尼康顯微鏡：活細(xì)胞成像的培養(yǎng)室
標(biāo)本室是一個(gè)不可或缺的關(guān)鍵分支，在活細(xì)胞成像的歷史和廣泛的設(shè)計(jì)描述系統(tǒng)，提供卓越的光學(xué)性能，同時(shí)允許不同時(shí)間量要保持標(biāo)本多年來已經(jīng)發(fā)布。從密封蓋玻片載玻片上，使幾乎所有的環(huán)境變量的嚴(yán)格控制到復(fù)雜的灌注室編寫的簡(jiǎn)單的復(fù)雜程度不等，培養(yǎng)室被設(shè)計(jì)為，允許活標(biāo)本觀察微創(chuàng)高分辨率。
不管他們的設(shè)計(jì)，活細(xì)胞成像室必須滿足各種要求，才能被成功地應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)中。應(yīng)易于消毒室，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境完全隔離觀察期間盡量減少暴露在污染源有蓋或密封。另一方面，培養(yǎng)室還提供細(xì)胞的不復(fù)雜的進(jìn)入，如果調(diào)查涉及顯微注射，加入的試劑（如藥物或代謝物），細(xì)胞的物理處理，或向培養(yǎng)基中的變化。如果隨后通過克隆或合成熒光或免疫熒光成像結(jié)束后，固定和染色的培養(yǎng)的活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，腔室必須被配置為允許去除蓋玻片。
培養(yǎng)室的尺寸，其中包括整體的大小，比表面積大的細(xì)胞培養(yǎng)，沖洗細(xì)胞介質(zhì)（或緩沖液）的體積，是重要的考慮因素。除了容易地被容納的顯微鏡載物臺(tái)，培養(yǎng)室必須足夠大，在其橫向尺寸來作詳細(xì)的采樣人口中包含了足夠的細(xì)胞。周圍介質(zhì)的深度應(yīng)最小化，以確保最高的可能性光學(xué)透射光的質(zhì)量和輔助細(xì)胞，但它也必須足夠深，以提供一個(gè)健康的環(huán)境。塑料蓋玻片應(yīng)避免由于其固有的自體熒光和應(yīng)變雙折射，干擾某些成像模式。只有最高質(zhì)量的蓋玻片應(yīng)，應(yīng)具有較強(qiáng)的酸或堿清洗和徹底清洗。商業(yè)培養(yǎng)室的可靠性，通用性和成本變化。，以確定是否需要一個(gè)復(fù)雜的（通常是昂貴的）的腔室，或者如果更大數(shù)量的簡(jiǎn)單的培養(yǎng)皿就足夠了設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮這些因素。在最后的分析中，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，沒有完美的培養(yǎng)室的所有宗旨和許多妥協(xié)往往是必要的，以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像的成功。
兩個(gè)高性能的商業(yè)孵化和灌注商會(huì)為活細(xì)胞成像，如圖1所示。在圖1（a）的開放室系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為用于與具有稠合到基座的蓋玻片的35毫米的培養(yǎng)皿中，并設(shè)有為-5至50攝氏度的工作溫度控制在一個(gè)范圍內(nèi)的珀耳帖熱泵。多個(gè)的灌注系統(tǒng)選項(xiàng)啟用連續(xù)灌注在一個(gè)恒定的溫度，連續(xù)灌注，靜態(tài)孵化培養(yǎng)基（無灌注），通過灌注溫度急劇變化或引進(jìn)。腔室的流體的高度調(diào)整用螺桿機(jī)構(gòu)連接的吸入口，消除了交換介質(zhì)的過程中，流體撲。腔室還配備了一個(gè)單一的通道補(bǔ)丁夾緊耦合到涂有聚四氟乙烯的以及具有氯化銀電極，以形成鹽橋，在要求低噪音的電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。氣體流過腔頂部提供了改進(jìn)的溫度均勻性和pH值控制。在圖1（b）的封閉小室系統(tǒng)包含一個(gè)獨(dú)特的雙重角色灌注系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，是由介質(zhì)的控制數(shù)據(jù)流在一個(gè)通道的載玻片（稱為微渡槽）也涂有導(dǎo)電層流透明的銦錫氧化物薄膜進(jìn)行溫度控制。該系統(tǒng)可以工作流率從靜態(tài)通過快速的介質(zhì)交流與細(xì)胞表面的低剪切跨越一個(gè)溫度從環(huán)境溫度到50攝氏度。碳酸氫鹽和有機(jī)緩沖液是兼容的腔室，這是連接到一個(gè)獨(dú)立的控制器單元。
歷史視角
第一個(gè)活細(xì)胞成像室設(shè)計(jì)和建造后不久，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)二十世紀(jì)初。這些早期的室利用燃燒芯，來控制流動(dòng)的介質(zhì)通過的玻璃窗的玻璃容器或軟木外殼。最終，一些灌注式生長(zhǎng)室構(gòu)造的意圖被用于使用光學(xué)顯微鏡的時(shí)期內(nèi)可獲得長(zhǎng)期的成像。到了20世紀(jì)50年代和60年代，更復(fù)雜的活細(xì)胞成像室被設(shè)計(jì)用于高分辨率的調(diào)查，納入相位和微分干涉對(duì)比顯微鏡（DIC）的新興技術(shù)。負(fù)擔(dān)得起的技術(shù)和耦合器交配電影膠片相機(jī)與顯微鏡的完善，在20世紀(jì)60年代末和70年代初，研究人員能夠系統(tǒng)地調(diào)查時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞高時(shí)空分辨率，使用越來越復(fù)雜的成像室。
成像室，在20世紀(jì)70年代和80年代開發(fā)的，基于標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)涉及兩個(gè)蓋玻片，橡膠O型圈或類似墊片由一對(duì)分開，成架制成的兩個(gè)金屬板夾層。這種常見的動(dòng)機(jī)，遭受一些陷阱，包括無法交換培養(yǎng)基或添加測(cè)得的藥物或代謝物的等分試樣，盛行了很多年。更先進(jìn)的灌注腔最終構(gòu)建通過修改這個(gè)基本的設(shè)計(jì)，以使連續(xù)加入新鮮的培養(yǎng)基和其它試劑的間歇添加。然而，許多這些早期的腔室的設(shè)計(jì)，主要的缺點(diǎn)是缺乏注意層流，化學(xué)梯度的形成最小化的一種方法，其中通過作為介質(zhì)的平穩(wěn)過渡將被替換。層流，確保兩個(gè)解決方案不成為湍流混合在更換過程中，以避免生成的化學(xué)梯度。既簡(jiǎn)單又復(fù)雜的成像商會(huì)在過去幾年的持續(xù)發(fā)展，導(dǎo)致優(yōu)秀的設(shè)計(jì)，適合大多數(shù)成像方案的要求。
