機(jī)械，導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)谋镜鼗?。最后，增加串?lián)熒光蛋白序列的數(shù)目（雙鍵或三）在克隆載體是一種替代方法，用于提高融合蛋白的亮度水平。

臨界熒光蛋白特性

大多數(shù)的市售熒光蛋白載體具有改進(jìn)的性能，由于優(yōu)化的密碼子使用在哺乳動物細(xì)胞中的翻譯和位點(diǎn)定向誘變在較高的溫度下，以提高效率的發(fā)色團(tuán)成熟。對于要求更高的成像應(yīng)用中，熒光蛋白的表達(dá)或物鏡豐度低，在探針的內(nèi)在屬性將可能是一個限制因素。因此，有必要充分了解熒光蛋白的固有特性，并運(yùn)用必要的控制，以最大限度地減少成像探針在活細(xì)胞實驗過程中可能出現(xiàn)的文物。

光子引起的發(fā)色基團(tuán)破壞，這種現(xiàn)象稱為漂白，熒光蛋白通常是減少的速度和幅度相比，傳統(tǒng)的合成熒光，在類似的條件下，如熒光素和若丹明。這種漂白的阻力被認(rèn)為是排列緊密周圍的β -蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熒光蛋白生色團(tuán)的保護(hù)。無論如何，它仍然是重要的，嚴(yán)格執(zhí)行漂白定量成像實驗的控制措施。

率的光漂白熒光蛋白可確定獲取隔時圖像的一系列標(biāo)記的對照細(xì)胞，然后通過定量測量，發(fā)射強(qiáng)度，它的表現(xiàn)通常是一個指數(shù)衰減逐漸喪失。光漂白的熒光損耗曲線（圖2中所示），然后，可以采用修正的成像實驗。雖然不是一般意義上顯著的問題，如果光漂白成為限制因素成像時的活細(xì)胞，抗淬滅劑如抗壞血酸，Trolox的，或Oxyrase（氧和自由基清除劑）可加入到培養(yǎng)基中。

漂白雖然往往是在熒光顯微鏡中的最終的限制因素，許多熒光蛋白衍生物的光漂白率是比較慢的（參見圖2）。另一個限制因素是熒光基團(tuán)的飽和度，這不會發(fā)生在寬視場顯微術(shù)，但可以是一個顯著的問題，用激光掃描共聚焦激發(fā)強(qiáng)度足夠高，以達(dá)到飽和，有時工具。熒光飽和發(fā)生時，所有可用的分子都在不斷增加激發(fā)光處于興奮狀態(tài)，所以不會產(chǎn)生相應(yīng)增加熒光。在這種情況下，這是非常困難，校準(zhǔn)由于非線性，一個問題，即只能通過降低激光輸入功率校正的熒光信號。

細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境條件，特別是pH值和高的局部濃度，其它一價和二價陽離子，可以改變熒光蛋白衍生物的亮度電平。例如，野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）顯示相對亮度均勻pH值為5至pH10，而增強(qiáng)型綠色和黃色熒光蛋白均在酸性pH值水平的驟冷，定位于細(xì)胞器（溶酶體）或降低其有效性亞細(xì)胞具有低pH值的內(nèi)飾。其他衍生工具，如ECFP和DsRedFP的是不太敏感的低pH值。然而，許多熒光蛋白融合的產(chǎn)品將被定位在生理pH條件下，這應(yīng)該不會嚴(yán)重影響熒光強(qiáng)度的區(qū)域附近的。

固有熒光蛋白，可能會顯著地改變定量成像（但不能準(zhǔn)確地在體外測定），發(fā)色團(tuán)的折疊動力學(xué)，或導(dǎo)通時間之間的其他物理參數(shù)可以有最嚴(yán)重的后果。Aequorea victoria的水母（和大多數(shù)礁珊瑚）熒光蛋白的衍生物需要的氧化生色團(tuán)的形成，但氧氣不容易穿透致密的蛋白結(jié)構(gòu)，周圍的三肽熒光。因此，一個相當(dāng)大的延遲（通常超過幾個小時）之間可能出現(xiàn)的蛋白表達(dá)和熒光的外觀。不幸的是，它不是經(jīng)常容易區(qū)分，由于熒光蛋白表達(dá)（理想的測量），由于緩慢的發(fā)色基團(tuán)形成（一個工件）之間的延遲。相反的過程，成熟的熒光蛋白在體內(nèi)降解，也很難監(jiān)測，但壓倒性的證據(jù)表明，許多這些探頭都非常穩(wěn)定。

顯微鏡參數(shù)

