奧林巴斯顯微鏡：霍夫曼調(diào)制對(duì)比的結(jié)構(gòu)

霍夫曼調(diào)制對(duì)比系統(tǒng)，旨在提高可見(jiàn)度和對(duì)比度染色的和有生命的物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)光梯度（或斜坡），并把它們轉(zhuǎn)換成光強(qiáng)度的變化。羅伯特·霍夫曼博士在1975年發(fā)明了這種技術(shù)，并采用了幾個(gè)配件，已經(jīng)適應(yīng)了一些商業(yè)顯微鏡。

霍夫曼調(diào)制對(duì)比度的基本顯微鏡的配置在圖1中示出。一種光振幅空間濾波器，被稱為“ 調(diào)制”的霍夫曼，被插入一個(gè)消色差透鏡或平場(chǎng)消色差物鏡的后焦平面上（雖然也可以用于更高的修正）。通過(guò)本系統(tǒng)的光強(qiáng)度變化的上方和下方的平均的值，它的定義，然后，所述待調(diào)制。用于調(diào)制對(duì)比度的物鏡可以涵蓋整個(gè)10倍到100倍的放大倍率范圍。調(diào)制器具有圖2中描繪的三個(gè)區(qū)域：一個(gè)小的，暗區(qū)的外周附近的后焦平面上，其中只有1％的光（在圖2中標(biāo)記為“ D ”的區(qū)域）發(fā)送;一個(gè)狹窄的灰區(qū)發(fā)送15 ％（在圖2中標(biāo)記為“G”的區(qū)域）和剩余的清晰或透明的區(qū)域，覆蓋大部分領(lǐng)土在后面的物鏡，即100％的光（在圖2中標(biāo)記為“B”的區(qū)域）發(fā)送。相襯顯微鏡中的相位板不同，霍夫曼調(diào)制器被設(shè)計(jì)成不改變相位的任何區(qū)域的光線穿過(guò)。下觀察時(shí)，調(diào)節(jié)對(duì)比度光學(xué)系統(tǒng)，透明的對(duì)象，基本上是無(wú)形的，在普通的明場(chǎng)顯微鏡相梯度決定一個(gè)明顯的三維外觀。該調(diào)制器不介紹在通過(guò)調(diào)制器的不同部分的光通過(guò)的相位關(guān)系的變化，但影響的主要的零階最大值。高階衍射極大值不會(huì)受到影響。使用邁克耳遜干涉儀的測(cè)量證實(shí)了，通過(guò)霍夫曼風(fēng)格的調(diào)制器通過(guò)的光的相位變化而變化（如果有的話）由小于λ/20的一個(gè)因素。

下面的階段，一個(gè)聚光鏡與旋轉(zhuǎn)炮塔利用持有的霍夫曼調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)的其余組件。炮塔的聚光鏡有一個(gè)明場(chǎng)開(kāi)幕孔徑光闌，光圈進(jìn)行定期的明場(chǎng)顯微鏡和校準(zhǔn)，并建立適當(dāng)?shù)臈l件下，科勒照明的顯微鏡。在每個(gè)其他炮塔的開(kāi)口，有一個(gè)偏離中心的狹縫部分地覆蓋有一個(gè)長(zhǎng)方形的小型偏振片。狹縫的大小/偏振器的組合是為每一個(gè)物鏡的不同的放大倍率不同，因此需要的轉(zhuǎn)臺(tái)安排。

霍夫曼的設(shè)計(jì)是這樣的，狹縫位于聚光鏡的前焦平面中，如在圖1和圖3中示出。當(dāng)光線穿過(guò)的離軸的狹縫，這是在其中已經(jīng)安裝了該調(diào)制器的物鏡（也稱為傅里葉平面）的后焦平面成像。包含離軸的狹縫板的聚光鏡的前焦面光學(xué)共軛客觀后焦平面中的調(diào)制器。圖像強(qiáng)度的一階導(dǎo)數(shù)中的切片的光密度成比例，并控制相位梯度的零階衍射圖案。