幾個(gè)活細(xì)胞成像室最初被設(shè)計(jì)在20世紀(jì)后期，如圖2所示。這些腔室的變化是可商購(gòu)的，衍生的配置已在許多實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建。在圖2（a）所示腔室羅伯特·天艾倫和Andrew鮑耶爾從原設(shè)計(jì)的是一個(gè)第二代的版本，并在灌注實(shí)驗(yàn)中使用的一個(gè)直立顯微鏡的目的。大直徑排氣口的機(jī)會(huì)減少開裂的蓋玻片，并可以輕松地修改以適應(yīng)一個(gè)倒置的組織培養(yǎng)儀室。雖然價(jià)格相對(duì)低廉的建立，這間密室不會(huì)產(chǎn)生理想的層流特性。德沃夏克Stotler室風(fēng)格呈現(xiàn)在圖2（b），設(shè)有圓形蓋玻片和墊圈，定期市售的幾個(gè)廠家，但也比較容易構(gòu)建。在每小時(shí)1毫升灌注率，在德沃夏克Stotler室產(chǎn)生一個(gè)干凈的蓋玻片表面流過，清掃模式。圖2（c）代表了一個(gè)復(fù)雜的設(shè)計(jì)在20世紀(jì)50年代初，最初是從研磨拋光有機(jī)玻璃灌注室的透視圖。啟用的標(biāo)本，在高分辨率下連續(xù)灌注的能力，這種設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)是缺乏令人滿意的層流特性。圖2給出了該商會(huì)代表在文獻(xiàn)中出現(xiàn)的許多設(shè)計(jì)在過去的50年，只有少數(shù)幾個(gè)。
如今，活細(xì)胞成像室廣泛商業(yè)化，從簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，安裝在顯微鏡玻片上，復(fù)雜的系統(tǒng)，能夠控制幾乎所有方面的環(huán)境。雖然許多研究者（特別是那些獲得的機(jī)修車間）繼續(xù)他們的實(shí)驗(yàn)，以滿足特定的要求專門制作室，現(xiàn)在商會(huì)廣泛的支配單位，擁有先進(jìn)的層流，聚合物建設(shè)，以及高清晰度的能力以合理的成本可購(gòu)買的。強(qiáng)調(diào)的是，任何培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)的最重要的方面是要能夠保證和驗(yàn)證，細(xì)胞培養(yǎng)是健康的，處于正常的時(shí)間刻度上的增長(zhǎng)，以及提供足夠的顯微鏡的光學(xué)窗口，以確保培養(yǎng)成像可以在足夠高的數(shù)值孔徑的實(shí)驗(yàn)，以滿足分辨率的要求進(jìn)行。
簡(jiǎn)單的顯微鏡載玻片和培養(yǎng)皿成像室
短期成像實(shí)驗(yàn)中（20?30分鐘或更小），可以簡(jiǎn)單地進(jìn)行附加到載玻片含有貼壁細(xì)胞的蓋玻片，使用隔離物，以保持細(xì)胞的損壞（物理應(yīng)激可誘導(dǎo)某些細(xì)胞系中的自發(fā)熒光）。能夠確保蓋玻片與一些密封劑，包括熔化的瓊脂糖，橡皮泥，真空潤(rùn)滑脂，或一個(gè)有用的制劑稱為VALAP（凡士林，羊毛脂，石蠟的1:1:1的混合物）的任何一個(gè)，以提供水密密封和消除培養(yǎng)基中（圖3（a）中示出）的蒸發(fā)。由硅橡膠（市售）或碎片的蓋玻片的切薄的墊片，可以用作隔離物，以保持細(xì)胞的直接接觸的顯微鏡載片上（圖3（b））。組裝時(shí)這些腔，使蓋玻片表面含有細(xì)胞正面朝下放置在隔板上，并填寫蓋玻片和載玻片之間的空隙用生理緩沖液（如磷酸鹽緩沖液PBS）或營(yíng)養(yǎng)組織培養(yǎng)基。密封蓋玻片的邊緣周圍使用的試劑的選擇，并在舞臺(tái)上觀察放置在顯微鏡載片上。細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，溫度控制的情況下，將正常的只有幾分鐘，但是這往往是足夠的時(shí)間來獲得必要的圖。于短期存儲(chǔ)，而不會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞生存力，滑動(dòng)被放置在二氧化碳培養(yǎng)箱或旁邊的顯微鏡圖像采集會(huì)話之間的一個(gè)小加熱塊。此外，為了避免在儲(chǔ)存過程中損失的緩沖區(qū)或培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)之間，滑動(dòng)可以放置在一個(gè)小的加熱濕度室。
合成的O形環(huán)（圖3（c））或類似形狀的圓形墊片（如三孔活頁夾用于加固片）提供了一個(gè)方便的替代平面硅膠墊片（圖3（b）），并且可以很容易地密封與上面所討論的任何安裝的混合物。在許多情況下，圓形墊片足夠厚，以增加量的介質(zhì)或緩沖區(qū)可用洗澡的細(xì)胞，細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)是少安裝時(shí)。含有貼壁細(xì)胞，薄的組織切片，胚胎，或小的完整的生物體的蓋玻片往往可以更容易地成像代較厚的單井凹的載玻片是標(biāo)準(zhǔn)的載玻片（圖第3（d））。這些載玻片約3毫米厚（1毫米的傳統(tǒng)玻璃載玻片），使他們能夠適應(yīng)有比較深的腔（2毫米）。的以及擁有更大體積的緩沖液或者培養(yǎng)基中相比，可以夾著平坦的滑動(dòng)和蓋玻片和類似的O型圈，將不太可能在安裝過程中對(duì)細(xì)胞造成損害，抑郁癥。在下行路上，厚厚的設(shè)計(jì)和弧形墻壁是不兼容傳輸高分辨率成像對(duì)比增強(qiáng)（相襯，DIC，霍夫曼調(diào)制對(duì)比; HMC）模式。但是，熒光成像，這依賴于落射照明的蓋玻片，是不會(huì)受到井。
在前面的段落所描述的簡(jiǎn)單的顯微鏡載玻片配置使用正置顯微鏡主要用于通過較厚的玻片的蓋玻片，而不是使細(xì)胞可以成像。在某些情況下，尤其是當(dāng)使用固體粘合劑，所安裝的滑動(dòng)可以打開，倒置顯微鏡上觀察到無有害影響。另外，如果包含的校正衣領(lǐng)一個(gè)高分辨率的干物鏡，試樣通?？梢员怀上竦?/span>物鏡像差校正因子是通過底部的載玻片，如果能夠以補(bǔ)償額外的厚度（1毫米）。一個(gè)更靈活的配置，這是適用于直立和倒置顯微鏡，可通過在玻璃或塑料顯微鏡載片上鉆一個(gè)1厘米的孔，安裝蓋玻片的一側(cè)使用指甲油，硅酮密封膠，或其中一個(gè)的新的先進(jìn)的粘合劑，可在硬件分銷商（在圖3（e））。腔“以及”可與培養(yǎng)基或緩沖液填充和裝配在上側(cè)與第二蓋玻片含有貼壁細(xì)胞，瞬時(shí)與VALAP安裝。如果蓋玻片小心地放置在一個(gè)完整的，很好地避免截留的氣泡，光學(xué)透明的路徑建立兩者之間的蓋玻片。否則，將被創(chuàng)建的彎月形的氣泡，可以在透射照明模式下拍攝的圖像失真。此配置優(yōu)化使用正置顯微鏡。一種替代的加載技術(shù)，更適合于倒置顯微鏡，包括永久連接的蓋玻片覆蓋中所描述的細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第二蓋玻片上生長(zhǎng)的細(xì)胞。