廣角，共聚焦和多光子熒光顯微鏡，無論是在直立或倒置配置的，是觀察熒光蛋白在活細(xì)胞和組織的理想工具。所需的照明源的范圍從含汞和氙弧放電燈的寬視場，在共聚焦和鎖模脈沖激光多光子顯微鏡（見表1）的氣體和半導(dǎo)體連續(xù)波激光器。綠色熒光蛋白及其變種很容易的汞燈或氬離子或氪氬氣體激光器發(fā)出的488納米線與明亮的藍(lán)色光譜線成像。此外，一臺主機(jī)的新的固態(tài)激光器的生產(chǎn)線的許多部分，包括在可見光譜的紫光和藍(lán)光區(qū)域，將被引入。熒光蛋白變體，具有轉(zhuǎn)移到藍(lán)色，紅色，和近紅外波長的光譜通常以更高的效率，使用氙燈或金屬鹵化物燈，以及激光發(fā)射線緊密匹配的激發(fā)最大值成像的。無論光源，成像熒光蛋白的主要問題是，提供足夠的激勵光，以合理的信號電平。

除了物鏡，下面討論的，熒光蛋白成像的兩個最重要的組成部分是發(fā)射濾波器和檢測器。在寬視場顯微鏡中，激發(fā)濾光器，二色鏡，和發(fā)射濾光器組合成一個光學(xué)塊的帶寬被用于激發(fā)所述光源由激發(fā)光濾光片。例如，汞燈時，需要具有高傳輸圖像的綠色熒光蛋白在450和490納米之間的激發(fā)帶通濾波器。更短的波長帶為青綠色和藍(lán)色的變體是必要的，而更長的波長帶，用于黃色，橙色和紅色的衍生物。激光線的帶寬只有幾納米的大小，因此，通常不需要使用干涉濾光片的波長選擇。二色鏡切波長應(yīng)該清楚地分開前有效地反射和發(fā)射后者的激發(fā)和發(fā)射光譜。有很少的保證金的錯誤選擇合適的雙色鏡。另一方面，發(fā)射波長的濾光片，可以進(jìn)行微調(diào)，通過從20變到幾百納米的帶寬，這取決于實驗要求。這些過濾器是最靈活的，在確定傳遞到檢測器的熒光發(fā)射強(qiáng)度的水平。編目表1中建議的過濾器組合的熒光蛋白的定量成像的列表。這些過濾器的建議，其中包括僅帶通的排放過濾器（實際上，忽略長通濾光片的建議），應(yīng)被視為僅僅作為一個起點(diǎn)，設(shè)計實驗。

一些流行的綠色熒光蛋白的過濾器集的性能的影響，可以判斷圖像進(jìn)行比較，從相同的視場捕獲的單個濾波器的組合，如在圖3中示出。標(biāo)本是貼壁培養(yǎng)的胚胎大鼠胸主動脈與一個向量，包含一個紅移的（增強(qiáng)）綠色熒光蛋白的變種，EGFP人類細(xì)胞質(zhì)β -肌動蛋白結(jié)合的基因融合蛋白轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞。融合蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出其納入日益增長的微絲，使可視化的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)倪^濾器組合（見圖3）用熒光顯微鏡。胸主動脈成肌細(xì)胞也沾上Mitotracker有：紅CMXRos（線粒體紅色熒光）和Hoechst 33258（細(xì)胞核中的DNA;藍(lán)色熒光）。請注意信號的情況下，與活塞從藍(lán)色和紅色的熒光基團(tuán)，賦予帶通濾波器（圖3（a）和圖3（b）），但顯著程度的橙紅色的熒光所產(chǎn)生的線粒體探頭與賦予長通濾光片（圖圖3（c））。帶寬的30納米（活塞），50納米（賦予BP），和超過100納米（賦予LP），帶通和長通的GFP過濾組合，也可與多種合成熒光受光激發(fā)在可見光譜的藍(lán)色部分。