調(diào)制對(duì)比度的原理提供用于至少兩個(gè)基本調(diào)制器，在圖2和圖3中示出的狹縫板配置。本討論的目的，被夸大和附圖的圖2中所示的調(diào)制器板的尺寸增大。圖2和圖3（圖2（a）和圖3（a））中的左側(cè)上的安排是一個(gè)對(duì)稱的系統(tǒng)，其中調(diào)制器灰色條紋和狹縫被放置在顯微鏡的光學(xué)軸（中心）。在這個(gè)系統(tǒng)中的分辨率被限制為：

分辨率=λ/ NA

其中NA是數(shù)值孔徑的物鏡和λ等于波長(zhǎng)的成像光源的平均。暗（1％的透射率）和輕的或透明的（100％的透射率）的區(qū)域大小是相同的，而灰色區(qū)（15％的透射率）是在一個(gè)狹窄的條紋形式的，出射光瞳的直徑是10％的的物鏡。其他結(jié)構(gòu)（圖2（b）和圖3（b））是不對(duì)稱的或偏移量，其中該調(diào)制器的暗區(qū)位于外部的出射光瞳的物鏡。在本系統(tǒng)中的分辨率大大改善和方法：

分辨率=λ/ 2（NA）

NA和λ的值是相同的，如上面所述。分辨率中的偏移量的系統(tǒng)（圖圖3（b）），這是顯而易見(jiàn)的，幾乎是一樣好，在中央系統(tǒng)（圖3（a））的兩倍。的透明（清除）區(qū)域中的偏移量的系統(tǒng)中，填充與填充其他的10％的灰色區(qū)和暗區(qū)的物鏡出射光瞳的直徑幾乎90％的。

下面的聚光鏡，一個(gè)圓偏振器被放置在顯微鏡的光出射端口的（注意，這兩個(gè)偏振器是低于切片）。該偏振片的旋轉(zhuǎn)，可以控制的狹縫開(kāi)口的有效寬度。例如，一個(gè)“交叉”的兩個(gè)偏振器，在90度到每個(gè)其他的查詢結(jié)果中的“縮小”的狹縫，以便其圖像范圍內(nèi)，如在圖3中所示的調(diào)制器的灰色區(qū)域，。偏振器所控制的狹縫寄存器的部分的調(diào)制器上的亮區(qū)。由于偏振器是旋轉(zhuǎn)，對(duì)比度可以改變以獲得最佳效果。一個(gè)很窄的狹縫產(chǎn)生圖像在對(duì)比中等程度的連貫性是非常高的。光學(xué)部成像的狹縫時(shí)，被調(diào)整到其最窄的位置，也進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)圓偏振器的取向，其振動(dòng)方向平行于偏振片在狹縫，有效的狹縫寬度是處于最大值。這降低了整體圖像的對(duì)比度和連貫性，但能夠產(chǎn)生更好的圖像較厚的物體的折射率存在較大的差異。

早期設(shè)計(jì)的調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)沒(méi)有利用顯微鏡光端口上的狹縫偏振器或圓偏振器，并且如在圖4中所示為一個(gè)對(duì)稱的配置依賴于單個(gè)大小的狹縫。在該圖中，來(lái)自源的光通過(guò)一個(gè)固定的光圈的狹縫（稱為“狹縫板”中的人物），然后通過(guò)檢體含有相梯度。這些梯度偏轉(zhuǎn)光，根據(jù)方向的梯度，進(jìn)入的明確或暗區(qū)的對(duì)稱式調(diào)制器，其定位在后方的物鏡的焦平面。所得到的圖像顯示了一個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)比度是由樣品中的定位和斜率相梯度決定。

在現(xiàn)代先進(jìn)調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)中，調(diào)制器和該狹縫顯微鏡的光軸偏離。這種安排允許良好的分辨率和細(xì)節(jié)中的物鏡和結(jié)果的數(shù)值孔徑的更充分地利用。中呈現(xiàn)的陰影，偽三維的外觀形狀和細(xì)節(jié)。這些出現(xiàn)的一側(cè)上，在中央部的灰，而較暗的另一側(cè)，一個(gè)灰色背景亮。該調(diào)制器的細(xì)節(jié)（陡度，坡度，折射率，或厚度在試片細(xì)節(jié)的變化率）的光相位梯度轉(zhuǎn)換到目鏡膜片的平面中的不同的圖像區(qū)域的強(qiáng)度變化。由此產(chǎn)生的圖像與光學(xué)梯度方向敏感性有一個(gè)明顯的三維外觀。