各種各樣的商業(yè)顯微鏡玻片培養(yǎng)室設(shè)計(jì)可滿足許多短期的活細(xì)胞研究的要求。在這些范圍內(nèi)的復(fù)雜性，從簡(jiǎn)單的塑料培養(yǎng)瓶和稠合到玻璃顯微鏡載物片上的多井外殼復(fù)雜的集成系統(tǒng)，使灌注的操作，流的研究，多個(gè)相互隔離的文化的快速檢測(cè)，3為圖第3（f）所示，通過（I）。所謂的“實(shí)驗(yàn)室上的一個(gè)滑動(dòng)裝置”系統(tǒng)是描繪在圖3（f）的多室設(shè)計(jì)，提供多種格式的，范圍從一個(gè)單一的大腔室數(shù)（最多18）較小的腔室在一個(gè)單一的玻璃載片（圖3（f）的腔室中有4個(gè)矩形孔）。這些多才多藝，自足室都配有一個(gè)松散的塑料蓋，使氣體交換，但可以成為一個(gè)問題，由于半月板和雙折射塑料成像時(shí)，傳輸模式。另外，通過腔室的設(shè)計(jì)限制啟動(dòng)，氣體交換的量的時(shí)間，可以在外面的二氧化碳培養(yǎng)箱細(xì)胞不進(jìn)行pH值升高的情況下，除非在滑蓋內(nèi)的環(huán)境控制腔成像?？梢缘玫筋愃频那皇?，是融合，以1毫米的玻璃顯微鏡載物片或170微米的蓋玻片，這兩者都用于可視化倒置顯微鏡下生長(zhǎng)的細(xì)胞。的活細(xì)胞觀察時(shí)段結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞固定，染色，直接在生長(zhǎng)室中，然后將其安裝滑動(dòng)或蓋玻片除去。
圖3（g）中示出的商用成像室結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)物的便利性，在培養(yǎng)皿中的光學(xué)質(zhì)量的玻璃顯微鏡載片上，使用各種各樣的對(duì)比度模式的高分辨率成像。觀察信道連接的兩個(gè)介質(zhì)儲(chǔ)層體積為100微升，5毫米寬，使一個(gè)大的細(xì)胞群的觀察。流通過該信道可以被啟動(dòng)填充水庫之一。由圖3（H）室岔通道精選可以購(gòu)買專門的涂料涂層或處理模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞增長(zhǎng)。在通道末端的魯爾式適配器允許適應(yīng)灌注系統(tǒng)精確調(diào)節(jié)流速和剪切應(yīng)力。這種類型的培養(yǎng)室是針對(duì)特定研究賽場(chǎng)的定制設(shè)計(jì)的一個(gè)很好的例子。類似的腔室，圖3中的（一）所示，設(shè)計(jì)為容納非常小體積（10微升）中的干細(xì)胞分化的檢測(cè)性能，分子識(shí)別與結(jié)合的研究，以及在基于熒光結(jié)合常數(shù)的測(cè)定成像。5個(gè)平行通道均配備一個(gè)單獨(dú)的介質(zhì)水庫，以提高吞吐量。各種各樣的專門室設(shè)計(jì)市售許多針對(duì)經(jīng)濟(jì)的材料和在具體調(diào)查的執(zhí)行效率。
培養(yǎng)皿中的各種配置專為高分辨率活細(xì)胞成像市售（見圖4）。最簡(jiǎn)單的，也許是最多才多藝的設(shè)計(jì)包括一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的35或50毫米的一次性培養(yǎng)皿中設(shè)有一個(gè)圓形開口（10，14，或20毫米）切成附著表面的中心，高品質(zhì)的硼硅蓋玻片覆蓋使觀察的活細(xì)胞，在高分辨率（圖4（a））。腔室可無涂層或涂有薄薄的一層粘合促進(jìn)劑如聚-D-賴氨酸或膠原。被稱為玻璃底菜，這些成像室可在6，12，24孔版本（圖4（C）），多培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。類似的設(shè)計(jì)（圖4（b）條）設(shè)有一個(gè)自定義的培養(yǎng)皿中，包含了大量的圓形蓋玻片覆蓋了整個(gè)修改后的菜基地。這些菜也可以在各種尺寸，可以購(gòu)買有緊密裝有蓋子，以確保氣氛，不像傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿中有氣體交換的寬松蓋。雖然標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯培養(yǎng)皿中，可以采用常規(guī)的低分辨率觀測(cè)（直接穿過塑料）具有較長(zhǎng)的工作距離的物鏡，具有校正鋌，使用高數(shù)值孔徑（1.2?1.4）耦合到油或水浸泡的物鏡需要修改后的玻璃底的版本。
陪替氏培養(yǎng)皿培養(yǎng)室，在大多數(shù)情況下，比在圖3中所示的顯微鏡滑動(dòng)可以容納較大體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中或成像緩沖器基本上充滿了。介質(zhì)量增加的危險(xiǎn)降到最低溫度或pH值的突然變化和長(zhǎng)期培養(yǎng)，提供了優(yōu)越的生長(zhǎng)環(huán)境。這些腔室的另一個(gè)好處是，融合的陪替氏培養(yǎng)皿的底部，使蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞后直接從孵化器中轉(zhuǎn)移，而不是潛在的創(chuàng)傷誘導(dǎo)加載種子蓋玻片或分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成一個(gè)專門的成像室高分辨率成像。在實(shí)踐中，含有轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（表達(dá)熒光蛋白）的培養(yǎng)物可以被反復(fù)來回傳輸之間的加濕二氧化碳培養(yǎng)箱和顯微鏡載物臺(tái)定期觀察或記錄很少或根本沒有損壞細(xì)胞的圖像。此外，越來越多的商業(yè)售后加熱載物臺(tái)和封閉顯微鏡孵化器旨在保持35毫米的玻璃培養(yǎng)皿底部長(zhǎng)期時(shí)間推移成像序列。