雖然綠色熒光蛋白一般可以與標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾器組合成像，如果強(qiáng)度足夠高，使用專門的過濾器（見圖3），將使微調(diào)信號采集，包括或排除其他組件。一個專門的過濾器組合的GFP定量成像應(yīng)該使用排放窄帶通濾波器，以最大限度地提高熒光蛋白對背景信號（通常是自發(fā)熒光）。一個狹窄的帶通發(fā)射光濾光片，尖銳的藍(lán)綠色熒光蛋白的信號（圖3（a））與優(yōu)先傳遞到該檢測器上（圖3（b）），或綠色橙色綠黃色（圖3（c） ）細(xì)胞自體熒光和其他熒光發(fā)射波長更長的背景。自體熒光通常具有非常廣泛，而綠色熒光蛋白的發(fā)射光譜相對較窄。原則上，最窄的帶通濾波器的選擇應(yīng)比其他的背景信號增加熒光蛋白發(fā)射的歧視。然而，最佳的濾波器的通帶，將被限制了所需的信號與噪聲的比和檢測器的特征，如下面所討論。每個成像的情況，應(yīng)確定最佳的帶通。此外，雖然圖3中所示，所選擇的特定的過濾器的組合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白不僅依賴于信號強(qiáng)度，同時也對的熒光發(fā)射光譜輪廓的蛋白質(zhì)變體（見表1）成像。

藍(lán)色熒光蛋白變種可以在寬視場熒光顯微鏡使用標(biāo)準(zhǔn)DAPI過濾器組合激發(fā)過濾器公司，在330至380納米范圍內(nèi)成像，截止波長385至400納米，無論是帶通或長波發(fā)射濾光片色鏡（420納米以上）。這些過濾器的組合是非常有用的青色熒光蛋白，然而，與激發(fā)的藍(lán)紫光（400到440納米）的圖像的熒光基團(tuán)的過濾器，以產(chǎn)生最佳的圖片。青色熒光蛋白的二色性反射鏡切割之間的波長455和460納米，以及傳輸460和500納米之間的光的發(fā)射濾光片。許多藍(lán)紫色的標(biāo)準(zhǔn)長通和帶通濾波器的組合可以的成功形象青色熒光蛋白衍生物（包括天藍(lán)和AmCyan1），，但顯微鏡和售后市場濾清器的廠家也提供了專門為這些探頭的自定義設(shè)置。

雖然黃色熒光蛋白衍生物（包括增強(qiáng)，金星和水晶）通常使用過濾器組合設(shè)計FITC和綠色熒光蛋白產(chǎn)生可接受的圖像，得到更好的結(jié)果時，吸收和發(fā)射波長稍長的配置文件顯示這些濾波器參數(shù)優(yōu)化探頭。為黃色熒光蛋白的理想的組合是與跨越490至510納米的帶通區(qū)域的激發(fā)濾光片，二色性反射鏡與截止波長為515納米的，和發(fā)射濾波器通過在520和550納米之間的波長。à長波發(fā)射濾波器與截止波長為515納米或略高也將產(chǎn)生黃色熒光蛋白的良好形象。

橙色和紅色熒光蛋白的光譜剖面跨越一個大的波長區(qū)域，不幸的是，沒有一個單一的過濾器組合，是理想的成像的整個集合這些熒光。紅色熒光蛋白的熒光蛋白變體往往是與TRITC標(biāo)準(zhǔn)過濾器的組合，以及許多長通和帶通設(shè)置吸收可見光譜的綠色區(qū)域中的其他探測器設(shè)計的可視化。的橙色熒光蛋白成像（mOrange

在激光共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長的選擇限制在一個狹窄的范圍內(nèi)為每個儀器可用的激光線。典型的顯微鏡都配有兩個或多個激光器，跨越紫羅蘭（405和440納米），藍(lán)色（457，477和488納米），綠色（514和543納米），黃橙色（568和594納米），并紅（633和647納米）光譜區(qū)域。可以有效地使用這些激發(fā)波長激發(fā)表1中列出的熒光蛋白，這取決于可用的適當(dāng)?shù)亩苑瓷溏R和發(fā)射濾光片。多光子顯微鏡，也可利用圖像最流行的熒光蛋白的衍生物，在受限制的空間體積，這些工具的特征。

熒光蛋白過濾組合參數(shù)

表1

表1給出的是一個匯編顯示一些最流行的，潛在有用的熒光蛋白變種物業(yè)。隨著每個熒光蛋白的最佳激光波長線，以及建議的出發(fā)點(diǎn)的激發(fā)和發(fā)射濾波器帶寬（中心波長）的通用名稱和/或首字母縮寫列出。也包括在表中的相對亮度和推薦的二色鏡參數(shù)。是來自于該產(chǎn)品的摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，EGFP的值除以計算出的亮度值。創(chuàng)建此房產(chǎn)已被科學(xué)和商業(yè)的文獻(xiàn)資源，目的不是要全面，而是代表熒光蛋白的衍生物，在文獻(xiàn)中得到相當(dāng)?shù)闹匾暎赡茏C明是有價值的研究工作。