對(duì)面梯度偏轉(zhuǎn)的狹縫圖像非常暗的部分的調(diào)制器或調(diào)制器的明亮部分，如在圖5中示出的結(jié)果。在該圖中，假設(shè)檢體含有正面和負(fù)面的相位（厚度）的梯度和一個(gè)平面（非梯度）區(qū)域的成像使用調(diào)制對(duì)比度光學(xué)元件。在圖5中所示的負(fù)梯度（一）偏轉(zhuǎn)的調(diào)制器，它是衰減至約1％的前一個(gè)值的暗區(qū)的光進(jìn)入。同樣，在圖5（c），由正梯度進(jìn)入調(diào)制器的透明區(qū)偏轉(zhuǎn)的光不衰減，和100％，該光被發(fā)送到中間圖像平面。任何非梯度的切片的一部分（圖5（b））和背景（環(huán)繞）上注冊(cè)的灰色部分的調(diào)制器，其中約15％的光被發(fā)送到中間圖像平面。其結(jié)果是，從一個(gè)側(cè)面的梯度強(qiáng)度的圖像區(qū)域是暗的。從相反側(cè)的漸變的強(qiáng)度產(chǎn)生一個(gè)明亮的圖像區(qū)域，和非梯度的區(qū)域在圖像上顯示為灰色，一樣的背景。

對(duì)灰色的黑暗和明亮區(qū)域的對(duì)比度（與強(qiáng)度變化）給出了陰影偽浮雕效果。這是典型的調(diào)制對(duì)比度的成像。偏振片的旋轉(zhuǎn)改變?nèi)〉玫膶?duì)比度，在舞臺(tái)上的檢體（相對(duì)于偏振器和偏移量的狹縫）的取向可能會(huì)顯著提高或降低對(duì)比度。

由于調(diào)制器的影響的狹縫的圖像根據(jù)如何切片的詳細(xì)信息轉(zhuǎn)移的圖像的狹縫（和因此在改變光強(qiáng)度的結(jié)果），它描述一個(gè)振幅濾波器。 霍夫曼和其他人已表明，相梯度在切片類似的空間頻率，分布在整個(gè)出射光瞳的客觀。的調(diào)制器的光傳輸強(qiáng)度分布將提供各種各樣的對(duì)象的令人滿意的圖像，產(chǎn)生相位梯度，包括：所有類型的細(xì)胞和組織（兩個(gè)活，染色和未染色），和表面細(xì)節(jié)的晶體的，透明的聚合物，眼鏡及其他類似材料。也是有用的成像在不透明和冶金標(biāo)本和表面細(xì)節(jié)的復(fù)雜的集成電路和其它電子材料的晶粒邊界的反射光的調(diào)節(jié)對(duì)比度顯微鏡觀察。

有許多優(yōu)點(diǎn)和局限性調(diào)制對(duì)比度。的一些優(yōu)點(diǎn)包括更充分地利用物鏡屈服的細(xì)節(jié)，以及良好的標(biāo)本對(duì)比度和可見(jiàn)性優(yōu)異的分辨率的數(shù)值孔徑。雖然許多標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)制對(duì)比度物鏡消色差或平場(chǎng)消色差，但也可以使用具有更高程度的校正光學(xué)像差，如上面所討論的物鏡。許多主要的顯微鏡制造商現(xiàn)在提供熒光校正等級(jí)的調(diào)制對(duì)比度的物鏡，并可以通過(guò)特殊訂單消色差。較舊的物鏡往往可以加裝調(diào)制器的調(diào)制光學(xué)公司，該公司成立由羅伯特·霍夫曼博士，專門建立售后和自定義的系統(tǒng)。