圖3和圖4（效果，顯微鏡載玻片和培養(yǎng)皿）中所示的簡(jiǎn)單的活細(xì)胞成像室可以經(jīng)常洗滌，消毒，并在多個(gè)場(chǎng)合重復(fù)使用。第一步是要徹底清潔室用清潔劑，然后通過窮舉用蒸餾水或去離子水漂洗，在無塵的容器中，在室溫下干燥數(shù)天。更困難的情況下，特別是對(duì)那些已暴露于藥物，干燥介質(zhì)，或細(xì)胞粘附試劑的腔室和載玻片，單位可以預(yù)先用乙醇浸泡清洗或稀釋的酸溶液，但這種治療應(yīng)避免與腔室，使用膠水或其它溶劑為基礎(chǔ)的粘合劑，以確保一個(gè)脆弱的蓋玻片，玻璃，金屬，或塑料。清洗和干燥后，通過高壓滅菌（不推薦）或治療用紫外線燈在黑暗的機(jī)柜15分鐘滅菌室。作為一種經(jīng)濟(jì)而快速的替代方案，許多簡(jiǎn)單的孵化室可消毒用乙醇洗滌，并在無菌的層流罩干燥。
可以觀察到，雖然安裝在載玻片上的細(xì)胞培養(yǎng)，或在玻璃底培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)瞬時(shí)顯微鏡舞臺(tái)上幾分鐘，在室溫下，各種商業(yè)設(shè)備已制造可以采用更長(zhǎng)的時(shí)間，使這些簡(jiǎn)單的成像室期間的時(shí)間。被稱為暖載物臺(tái)或載物臺(tái)孵化器，所有這些單位提供本地化的溫度調(diào)節(jié)（見圖5），而更先進(jìn)的設(shè)計(jì)，也使有限的氣氛控制和遏制能力灌注。為標(biāo)準(zhǔn)尺寸的顯微鏡載物片（1×3英寸，請(qǐng)參閱圖5（a）和圖5（b））的保溫板適合用于保持圖3中所示的腔室的溫度控制，并容易地適應(yīng)大多數(shù)顯微鏡，通常用剪輯的原始載物臺(tái)。圖5中所示的滑動(dòng)套（一）功能，完全包含在一個(gè)加熱室之內(nèi)的顯微鏡載片上的金屬頂板。不幸的是，在打開的光圈，這是不加熱的板蓋玻片下觀察試樣區(qū)域所在。傳熱問題的玻片標(biāo)本又因采用大光圈較小的觀賞區(qū)，雖然經(jīng)常會(huì)造成額外的問題阻礙體積較大的高數(shù)值孔徑物鏡的運(yùn)動(dòng)。在圖5（b）所示的加熱的滑動(dòng)保持器被設(shè)計(jì)為適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的倒置顯微鏡，并設(shè)有一個(gè)較小的光圈，以犧牲可用的觀察區(qū)域提供更均勻的試樣的溫度控制。
在最先進(jìn)的顯微鏡載片上保暖多井室載玻片的孵化器在圖5（c）所示，其目的是提供一種高度可控的環(huán)境（圖5（f）中示出了一個(gè)類似的載玻片），調(diào)節(jié)pH值，溫度，灌注的本地化的氣氛。孵化器利用珀?duì)柼募夹g(shù)，通過5至50攝氏度的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行加熱或冷卻的試樣，最多可容納4個(gè)溫度調(diào)節(jié)灌注線以及氣體灌流。這個(gè)孵化器系統(tǒng)在眾多獨(dú)特的功能，是一個(gè)磁性底座，便于在顯微鏡配置和一個(gè)特別設(shè)計(jì)的抽吸去除灌流干擾最小液位。所描述的滑動(dòng)套和孵化器在圖5（a）至5（c）是連接到一個(gè)單獨(dú)的控制單元，保持溫度和其他必要的變量（如灌注和大氣調(diào)節(jié)）的每個(gè)設(shè)備。
培養(yǎng)皿孵化器（見圖5（D）5條（f））在設(shè)計(jì)和執(zhí)行簡(jiǎn)單的顯微鏡載玻片暖載物臺(tái)相似。最初級(jí)的版本，在圖5（d）所示，包括一個(gè)加熱平臺(tái)是容易地適應(yīng)任何倒置顯微鏡載物臺(tái)，可容納高達(dá)10厘米直徑的陪替氏培養(yǎng)皿。貼壁或懸浮細(xì)胞觀察變暖板通過一個(gè)中心孔。即使不直接在上面居住光圈細(xì)胞加熱板在較長(zhǎng)的觀察，可能會(huì)遇到的可行性問題，這道菜可以很容易地觀看到光圈旋轉(zhuǎn)移動(dòng)相鄰地區(qū)的文化?；蛘?，較小的陪替氏培養(yǎng)皿（直徑為35或60毫米）可以更均勻地加熱，并觀察到使用這種溫暖的。更先進(jìn)的培養(yǎng)皿溫暖的對(duì)角線位置的縫隙，而不是設(shè)計(jì)一個(gè)圓形的光圈是描繪在圖5（E）。這個(gè)孵化器可以不等，面積從60至100毫米的培養(yǎng)皿中，一個(gè)較小的版本是35毫米的菜肴。的對(duì)角線狹縫跨越陪替氏培養(yǎng)皿的中心的周邊區(qū)域，可以用來檢查通過緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)盤在觀察期間，幾乎整個(gè)培養(yǎng)。狹縫相鄰的細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臏囟龋m然與直接定位在開口部由于熱梯度的波動(dòng)。
6孔板載物臺(tái)孵化器在圖5中所示的（六）被設(shè)計(jì)為插入到倒置顯微鏡，并提供了充分控制的環(huán)境，使長(zhǎng)期成像的一些文化。溫度調(diào)節(jié)到10攝氏度的（這是連續(xù)監(jiān)測(cè)，通過比較參考），通過循環(huán)水系統(tǒng)連接外部恒溫控制洗澡室。一個(gè)單獨(dú)的控制單元的混合物與空氣中的二氧化碳，然后將其連續(xù)地輸送到孵化器腔，而在腔室提供了一個(gè)蓄水池，以提供恒定的相對(duì)濕度。得到眾多的配件，以容納兩個(gè)35毫米的培養(yǎng)皿中，多室玻片（圖3（f）），以及可更換的適配器裝入12至96多井板和單蓋玻片室的腔室。這種先進(jìn)的系統(tǒng)是非常有用的各種應(yīng)用，從藥品檢測(cè)范圍在廣角和共聚焦顯微鏡觀察熒光。
孤立的，未封閉的陪替氏培養(yǎng)皿和顯微鏡載物片，也可以保持在或接近生理溫度下，用類似操作的方式類似的吹風(fēng)機(jī)（如圖6所示）或孵化加熱器的熱空氣的設(shè)備。雖然溫度的調(diào)節(jié)是有限的，以一個(gè)度的幾十分之一，即使與比例控制器的應(yīng)用程序和遠(yuǎn)程熱傳感器監(jiān)控器，送風(fēng)機(jī)的空氣流直接到培養(yǎng)室和周邊顯微鏡份（第一載物臺(tái)，物鏡聚焦和聚光鏡），提供快速響應(yīng)的溫度漂移。此外，施用藥物和介質(zhì)的變化是暢通的標(biāo)本。不利的一面，開放的文化生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿中，并用熱風(fēng)機(jī)加熱緩慢釋放二氧化碳和水的pH值和滲透壓逐漸漂移室。這一事實(shí)限制了使用鼓風(fēng)機(jī)開放商會(huì)短期觀測(cè)，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。與此相反，封閉腔室系統(tǒng)（下面討論），可以保持更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，利用鼓風(fēng)機(jī)?？諝獯碉L(fēng)機(jī)的另一個(gè)缺點(diǎn)是，試樣的溫度不斷變動(dòng)（即使在一個(gè)窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行），開啟或關(guān)閉時(shí)，空氣流，這可能會(huì)導(dǎo)致焦點(diǎn)漂移。培養(yǎng)條件可以增加整體的穩(wěn)定性和漂移水平的降低環(huán)境柜周圍顯微鏡耦合強(qiáng)制的熱空氣吹風(fēng)機(jī)。紅外燈也采用溫暖的文化，但是它們也有從與鼓風(fēng)機(jī)所遇到的類似問題。