通常優(yōu)選的定量顯微鏡的檢測器是光電倍增管和冷卻的電荷耦合器件（CCD）攝像系統(tǒng)。由于光電倍增管成像儀，光柵掃描（用于在激光共聚焦顯微鏡）必須執(zhí)行整個標(biāo)本逐點(diǎn)建立形象。或者，CCD圖像傳感器中的光電二極管陣列，產(chǎn)生二維圖像的大小的限制，僅由單個二極管元件的數(shù)量。除了從信號對噪聲的考慮，檢測器系統(tǒng)的最重要的方面是它的線性度和偏移。CCD陣列是兩個光電倍增管和高線性度和較高的高端相機(jī)系統(tǒng)，使調(diào)整的偏移量（通常被稱為黑電平），盡一切倍增配置。在實踐中，應(yīng)調(diào)整偏移量讀取為零時，從檢體沒有熒光發(fā)射。如果有一個非零偏移系統(tǒng)中，它不會未能取得定量的圖像之間的差異。

在激光掃描共聚焦顯微鏡，光電倍增管通常具有較低的動態(tài)范圍（8位或256級灰度）和檢測效率（15％?30％）相比，到一個冷卻的CCD攝像系統(tǒng)。雖然這將是可取的，以增加檢測效率，8位的動態(tài)范圍通常不是一個問題，因為每個像素一般少于255個光子收集每個掃描（即使是很好的染色標(biāo)本）。盡管如此，倍增的響應(yīng)，同時加上適當(dāng)?shù)募す馄鞯目捎眯耘c背景抑制性能卓越的線性度，使共聚焦顯微鏡的熒光蛋白定量成像的最佳選擇。多光子顯微鏡，從而消除相差的光損傷的焦平面上，以避免色差，提供了高分辨率的三維測量，熒光蛋白成像也是一種非常有用的工具。

最重要的參數(shù)是定義定量成像的效用的信號-噪聲比（簡稱S / N）。這個值是在現(xiàn)代商業(yè)熒光顯微鏡一般的散粒噪聲是來自于由檢測器收集的光子數(shù)的平方根被定義為。幾個系統(tǒng)誤差可能被引入在檢測系統(tǒng)中，但它們通常是比較小的散粒噪聲的CCD和光電倍增管。例如，如果一個檢測器收集每像素100個光子，噪聲將被預(yù)期為10（100）的平方根，或10％的信號。同樣地，對于噪聲（100）的10,000的每個像素的光子的信號，是信號只有1％。這些例子反映了典型的信號電平，在熒光顯微鏡中，在檢測電路中引入的誤差通常低于1％。一次出現(xiàn)時，它似乎是顯而易見的，最高的信號-噪聲電平是最可取的，但在現(xiàn)實中，因素，例如：光漂白，熒光團(tuán)的飽和度，樣品中的熒光基團(tuán)的數(shù)目和空間分辨率極限所得到的信號噪比。

在大多數(shù)情況下，以等于比例之間存在的熒光蛋白標(biāo)簽，以及稠合的細(xì)胞靶蛋白。因此，在單元格中的熒光分子的濃度，可以計算出從作為參考標(biāo)準(zhǔn)使用已知濃度的重組熒光蛋白的細(xì)胞總熒光。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白通常采用用于此目的，因為它的光穩(wěn)定性和亮度。計算細(xì)胞內(nèi)EGFP的濃度，已知量的標(biāo)記可以被嵌入在聚丙烯酰胺平板細(xì)胞表達(dá)融合構(gòu)建一起拍攝。參考的標(biāo)準(zhǔn)也已開發(fā)用于計算密度的膜結(jié)合蛋白，通過將準(zhǔn)確數(shù)量的組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白包被的磁珠。蛋白表達(dá)的定量分析，隨著越來越多的熒光蛋白用敲的方法在整個生物標(biāo)記分子利用，將成為越來越有用的技術(shù)。

選擇物鏡熒光蛋白成像

用于成像實驗設(shè)計協(xié)議時，雖然它可能是最重要的考慮，物鏡的選擇往往是最少量的思想。在確定可用的空間分辨率的圖像傳感器收集的光的量是最重要的物鏡的參數(shù)。在一般情況下，物鏡是由三個主要的標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)值孔徑，放大倍數(shù)和光學(xué)矯正的程度定義。最不重要的參數(shù)放大倍率，盡管普遍的看法相反。放大倍數(shù)確定一個對象將出現(xiàn)在目鏡或探測器只大，但不發(fā)揮作用，分辨率（最小的細(xì)節(jié)，可以清楚地觀察）或亮度（將要收集的熒光信號的量）的圖像。