除了使用更高的數(shù)值孔徑與調(diào)制對(duì)比度的優(yōu)點(diǎn)，但也可以使用這種技術(shù)指南“ 光學(xué)切片 “。剖分允許顯微鏡技術(shù)集中在一個(gè)單一的薄膜平面的切片從混亂的圖像所產(chǎn)生的區(qū)域的平面的上方或下方，正集中在無(wú)干擾。顯微鏡的光軸平行的方向上測(cè)量的切片的深度。對(duì)焦的圖像建立正確的切片至圖像距離，允許發(fā)生的衍射波的干擾，在一個(gè)預(yù)先確定的平面（圖像平面）定位在一個(gè)固定的距離從目鏡。這使得衍射要觀看的對(duì)象發(fā)生在切片中的不同深度的水平分開(kāi)，只要有足夠的對(duì)比度。可以通過(guò)順序后面的每一平面上聚焦光學(xué)剖切片的整個(gè)深度。在這個(gè)系統(tǒng)中，定義為從一個(gè)層次到的距離的下一個(gè)發(fā)生的不同的細(xì)節(jié)成像景深，以及所控制的物鏡的數(shù)值孔徑。更高的數(shù)值孔徑物鏡表現(xiàn)出非常淺的景深，并，相反擁有較低的數(shù)值孔徑為物鏡。一個(gè)客觀的隔離和集中在一個(gè)特定的光學(xué)部分的綜合能力的光學(xué)均勻性的標(biāo)本下降而減小。

圖像出現(xiàn)陰影或偽三維，提高可見(jiàn)性，因?yàn)樵谌我粋?cè)上的一個(gè)細(xì)節(jié)的對(duì)比度差異?？腿藳](méi)有光暈圖像中表現(xiàn)出不同，產(chǎn)生的圖像與相襯光學(xué)。調(diào)制對(duì)比度的相位梯度轉(zhuǎn)換成幅度信息的差異是非常不同的相位關(guān)系變化（和光程差），所產(chǎn)生的相襯顯微鏡。使用的的暗灰色地帶，在調(diào)制器產(chǎn)生的圖像包含深淺不一的灰色，并沒(méi)有彩色。通過(guò)生產(chǎn)具有同等的透射率值的彩色區(qū)取代灰色區(qū)和暗區(qū)的調(diào)制器，它有可能引入到調(diào)制對(duì)比度的圖像的顏色。在這種情況下，從相位梯度產(chǎn)生的圖像呈現(xiàn)相似的梯度具有相同的色調(diào)的顏色。目前，我們不知道任何商業(yè)來(lái)源，包含彩色區(qū)域的調(diào)制濾波器。

消色差或平場(chǎng)消色差調(diào)制對(duì)比顯微鏡使用最廣泛的物鏡，因?yàn)樗麄兛梢缘玫胶芎玫膱D像，因?yàn)轭伾粎⑴c。用綠色濾光器（劃歸偏振片）使用這些物鏡，將進(jìn)一步改善圖像因?yàn)橄钔哥R球面校正綠光。更高的校正，包括熒光及消色差，物鏡也可以被用于調(diào)節(jié)對(duì)比度顯微鏡觀察，但增加的費(fèi)用往往是不值得的圖像質(zhì)量的提高，除了在非常高的放大倍數(shù)。

調(diào)制對(duì)比度配件的成本大大低于微分干涉相差（DIC）的設(shè)備。雖然這兩種方法都需要轉(zhuǎn)臺(tái)聚光鏡與相匹配的每一個(gè)物鏡的組件，DIC-設(shè)備齊全的顯微鏡還包含下面的聚光鏡和一個(gè)之前被放置在光路中的中間像平面（上面的物鏡）的分析儀，偏振器。存在的交叉極化系統(tǒng)，DIC顯微鏡所必需的，削弱其效力的樣品反應(yīng)偏振光。