如圖5所示的加熱裝置大部分都限制領(lǐng)域觀察活細(xì)胞（通常只有幾毫米），需要特別注意，以確保有足夠的凈空物鏡翻譯舒適的光圈范圍內(nèi)?，F(xiàn)代高數(shù)值孔徑的油和水浸泡物鏡是相當(dāng)大的，有很短的工作距離，可能是這樣笨重的碰撞與保溫器，具有過厚的堿或太多上面的顯微鏡載物臺(tái)安裝。此外，翻譯的跨培養(yǎng)室的玻璃表面上油物鏡的能力可能會(huì)受到嚴(yán)重限制上存在許多暖載物臺(tái)的小孔徑。當(dāng)選擇一個(gè)載物臺(tái)為活細(xì)胞成像溫暖，研究者應(yīng)光圈和物鏡尺寸進(jìn)行比較，以確保一個(gè)足夠大的面積，可以觀察到的培養(yǎng)室。
幾個(gè)載玻片和陪替氏培養(yǎng)皿的保暖或孵化室上面所討論的（圖5）可任選配備有絕緣墊隔離加熱平臺(tái)從舞臺(tái)，這一措施阻礙顯微鏡幀，通過熱傳導(dǎo)的金屬部分的熱損失。作為替代方案，這些加熱板，塑料或復(fù)合材料制成的，以減少熱損失的絕緣片上的薄的層（1?2毫米），可被安裝。需要注意的是在顯微鏡載物臺(tái)和幀是良好的熱導(dǎo)體，并能迅速克服了典型的控制器，用來控制加熱板的加熱能力有限。通常的結(jié)果是一個(gè)漸進(jìn)的溫度下降（尤其是附近的光圈），這將影響細(xì)胞的活力和呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果懷疑。另外重要的一點(diǎn)是必須考慮的，涉及到這些設(shè)備的實(shí)際性能。雖然在培養(yǎng)皿和載玻片暖通常具有優(yōu)良的溫度調(diào)節(jié)（十分之一的攝氏度），由于其比例控制器的準(zhǔn)確性，根據(jù)觀察試樣區(qū)域的實(shí)際溫度往往偏離設(shè)定溫度，由于梯度創(chuàng)建跨光圈。出于這個(gè)原因，簡(jiǎn)單的載物臺(tái)保暖耦合額外的加熱裝置，如物鏡的加熱器或封閉的環(huán)境的腔室，可能是必要的，以確保細(xì)胞生存力，在延長(zhǎng)的成像會(huì)議。
幾乎所有在本節(jié)討論的簡(jiǎn)單成像室是不是在與環(huán)境的平衡，應(yīng)僅限于非常短期的調(diào)查，通常范圍從幾分鐘到一個(gè)小時(shí)最多。雖然專門的玻璃底培養(yǎng)皿中是有用的一些實(shí)驗(yàn)中，腔室從聚合物（實(shí)際上制造，標(biāo)準(zhǔn)的陪替氏培養(yǎng)皿和聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶）遭受不均勻的光學(xué)表面，表現(xiàn)出應(yīng)變?nèi)毕?，禁止使用先進(jìn)的成像技術(shù)，例如偏振光和微分干涉相襯。此外，厚室（塑料和玻璃），防止使用高數(shù)值孔徑浸泡物鏡。在采用簡(jiǎn)單的腔室的應(yīng)用中也許是最不利的因素，但是，除了從低效的載物臺(tái)式升溫裝置和成像室之間的熱傳遞發(fā)生的是，伴隨著緩慢蒸發(fā)介質(zhì)的pH值和同滲容摩的逐步增加?？偟膩碚f，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)室的許多缺點(diǎn)妨礙其有效申請(qǐng)嚴(yán)重的成像實(shí)驗(yàn)和研究人員應(yīng)考慮下面的討論更先進(jìn)的替代品之一。
灌注室
各種各樣的培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)，是市售的或可容易地在內(nèi)部構(gòu)造一般分為兩個(gè)基本的功能的類別。第一，最基本的類，開放室系統(tǒng)，類似培養(yǎng)皿定制載玻片如上所述，在使用過程中慢慢接近平衡與周圍的氣氛。更復(fù)雜的封閉的腔室是密封的保護(hù)細(xì)胞從培養(yǎng)基中的蒸發(fā)，以確保環(huán)境變量，如pH值，二氧化碳濃度和滲透壓，保持原狀。一個(gè)開放的腔室的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞將允許容易訪問，從而容易地使顯微注射，膜片鉗，除了藥物及其代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，細(xì)胞和其他必需的操作變化。與此相反，封閉的腔室提供來自外部環(huán)境的絕緣性能優(yōu)越，但呈現(xiàn)訪問困難得多的細(xì)胞。最封閉的室內(nèi)設(shè)計(jì)包括端口允許添加新鮮培養(yǎng)基和藥物在實(shí)驗(yàn)過程中不中斷的成像序列。在這些系統(tǒng)中，是受一個(gè)蠕動(dòng)泵，一個(gè)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的注射器，或通過重力控制歧管灌注。新的解決方案加入到一個(gè)封閉的腔室系統(tǒng)，應(yīng)先平衡成像室相同的溫度和大氣條件。此外，許多細(xì)胞系中，對(duì)剪切敏感的，因此必須要在非常低的流速灌流連接到蓋玻片的貼壁細(xì)胞。下面描述的更高級(jí)的封閉腔系統(tǒng)設(shè)計(jì)，提供嚴(yán)密的控制剪切力。
使用開放或閉合的培養(yǎng)小室系統(tǒng)之間的選擇通常取決于由特性的調(diào)查，包括必要的時(shí)間和空間分辨率，以及持續(xù)時(shí)間。高分辨率明場(chǎng)成像技術(shù)依賴于DIC，HMC，或相襯需要聚光鏡的數(shù)值孔徑等于或大于物鏡。因此，要實(shí)現(xiàn)全分辨率1.4數(shù)值孔徑與60倍的物鏡，必須等于數(shù)值孔徑匹配的聚光鏡。一個(gè)高分辨率聚光鏡科勒照明下運(yùn)行的最大工作距離，因?yàn)橹挥袔讉€(gè)毫米（這取決于聚光鏡的工作距離），這個(gè)因素限制在觀察室的物理尺寸。小于封閉小室系統(tǒng)能夠只包含有限的體積的培養(yǎng)基中（通常大約幾百微升），這可能會(huì)成為一個(gè)問題。長(zhǎng)期培養(yǎng)，如果未采用灌注系統(tǒng)。