分辨率和亮度的數(shù)值孔徑，這是最重要的標(biāo)準(zhǔn)選擇一個物鏡函數(shù)。數(shù)值孔徑定義，將進(jìn)入物鏡前透鏡的光的量，所以應(yīng)選擇盡可能高的數(shù)值孔徑成像的熒光蛋白進(jìn)行定量。圖像采集（任何形式的）背后的一般原則很簡單：作為信號噪聲比的增加，所以圖像質(zhì)量。這個概念是特別關(guān)鍵的激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，其中收集的光子數(shù)量往往是相當(dāng)小的（通常只有幾每像素）的圖像集合。因此，謹(jǐn)慎選擇適當(dāng)?shù)?/span>物鏡是優(yōu)化光子收集策略時特別有用。請注意，圖像的整體亮度的平方除以放大倍率的物鏡的數(shù)值孔徑的四次方成正比。

圖4中所示的數(shù)值孔徑的原理的分辨率和圖像的亮度方面的重要性的一個例子。樣品是培養(yǎng)貼壁的人骨肉瘤上皮細(xì)胞（U2OS線）轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合到線粒體靶向的核苷酸序列從人類細(xì)胞色素C氧化酶亞基VIII。的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯后的線粒體定位信號是負(fù)責(zé)細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的熒光蛋白嵌合體在整個運(yùn)輸和分配。管狀線粒體隨后可以可視化使用熒光顯微鏡。

在圖4中，使用具有相同的光學(xué)校正（方案螢石）和數(shù)值孔徑（1.3）的物鏡成像的相同的視場，但與從40倍到100倍的放大倍率。雖然在圖4中收集的圖像的像素和使用的檢測器的條件的數(shù)是相同的，線粒體是明亮的成像時，通過40倍物鏡（圖4（a））。相比之下，更高的放大倍率60X和100X的物鏡（圖4（b）和圖4（c），分別），100倍的圖像幾乎不產(chǎn)生逐漸變暗的圖像。此物鏡，仍然可以使用的圖像試樣，但檢測器的增益，必須顯著增加，導(dǎo)致惡化的信號 - 噪聲比，并通常次于圖像。請注意，物鏡的分辨能力（圖圖4（d）通過第4（f））是可比較的，因為在相同的數(shù)值孔徑值。

從圖4中的數(shù)據(jù)，將收集到的基本概念之一是避免過度的放大倍率，選擇物鏡時的熒光蛋白成像（和其他的熒光團(tuán)，為此事）。簡單地增加數(shù)字放大（變焦），圖像采集過程中使用40倍的客觀結(jié)果共聚焦顯微鏡中的圖像大小相當(dāng)于100倍的鏡頭（圖4（d）及（f）條）。這兩個物鏡的分辨率是一樣的，因為他們有相同的數(shù)值孔徑值。不應(yīng)被視為相對次要的放大倍率參數(shù)表明，使用60倍或100倍的物鏡是不是有利。事實上，選擇高倍率的物鏡通常是必要的，當(dāng)使用寬視場顯微鏡的成像非常小的物體，如過氧化物酶體或分泌顆粒，。由于圖像的大小相對于檢測器尺寸起著重要的作用，在確定空間的采樣頻率，確定的最佳放大倍率的數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)（CCD像素的大小和中間倍率）的參數(shù)。因此，物鏡的最佳選擇通常取決于儀器的光學(xué)結(jié)構(gòu)的，除了一個特定的實驗的具體要求。

高度校正的物鏡（復(fù)消色差透鏡）的使用應(yīng)慎重考慮，并盡量避免。色差和平整度的字段中包含的物鏡的典型的光學(xué)校正透鏡元件需要額外的矯正的程度的增加（例如，從螢石復(fù)消色差透鏡）。每增加一個透鏡，總的傳輸?shù)墓馔ㄟ^物鏡減小，這進(jìn)一步限制了能夠到達(dá)探測器的信號的量。雖然高度校正透鏡的所需的專門的應(yīng)用程序，如，高signal-to-noise比（并因此是一種特別的質(zhì)量圖像）將更難獲得，多色成像，尤其是成像時的調(diào)光器的熒光蛋白質(zhì)，如HcRed或ECFP。綜上所述，40x的螢石物鏡的（數(shù)值孔徑為1.3），優(yōu)選為包含單一的熒光蛋白的成像標(biāo)本，但多色實驗（兩個或更多的熒光蛋白），復(fù)消色差透鏡進(jìn)行色彩校正的目的是必要的。