自切片沒(méi)有位于兩個(gè)偏振器之間的，雙折射對(duì)象（巖石薄片，晶體，骨等），可以混淆在DIC的圖像，可以被檢查。另外，切片可以包含不劣化的情況下的圖像，因?yàn)闃O化效應(yīng)的塑料或玻璃容器中，因?yàn)檫@樣的船只，也都超過(guò)這兩個(gè)偏振器中，而不是在它們之間。這使得霍夫曼系統(tǒng)更有用的細(xì)胞，組織和器官培養(yǎng)在塑料容器中進(jìn)行檢查和顯微攝影比DIC。

當(dāng)聚光鏡設(shè)置在明視場(chǎng)的位置，也可以被用于安裝一個(gè)調(diào)制器的物鏡進(jìn)行常規(guī)的明場(chǎng)工作。由于調(diào)制器是離軸，劣化少的圖像的結(jié)果。物鏡（但不是狹縫板聚光鏡）裝有一個(gè)調(diào)制器也可以被用于熒光和暗場(chǎng)工作，但這些物鏡時(shí)，應(yīng)避免嘗試DIC的顯微鏡。的調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)已非常成功地使用用偏光鏡，以提高檢測(cè)的兩個(gè)光學(xué)梯度和切片中的雙折射性。在此應(yīng)用中，使用非偏振光的狹縫和偏振光配置應(yīng)該是平行的偏振器（雖然劃線偏振片也將產(chǎn)生良好的結(jié)果，但與減少的照明）。調(diào)制對(duì)比度改性的一個(gè)目的，是非常有用的，使用普通的偏振光照明而不在聚光鏡中的狹縫板。

霍夫曼調(diào)制對(duì)比系統(tǒng)也有幾個(gè)缺點(diǎn)和限制。圖片必須謹(jǐn)慎對(duì)待，因?yàn)椴煌挠^察者可以“看到”的“山”中的形象為“谷”，反之亦然偽三維圖像，通過(guò)目鏡觀察。垂直于狹縫的長(zhǎng)度，從而在一定程度的技術(shù)人員以取得最佳效果的檢體的取向的要求，該系統(tǒng)是最敏感的梯度。

每個(gè)物鏡和聚光鏡開(kāi)口變形的成本必須被添加到這些配件本身的基本成本。復(fù)雜的，高的數(shù)值孔徑，多元素的物鏡是困難或太昂貴的修改。在最近幾年中，羅伯特·霍夫曼的公司，調(diào)制光學(xué)的頤，紐約（的全資附屬斜翅片公司），已修改的物鏡和聚光鏡。光學(xué)調(diào)制專門修改領(lǐng)先的顯微鏡制造商生產(chǎn)的物鏡。有些物鏡很容易修改，而另一些則很難或不可能修改的調(diào)制光學(xué)規(guī)格。然而，可用于任何物鏡公司的中間管系統(tǒng)，包括一個(gè)廣泛的范圍跨越100倍的顯微鏡物鏡的宏觀相機(jī)鏡頭之一。也包括在這一類的干或浸泡媒體的形象標(biāo)本（油，水和甘油），單個(gè)和多個(gè)波長(zhǎng)的物鏡，反射和透射光的物鏡，和物鏡校正無(wú)論是無(wú)窮大或有限的管長(zhǎng)度設(shè)計(jì)的物鏡。調(diào)制光學(xué)設(shè)計(jì)和制造自己的聚光鏡的系統(tǒng)，以滿足廣泛的數(shù)值孔徑和工作距離組合。

非吸收切片不會(huì)呈現(xiàn)在顏色，與觀察到的包含半透明的彩色濾光片中的灰色區(qū)和暗區(qū)的地方的使用一個(gè)特殊的調(diào)制器的異常。呈現(xiàn)出的切片，自然吸收的特定波長(zhǎng)或淡染的顏色以及與調(diào)制對(duì)比度和熒光的組合或與組合的調(diào)制信號(hào)的對(duì)比度和偏振光觀察到的那些。

霍夫曼調(diào)制對(duì)比度顯微鏡的配置是直線前進(jìn)，基本步驟概括如下：

霍夫曼調(diào)制對(duì)比度在透射光

· 顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器，將相關(guān)的調(diào)制對(duì)比度功能的物鏡，并包含適當(dāng)?shù)目p隙板安裝在炮塔聚光鏡。如果在顯微鏡配備作微分干涉相差（DIC）或偏光顯微鏡，去除所有的偏光板，相位差板，和渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡從光路。