與此相反，不需要伴隨高分辨率的熒光調(diào)查傳輸光技術(shù)往往與開放的腔室來完成，緩和改變介質(zhì)或進(jìn)行其他操作（如電生理測(cè)量）向培養(yǎng)的任務(wù)。封閉的腔室也需要特別注意的培養(yǎng)基中的緩沖能力，pH值不能被控制的典型的碳酸氫鈉/二氧化碳系統(tǒng)。作為替代方案，可以利用或氣體沒有被緩沖的介質(zhì)，應(yīng)考慮合成緩沖液補(bǔ)充品（如HEPES）。在任何灌注室中，灌流液，蓋玻片視窗，液浸介質(zhì)的折射率之間的差異可以引入顯著誤差信號(hào)的衰減深度測(cè)量結(jié)果。許多這些工件可以減輕與水浸泡物鏡，但圖像質(zhì)量仍然是優(yōu)異的情況下，將細(xì)胞附著到蓋玻片。
如圖7所示的幾個(gè)商業(yè)灌注室設(shè)計(jì)活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，在不同的光學(xué)分辨率。在圖7（a）所示的結(jié)構(gòu)是一個(gè)自包含的環(huán)境室，里面的皮氏培養(yǎng)皿隨著灌注，溫度和濕度控制，以及大氣中的氣體組合物的調(diào)節(jié)能力。圖7（b）示出了鉆石形的灌注室（下面將討論），在加熱載物臺(tái)的適配器，而圖7（c）示出了類似的設(shè)計(jì)，但是有一個(gè)圓形的腔室。各種流室載物臺(tái)插入圖7中的適配器（b）和7（c）使調(diào)查微調(diào)的細(xì)節(jié)成像實(shí)驗(yàn)生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。能夠被固定在一個(gè)機(jī)架，盧丁式的灌注室（d）為圖7所示的用于成像的多個(gè)樣品與灌注在一次實(shí)驗(yàn)中有用。雖然沒有被加熱腔室本身，它可以被安置在加熱的臺(tái)板，或連同一個(gè)物鏡的加熱器或全封閉環(huán)境室中使用。在圖7（五）的Petri式的灌注腔模制包含灌注流體的引進(jìn)和排氣端口，但不包含溫度控制元件。同樣，在圖7的腔室（六）包含多個(gè)端口，和被設(shè)計(jì)為插入到標(biāo)準(zhǔn)的6孔培養(yǎng)板，包含塑料生長(zhǎng)表面上的貼壁細(xì)胞。在圖7中（克）加熱灌注室被設(shè)計(jì)為可安裝在顯微鏡載物臺(tái)上，用一個(gè)圓孔徑，并圍繞中心井的周邊設(shè)置有多個(gè)端口。需要注意的是數(shù)以百計(jì)的活細(xì)胞灌注室市售，所以鼓勵(lì)研究者掃描商會(huì)針對(duì)特定應(yīng)用的可用性之前提交到一個(gè)單一的設(shè)計(jì)。
灌注室設(shè)計(jì)的重要考慮因素是機(jī)械連接（如有必要）和穩(wěn)定的檢體，流體機(jī)械的流動(dòng)特性和交換腔室的時(shí)間，以及光的工作距離和折射率浸油，文化的解決方案，通過觀察將發(fā)生的玻璃板。活細(xì)胞成像封閉或開放室的標(biāo)本可以被固定的自然堅(jiān)持蓋玻片，附著力促進(jìn)劑（例如，聚-L-賴氨酸和膠原），或在薄薄的瓊脂覆蓋第一嵌入。調(diào)查的要求，決定必須在灌注室可供觀察的玻璃表面面積的大小。隨機(jī)的細(xì)胞群往往可以使用相對(duì)較小的蓋玻片，但更大的區(qū)域非常大的細(xì)胞或網(wǎng)絡(luò)可能是必要的，在特定的事件（例如，有絲分裂）的情況下，必須篩選許多細(xì)胞。
無論在蓋玻片表面積，形成檢體腔（理想的情況下，厚度170微米）的薄玻璃板應(yīng)該是無應(yīng)變，光學(xué)平面，并在一個(gè)平行的方向定位。需要注意的是更大的可視區(qū)域更容易泄漏和物理損壞，但提供顯著更多的機(jī)會(huì)獲得高數(shù)值孔徑物鏡，往往萬桶不等，直徑從3厘米至5厘米（更笨重安裝加熱器）。分庭應(yīng)利用組件是沒有毒性的活細(xì)胞?，F(xiàn)代市售的培養(yǎng)室中的構(gòu)造由玻璃，不銹鋼，高強(qiáng)度合成聚合物，聚四氟乙烯，和硅樹脂，通常使用粘合劑，在最終組裝。這些材料可能含有有毒重金屬或有機(jī)溶劑，應(yīng)刪除之前進(jìn)行徹底清洗消毒和使用的痕跡。
灌注腔室通常是必要的，以確保細(xì)胞培養(yǎng)物的可行性調(diào)查時(shí)，需要冗長(zhǎng)的成像序列，或者如果串行此外，代謝物，示蹤物，和/或藥物不干擾視場(chǎng)的情況下，必須完成。此外，灌注腔室使研究者周期性地采樣蜂窩產(chǎn)品的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，并進(jìn)行相關(guān)的研究，在該標(biāo)本中的生存狀態(tài)監(jiān)視在一段時(shí)間內(nèi)，其次是在觀察過程中突然固定重建結(jié)構(gòu)或細(xì)胞學(xué)事件相關(guān)過程中的利益。灌注的主要優(yōu)點(diǎn)是有能力保持在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中的介質(zhì)的pH和離子濃度，以及不破壞細(xì)胞的情況下，得到一種機(jī)制來引入各種試劑（注入腔室）。例如，灌注使研究者不中斷圖像采集過程中的時(shí)間推移序列引入到培養(yǎng)的藥物。
灌注室之間的最重要的特征是，整體的設(shè)計(jì)必須采用的層流特性，這樣的解決方案，通過以相對(duì)較少的混合，可以迅速和有效地交換。對(duì)于一些調(diào)查，層流可能不是至關(guān)重要的，但更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯客蟾叨瓤刂频?/span>介質(zhì)交流，尤其是當(dāng)其他代理商正在增加。灌注室的流體機(jī)械的性能密切相關(guān)的幾何形狀（如圖8所示）。層流時(shí)，會(huì)發(fā)生該室的橫截面是非常相似的，甚至是相同的，該入口管。最不利的流動(dòng)模式時(shí)，會(huì)出現(xiàn)比較大的入口管室。圖8比較在幾個(gè)流行灌注室的流動(dòng)模式。圖8（a）中示出的圓形的腔室，有交流特性較差，由于介質(zhì)的突然擴(kuò)張，從進(jìn)液管的開口，這會(huì)導(dǎo)致在二次流和非均勻簡(jiǎn)化。逐步擴(kuò)展，所描述的圖8（b）和圖8（c），結(jié)果更加均勻簡(jiǎn)化和快速交換。在圖8中所示的錐形區(qū)的入口和出口管的腔室的設(shè)計(jì)（二）改善流動(dòng)剖面，而更均勻的流動(dòng)通過容器中的鉆石形的幾何形狀的腔室（三）在圖8中的結(jié)果。圖圖8（d）中提出的微渡槽室具有優(yōu)越的層流特性由于蝕刻的通道，引導(dǎo)整個(gè)試樣輕輕介質(zhì)。