多色熒光蛋白成像

全彩色調(diào)色板的熒光蛋白的發(fā)展背后的主要推理是同時跟蹤兩個或兩個以上的細(xì)胞活動。鑒于日益增長的熒光蛋白的變種數(shù)量目前可用的（見表1），最佳配對可能不是很明顯。廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光蛋白和它們的顏色位移的遺傳變異體所表現(xiàn)出的公司通常需要專門的設(shè)計考慮因素時，這些獨(dú)特的探針同時使用兩個或更多的活細(xì)胞成像實驗。首要關(guān)注的是潛在的出血通過工件（實際上，從一個探針熒光外溢進(jìn)入通道配置為第二個探頭）從重大通常表現(xiàn)出的熒光蛋白組合的光譜重疊程度。

滲色（通常稱為交叉或串?dāng)_）可以發(fā)生在兩個不同的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)波長和發(fā)射。熒光探針檢查時，發(fā)生流血通過向藍(lán)端的頻譜（波長較短）的神器，而最明顯的是在較長的波長（紅端）排放。綠色熒光蛋白可以作為一個例子，通?？梢詸z測到通過紅色發(fā)射濾波器，但一般不使用綠色濾波器成像紅色熒光蛋白。出于這個原因，多色成像的熒光蛋白進(jìn)行的最長波長的發(fā)射探頭想像第一，使用的激發(fā)波長不交叉的波長更短的探針。EYFP信號例如圖像EYFP和EGFP在同一單元中，使用氬離子激光，將首先收集在514納米的譜線，超出吸收的檔案EGFP，和排放聚集有530 - 550納米帶通濾波器。不是特別關(guān)鍵的，因為只有EYFP被激發(fā)的發(fā)射濾波器的帶寬。綠色熒光蛋白成像從477納米氬離子激光線，連同一個很窄的490至500納米帶通發(fā)射濾波器使用第二次掃描。該過濾器應(yīng)正確定位，，到排除EYFP熒光，并允許特定EGFP（有點(diǎn)乏味的任務(wù)）的信號捕獲。雖然的488納米氬離子激光的峰值更接近的EGFP的激發(fā)最大值，它太接近到發(fā)射濾波器的帶通區(qū)域，從而與圖像采集的激光反射光的干擾的可能性。

成像兩個或兩個以上的熒光蛋白質(zhì)時要考慮的一個重要點(diǎn)是帶過濾器的多色成像，需要認(rèn)真注意，以控制出血通過熒光發(fā)射到意想不到的渠道。然而，應(yīng)該指出的是，顯著限制濾波器的帶寬發(fā)生在信號噪聲（因為該集合帶寬受到嚴(yán)重限制）和由于需要單獨(dú)收集策略的時間分辨率為代價的。其次，專門的光學(xué)設(shè)計，往往特別是實驗，通常是必需的，以達(dá)到最佳的成像條件。例如，綠色熒光蛋白變異體的黃色衍生物的存在下收集所需的專門的過濾器的組合標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦顯微鏡中并不普遍。由于熒光蛋白的數(shù)量和光譜剖面變化的持續(xù)增長，需要特定的過濾器組合將相應(yīng)增加。

圖5中所示的一系列的同時與兩個或兩個以上的熒光蛋白融合到亞細(xì)胞定位的物鏡轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中拍攝的圖像。圖5（a）在HeLa細(xì)胞標(biāo)記EYFP（核），的ECFP（高爾基），DsRed2FP（線粒體），三個探頭清楚地分隔廣角熒光濾波器組合用于捕捉圖像（尼康CFP YFP HYQ和Cy3 HYQ）。負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞（OK）轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（微管），ECFP（核），DsRed2FP（線粒體）和成像標(biāo)準(zhǔn)過濾器組合的特色在圖5（b）。同樣地，在圖5（c）圖中的兔腎細(xì)胞（RK-13 行），轉(zhuǎn)染EYFP（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)），ECFP（過氧化物酶）和成像尼康CFP和YFP HYQ過濾器集。非洲水的貓鼬細(xì)胞（APM）在圖5（d）所示的細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（微管蛋白）和DsRed2FP（核），人骨肉瘤細(xì)胞（U2OS線;圖5條（e）），標(biāo)有相同的核探頭沿與ECFP（線粒體）。最后，在圖5（f）轉(zhuǎn)染的幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞系）（過氧化物酶）和DsRed2FP（線粒體）與EGFP。所有精選如圖5的圖像被抓獲使用廣角熒光顯微鏡和尼康濾波器的優(yōu)化組合適當(dāng)?shù)臒晒獾鞍住?/span>