· 在舞臺(tái)上放置一個(gè)染色標(biāo)本（最好是一個(gè)組織薄片），并使用10倍的物鏡（安裝調(diào)制器），在顯微鏡對(duì)準(zhǔn)適當(dāng)?shù)?/span>科勒照明在我們上解剖顯微鏡的部分，概述。調(diào)節(jié)對(duì)比度狹縫板應(yīng)該從聚光鏡進(jìn)行此操作。，如果炮塔聚光鏡有一個(gè)明場(chǎng)照明孔徑光闌位置，旋轉(zhuǎn)炮塔選擇這聚光鏡。

· 查看的調(diào)制器的板的后焦平面上的物鏡，使用伯川德透鏡（常見(jiàn)的偏振光顯微鏡），一個(gè)相位望遠(yuǎn)鏡，或者通過(guò)簡(jiǎn)單地除去的目鏡和對(duì)等的眼睛管。請(qǐng)某些該樣本是從光路中，或者它被移動(dòng)到一個(gè)明確區(qū)域的顯微鏡載玻片上除去。

· 選擇的狹縫板，其對(duì)應(yīng)于通過(guò)移動(dòng)到光路中的適當(dāng)?shù)?/span>聚光鏡（從轉(zhuǎn)盤）10x物鏡。應(yīng)該有一組調(diào)整螺釘或桿，使得聚光鏡內(nèi)的照明狹縫板的旋轉(zhuǎn)和平移。

· 將圓偏光顯微鏡的光過(guò)濾器，聚光鏡下方的端口。此過(guò)濾器旋轉(zhuǎn)，同時(shí)觀察通過(guò)伯特蘭透鏡（或相位望遠(yuǎn)鏡）的狹縫圖像，并觀察到的旋轉(zhuǎn)角度影響的光量（亮度），通過(guò)偏振器的狹縫部分。

· 翻譯的狹縫，使得開(kāi)口部缺乏偏振片疊加在灰色區(qū)域，如在圖3（b）中所示的調(diào)制器板的圖像。含有偏振材料的狹縫的部分應(yīng)當(dāng)被成像在清澈的調(diào)制器部分的灰色區(qū)域正右方。旋轉(zhuǎn)的圓形的偏振濾光器，并觀察含有偏振材料的狹縫的區(qū)域如何出現(xiàn)和消失。當(dāng)?shù)膱A偏振器的振動(dòng)面垂直方向取向的偏振器的振動(dòng)面的狹縫，狹縫的大小，如果最小化，并得到最大的對(duì)比度。這個(gè)動(dòng)作可以練習(xí)使用的互動(dòng)Java教程：

· 刪除伯特蘭透鏡或相望遠(yuǎn)鏡和，更換的眼睛管顯微鏡的目鏡。標(biāo)本放置在舞臺(tái)上的候選人，與10倍的物鏡和重點(diǎn)。

· 重新調(diào)整視場(chǎng)光闌調(diào)整聚光鏡的位置，以獲得清晰的對(duì)焦。打開(kāi)明場(chǎng)孔徑光闌，直到它外面的視野。

· 現(xiàn)在已經(jīng)準(zhǔn)備好觀察和顯微攝影與調(diào)制對(duì)比度的圖像。旋轉(zhuǎn)的檢體和/或圓偏振器的顯微鏡的基礎(chǔ)上，以實(shí)現(xiàn)最佳的對(duì)比度。這些設(shè)置會(huì)有所不同標(biāo)本標(biāo)本。

· 重復(fù)上面的步驟，每次不同的放大倍率選擇用于觀看的切片調(diào)制對(duì)比度。

再一次，我們發(fā)現(xiàn)，操縱光的聚光鏡的前焦面（由裝置的一個(gè)偏移量的狹縫）和操縱的光的后焦平面上的物鏡（偏移調(diào)制器）可以有一個(gè)顯著的效果呈現(xiàn)的圖像時(shí)在目鏡。