正如上面所討論的，它往往是必要開發(fā)一種可靠的方法直接灌注細(xì)胞成像室不妨礙實(shí)驗(yàn)收購(gòu)電力，化工，光學(xué)數(shù)據(jù)。灌注室中的流體流過發(fā)生了新的流體傳遞到進(jìn)氣口，而這又迫使使用了通過的排氣口上的流體的交換。因?yàn)榇蠖鄶?shù)活細(xì)胞成像室包含相對(duì)微量的組織培養(yǎng)基中，在灌注過程中的剪應(yīng)力的敏感性，細(xì)胞，以及孔處（通常被稱為為膜片的效果），必須創(chuàng)建蓋玻片的振動(dòng)的潛力選擇時(shí)要考慮抽水系統(tǒng)。在許多情況下，這個(gè)選擇的過程中，與大多數(shù)其他因素在活細(xì)胞成像，涉及一個(gè)或更多的妥協(xié)。理想的灌注泵將提供一個(gè)嚴(yán)密控制的，純模擬的流介質(zhì)無限期的，但這種類型的系統(tǒng)還有待開發(fā)。
灌注流體通過交付的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是重力流，自動(dòng)或手動(dòng)注入用注射器（參見圖9（b）），與機(jī)械泵。重力流是安裝簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)低廉，但通常所必需的顯微鏡上面的流速難以控制。在最基本的配置中，重力自流進(jìn)料系統(tǒng)需要一個(gè)大的介質(zhì)儲(chǔ)層的位置放置在高處與連接到成像室的無菌管的截面的顯微鏡。的流量調(diào)整由針形閥控制的排氣管連接到腔室的相對(duì)側(cè)，成收集盆下水道。另外，匯率灌注在重力系統(tǒng)可以控制通過改變兩個(gè)水庫之間的垂直距離或一旋塞的控制流從上水庫。重力進(jìn)料系統(tǒng)的層流特性往往是不足的，但就足夠的情況下的主要要求是能夠快速交換培養(yǎng)基中。
對(duì)于依賴于精確的藥物或其他化學(xué)品，以及優(yōu)于純粹的力控制在蓋玻片的表面上（如細(xì)胞附著）另外的實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)更復(fù)雜的灌注裝置是必要的。流體交換率，它可以是非常關(guān)鍵的專門的實(shí)驗(yàn)中，增加了改進(jìn)腔室的幾何形狀。在灌注室半的時(shí)間少于50毫秒的流體交換已經(jīng)實(shí)現(xiàn)而不擾亂試樣臥位或軸向焦平面。甲步驟的濃度變化可在少于100毫秒的時(shí)間來實(shí)現(xiàn)，用相對(duì)低的線性流速，其中兩個(gè)灌注液的交界處的位置靠近的腔室，腔室，設(shè)置有一個(gè)小的內(nèi)部體積，并保持層流配置文件。許多市售滿足這些條件的先進(jìn)灌注室。
定期加入生長(zhǎng)因子，抑制劑，藥物，和其他代謝物在灌注過程中，可以很容易地通過使用手動(dòng)注射器。機(jī)械泵，蠕動(dòng)（圖9（a）和圖9（b））或電動(dòng)注射器（圖9（E））的設(shè)計(jì)，是最可靠的設(shè)備提供的灌流液。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)的音量和送貨上微升流尺度的變化（由于臨時(shí)粘在柱塞）的注射器泵是有限的。采用步進(jìn)電機(jī)的泵可以被控制，以很慢的流速，但在液力脈沖可以制作蓋玻片彎曲或撞出細(xì)胞的瞬時(shí)的轉(zhuǎn)子運(yùn)動(dòng)的結(jié)果。先進(jìn)的灌注泵配有調(diào)節(jié)耦合到一個(gè)降壓的傳輸驅(qū)動(dòng)配備的輥?zhàn)又鬏S速度控制的直流電動(dòng)機(jī)。其結(jié)果是，是免費(fèi)的，便宜的蠕動(dòng)泵的典型的突然脈動(dòng)的流動(dòng)剖面。在選擇灌注送貨系統(tǒng)，研究者應(yīng)當(dāng)考慮所需的流速，流過不同時(shí)間尺度的均勻性，以及傳遞的總體積，以及質(zhì)量流量。
此外，以確保合適的灌注腔室的流體的流動(dòng)特性，進(jìn)紙器的解決方案可能還需要注意的溫度和氣體組成。如果二氧化碳和碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)，所有的灌注液應(yīng)保持平衡的適當(dāng)?shù)亩趸挤謮海ㄌ妓釟潲}的濃度依賴于），并保持在相同的溫度下培養(yǎng)室。因此，灌注液必須毒氣，它們引入灌注室之前調(diào)整它們的溫度。請(qǐng)注意，減少二氧化碳的溶解度隨著溫度的增加，因此必須加以調(diào)整，上面的腔室的溫度設(shè)定值或氣體混合物的溫度差，必須將毒氣的解決方案。各種商業(yè)設(shè)備提供用于保持灌注液的溫度和氣體組成。另外，合適的設(shè)備可以很容易地在內(nèi)部構(gòu)造使用常見的實(shí)驗(yàn)室組件。介質(zhì)瓶，管，和一個(gè)魚缸空氣石（圖9（c）條），同時(shí)可以制作簡(jiǎn)單的濕度試驗(yàn)箱的溫度可以控制循環(huán)水洗澡或桌面孵化。更復(fù)雜的單元（圖9（d）圖中所示）的設(shè)計(jì)，同時(shí)調(diào)節(jié)pH和濕度。介質(zhì)的靜態(tài)的解決方案，因?yàn)橛幸环N傾向，冷卻和失去二氧化碳（其后產(chǎn)生的pH值增加）時(shí)，所有的解決方案應(yīng)該被連接到使用不透氣的管材通過加熱的水浴或培養(yǎng)箱灌注室。
活細(xì)胞灌流實(shí)驗(yàn)管接頭的選擇應(yīng)只限于那些產(chǎn)品（最好是帶有一個(gè)USP VI級(jí)認(rèn)證），表現(xiàn)出最大程度的生物相容性，從而保證了成像會(huì)議期間油管源性毒性缺乏。目前，有三個(gè)品種，以滿足這一要求：PHARMED（可通過眾多分銷商），聚乙烯2275，C-Flex的商業(yè)油管。即使它是非常適合用于細(xì)胞培養(yǎng)，PHARMED管的主要缺點(diǎn)是低的不透明度，從而降低了通過油管旅客灌流液的可見性。其結(jié)果是，可能形成的氣泡作為灌流液通過油管很難檢測(cè)到。相比之下，C-Flex和聚乙烯管幾乎是透明的，不容易進(jìn)灌流浸出增塑劑。后者的產(chǎn)品是大多數(shù)灌流實(shí)驗(yàn)的理想場(chǎng)所。