雖然最亮的熒光蛋白類的綠色和黃色的（見表1），它們的光譜的極大值相隔僅由平均為20至25納米。多色實驗中使用成對的綠色和黃色熒光蛋白是可能的，但放氣通過過濾器的組合之間，成為一個顯著的問題。其結(jié)果是，不經(jīng)常使用的綠色和黃色的組合在一起。其中最流行的雙探頭組合是青色和黃色熒光蛋白（ECFP和EYFP，參見圖5）。盡管ECFP比EBFP更亮，其使用呈現(xiàn)兩個優(yōu)點(diǎn)在該ECFP被有效地激發(fā)的氬離子激光器的457納米線，探針不容易地（如在圖2中示出）的光漂白劑

結(jié)合綠色或黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白衍生物可以產(chǎn)生一個有用的，可以容易地分離與發(fā)射光譜探針配對。然而，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇紅色熒光蛋白的變種，由于成熟率差異。此外，因為DsRed的及其衍生物形成四聚體在體內(nèi)預(yù)留，他們可能會產(chǎn)生意想不到的效果的生物學(xué)系統(tǒng)被調(diào)查的蛋白質(zhì)（如比預(yù)期的其他細(xì)胞器聚集或本地化）。目前尚無有效的經(jīng)驗法則可以預(yù)測是否將紅色熒光蛋白衍生物作為融合標(biāo)簽，一些蛋白質(zhì)可能齊聚，而別人不會容忍。對于僅使用熒光蛋白（圖5（a）和圖5（b））相結(jié)合，青色，黃色（或綠色），DsRed的三重標(biāo)記提供了一個很好的解決方案。

成像光學(xué)熒光筆熒光蛋白

熒光筆熒光蛋白利用光學(xué)設(shè)計實驗時，應(yīng)考慮的幾個重要方面，關(guān)于活細(xì)胞成像，顯微鏡配置，載體構(gòu)建，和蛋白質(zhì)的選擇，以優(yōu)化圖像采集參數(shù)。這些獨(dú)特的探頭主要用于監(jiān)測活細(xì)胞中的動態(tài)過程，這往往需要保持細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡舞臺上長時間處于亞健康狀態(tài)。各種專門的加熱成像室制作舞臺插入市售的長期細(xì)胞在顯微鏡維修，但研究者也必須考慮一些必要的輔助要求，如二氧化碳源，輕緊顯微鏡外殼，和振動隔離。總之，成功形象長時期的活細(xì)胞必要的實驗條件下，應(yīng)仔細(xì)著手與光學(xué)熒光筆蛋白實驗前成立。

幾個光學(xué)熒光筆熒光蛋白可以成功地使用傳統(tǒng)的寬視場熒光顯微鏡技術(shù)成像，但嚴(yán)重的定量調(diào)查，涉及的漂白方法和光敏往往必須配備專門的激光系統(tǒng)的多光子共聚焦顯微鏡進(jìn)行。具體而言，PA-GFP，PS-CFP，楓，EosFP，Dronpa所有需要近紫外或紫色的照明光活化或光轉(zhuǎn)化，但成像的蛋白質(zhì)所需的較長波長的光源（藍(lán)色和綠色激發(fā)）。因此應(yīng)配備的紫外或紫色激光，以及可見光激光器，發(fā)射藍(lán)色和綠色光譜線，共聚焦顯微鏡。

當(dāng)下最流行的激光光學(xué)熒光筆配置，雖然紫外線高能量的氬氣，二極管泵浦固態(tài)二極管405納米，488納米氬離子，和一個543納米的氦氖，氦鎘激光可作為光敏（牢記潛在的細(xì)胞損傷工件可以用紫外線照射）。其他有用的成像激光器包括一些新的二極管和氦 - 氖模型和多光譜氪 - 氬系統(tǒng)。最好的多儀器配置與寬帶鈦藍(lán)寶石激光器的波長范圍在750納米到1100納米之間的可調(diào)輸出。

在圖6中示出的是光轉(zhuǎn)化的PS-CFP2 使用405納米二極管激光器的成像和轉(zhuǎn)換，以及氬離子488納米的譜線成像的和跟蹤的人的β -肌動蛋白的熒光蛋白融合產(chǎn)物與光轉(zhuǎn)換蛋白。融合構(gòu)建質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染表達(dá)打成絲狀肌動蛋白在活細(xì)胞成像室負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞（OK）。圖6（a）示出了單電池的光轉(zhuǎn)化之前，用二極管激光器成像。感興趣的區(qū)域周圍畫一大截的肌動蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)（圖6（b）條;紅色框），然后用40％的激光功率在405納米照明。當(dāng)二極管和氬離子激光器（圖6（b）條），成像的光轉(zhuǎn)換PS-CFP2融合蛋白，清晰可見的綠色熒光，對照未轉(zhuǎn)化的探針（藍(lán)色）。10分鐘后（圖6（c）），光轉(zhuǎn)換的肌動蛋白已經(jīng)開始，并入感興趣的區(qū)域之外的長絲，并在30分鐘時（圖6（2））的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)與光學(xué)熒光筆標(biāo)記。

最有效的控制下進(jìn)行的聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF），它可以很方便地用來定義圓形，橢圓形，矩形或手繪選擇照射照明光轉(zhuǎn)換和光活化過程中的具體區(qū)域的劃分標(biāo)本。AOTF還可以進(jìn)行微調(diào)激光功率水平調(diào)節(jié)強(qiáng)度試樣，并能夠使用的技術(shù)被稱為高速通道切換或multitracking的順序掃描標(biāo)本。這種方法使排放的順序激發(fā)和收集一些熒光探針，以避免出血，通過文物，更準(zhǔn)確地單獨(dú)的發(fā)射光譜。

定義地區(qū)的廣角鏡的興趣，提出了更大的挑戰(zhàn)。研究級顯微鏡通常配備照亮選定區(qū)域中的試樣，可以進(jìn)行調(diào)整的可變光圈，雖然用少得多的精度比共聚焦顯微鏡的聲光可調(diào)諧濾波器的系統(tǒng)。廣角儀器也必須配置專門的熒光濾光片組合以圖像的幾個光學(xué)熒光筆蛋白。相比之下，共聚焦和多儀器更適合定量分析細(xì)胞動力學(xué)，利用光電轉(zhuǎn)換和光活化技術(shù)比寬視場顯微鏡，因此應(yīng)為這些應(yīng)用的首選。

產(chǎn)生足夠高的熒光信號電平為最佳的圖像采集也是使用光學(xué)熒光筆時要考慮的一個重要因素。在這方面，可以采用的吸收摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的值的本機(jī)和光轉(zhuǎn)換蛋白物種，以此來衡量，以確定相對的亮度水平。例如，楓和mEosFP都具有相似的光譜帶寬配置的可見光光譜中的綠色（母語）和紅色（光轉(zhuǎn)換）地區(qū)。然而，楓的固有綠色形式大約有綠色mEosFP由于到一個更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的熒光發(fā)射強(qiáng)度或亮度電平的兩倍。因此，在光電轉(zhuǎn)換之前，成像信號 - 噪聲比楓遠(yuǎn)高于mEosFP。光電轉(zhuǎn)換后，這兩種蛋白具有類似的亮度水平（見表1），并產(chǎn)生媲美的圖像。

在當(dāng)前可用的光熒光筆蛋白，Dronpa，楓，mEosFP的是最亮的，其次是PA-GFP，在亮度電平的光轉(zhuǎn)換楓物種類似，但顯著低于天然蛋白。市售的PS-CFP2變種是大約一個半光亮如楓，而火種和PS-CFP蛋白質(zhì)，無論是在本土和光轉(zhuǎn)換形式，是迄今最暗的光熒光筆，收益率只有約25％的亮度電平表現(xiàn)出的光轉(zhuǎn)換的楓（表1）。后者熒光筆生物物鏡具有低豐度的水平，或需要高成像速度的調(diào)查計劃時，應(yīng)考慮的一個因素，在成像過程中，表現(xiàn)出顯著較低的信號信噪比。

結(jié)論

熒光蛋白成像工具，目前的電池使的細(xì)胞生物學(xué)家隨時監(jiān)控在活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動力學(xué)，蛋白質(zhì)，細(xì)胞器和細(xì)胞的行為提供了許多新的見解。這樣做，這些顯著的探頭已經(jīng)迎來穩(wěn)態(tài)和動力學(xué)顯微技術(shù)可以用來破譯途徑和機(jī)制的生物過程在細(xì)胞生物學(xué)的新時代。再加上突飛猛進(jìn)的發(fā)展中的活細(xì)胞成像顯微鏡系統(tǒng)，包括微光電子倍增CCD相機(jī)，旋轉(zhuǎn)盤共聚焦儀器，狹縫掃描顯微鏡，舞臺設(shè)置在整個可見光的熒光蛋白成像和光學(xué)熒光筆和近紅外光譜區(qū)的與近實時精度。