灌注腔室中使用的一個(gè)潛在問題是，試樣往往反彈的重點(diǎn)蓋玻片彎曲迫使流體通過腔室的過程中，則初始化或終止時(shí)，在有限的程度，如前面所討論的（隔膜效應(yīng)）。此神器室灌注系統(tǒng)控制不佳是顯而易見的。蓋玻片撓曲可能不存在顯著的問題，在灌注會(huì)話之間的圖像捕獲序列的情況下，可以是交錯(cuò)的，但它可能會(huì)嚴(yán)重影響這些研究的需要相對(duì)高時(shí)間分辨率（2秒或更少）。蓋玻片彎曲的嚴(yán)重程度可以最小化通過減少輸入端口（和油管成色劑）的直徑的排氣口的靜水壓力，使流體的流動(dòng)過程中不累積。此外，代以重力流系統(tǒng)的蠕動(dòng)泵，可以減少或消除振動(dòng)板的效果。
在所有灌注室使用的一個(gè)主要問題是形成氣泡（由于泄漏，表面張力，脫氣），這可能會(huì)干擾與層流的培養(yǎng)基中，以及在成像過程中降低對(duì)比度和銳度。一個(gè)正確配置的灌注室應(yīng)形成一個(gè)封閉的系統(tǒng)，應(yīng)消除后的試片被安裝在顯微鏡上的和隱藏的空氣在腔室或管路口的或潛在的泄漏，但在啟動(dòng)之前的實(shí)驗(yàn)。在重力系統(tǒng)，最簡(jiǎn)單的方法來清除氣泡是填補(bǔ)了水庫和室，停止流過系統(tǒng)，然后再慢慢清除活塞，同時(shí)檢查所有組件。室用泵系統(tǒng)通常更難以糾正，并應(yīng)特別注意支付的微小氣泡，可能隱藏在腔體外殼之間的蓋玻片和灌注口。在所有的情況下，整個(gè)系統(tǒng)應(yīng)完全封閉的，并裝有流體到第一灌注前，以盡量減少的蓋玻片彎曲灌注啟動(dòng)和終止。確保排氣管沉浸在catch盆地悄悄溜回到室，以避免氣泡。
對(duì)于許多調(diào)查，灌注腔室的輸入口和排氣口的定位必須不干擾的變化的顯微鏡物鏡。大多數(shù)夾心式腔室的設(shè)計(jì)，使端口被定位在相同或相對(duì)的腔的邊緣，通?？梢詫⑵溆糜谂c直立和倒置顯微鏡。然而，腔室，具有安裝在殼體的上部分上的端口可能會(huì)阻礙正置顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)盤上的運(yùn)動(dòng)。許多現(xiàn)代商業(yè)灌注腔（見圖1和圖7），旨在使顯微鏡炮塔旋轉(zhuǎn)而不阻塞，但這一因素應(yīng)該先進(jìn)行測(cè)試，然后決定在一個(gè)特定的腔。此外，塑料灌注和嵌入在大型金屬舞臺(tái)上的適配器倒置顯微鏡成像室，可能無法提供足夠的間隙物鏡旋轉(zhuǎn)不首先降低的物鏡離室。
雖然絕大多數(shù)的活細(xì)胞成像的調(diào)查，需要維持在高于環(huán)境溫度升高的文化，一些研究涉及的生物體觀測(cè)，必須在非常低的溫度下生長(zhǎng)的，而另一些研究在試樣上的突然冷卻的影響。對(duì)于長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)，最好設(shè)在顯微鏡在寒冷的房間，以避免在室溫下的冷表面上形成冷凝水的問題。在寒冷的房間的情況下，用于冷卻的應(yīng)用程序設(shè)計(jì)的灌注腔室是市售的。這些設(shè)備往往依賴于前螺旋線或油管，以減少溫度的冷凍乙醇溶液的流動(dòng)。專門的物鏡和聚光鏡冷卻器可能是必要的，以避免這些顯微鏡元素的試樣加熱，可以防止由外部涂層的玻璃表面，用化學(xué)相似的圖像流（柯達(dá)）結(jié)霜。無論調(diào)查對(duì)溫度的要求，然而，應(yīng)注意的是，保持一個(gè)確切的溫度值，通常是一樣保持穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)和穩(wěn)定地保持一個(gè)恒定的溫度并不重要，重要。
高級(jí)封閉與開放系統(tǒng)成像室
在一般情況下，倒置顯微鏡（組織培養(yǎng)）是最常見的活細(xì)胞成像儀器，但正置顯微鏡也適合用于此目的，有幾個(gè)重要的讓步。研究者必須謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（無論在顯微鏡幀配置）確定必要的倍率范圍，工作距離的限制，和最佳的數(shù)值孔徑，所有這些都涉及到景深。流體耦合的物鏡（油和水浸泡）在大多數(shù)情況下，將可使用的溫度控制時(shí)，利用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。在透射光中的應(yīng)用程序需要高數(shù)值孔徑的聚光鏡中，腔室必須能夠容納的工作距離，物理尺寸，靠近聚光鏡的前透鏡元件，特別是在油的上部腔室玻璃。顯微鏡載物臺(tái)的幾何形狀也應(yīng)與培養(yǎng)室的尺寸相匹配，以確保有足夠的間隙。一般來說，倒置顯微鏡是由于較長(zhǎng)的工作距離聚光鏡和使用這些工具的能力高數(shù)值孔徑物鏡光學(xué)表面上直接支持細(xì)胞活細(xì)胞調(diào)查優(yōu)越。
采用先進(jìn)的開放室培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)考慮一些變量。特別是，體積，孔徑尺寸，建材，蓋玻片厚度，腔室的幾何形狀和生物相容性問題必須解決。其他因素可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的成功，包括蒸發(fā)（冷凝），環(huán)境光線，視角，和實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件。對(duì)于更復(fù)雜的封閉系統(tǒng)室，許多同樣的考慮也適用，但是，額外的特性也很重要。其中有固定的或可變的腔室容積的要求，光學(xué)表面，流體交換率，層流，剪切應(yīng)力，灌注流量梯度，流道的幾何形狀之間的間隔距離。此外，溫度控制和均勻性和熱效應(yīng)的油或水的浸入物鏡是兩個(gè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的重要因素。
封閉系統(tǒng)的活細(xì)胞成像室需要的情況下，那里的文化，必須從外部環(huán)境完全隔離，或應(yīng)用程序中使用先進(jìn)的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，傳輸光學(xué)顯微鏡（如高分辨率DIC）。在這些情況下，細(xì)胞被放置在一個(gè)溫度控制，灌注的光學(xué)諧振腔，或直接生長(zhǎng)在蓋玻片形成室下部光窗口。各種各樣的傳統(tǒng)和先進(jìn)的設(shè)計(jì)，配置，售后為封閉系統(tǒng)成像室市售。絕大多數(shù)的這些設(shè)計(jì)利用兩個(gè)光學(xué)表面分離的密封墊片，被鉗位在一個(gè)金屬的或聚合的殼體一起形成夾心灌注環(huán)提供的相似的特征。其中發(fā)現(xiàn)許多密閉的腔系統(tǒng)的缺點(diǎn)是過度光學(xué)表面之間的分離，固定光學(xué)腔容積，冗長(zhǎng)的流體匯率，動(dòng)蕩的灌注，在裝載困難，和泄漏。一些更先進(jìn)的開放和封閉系統(tǒng)成像室設(shè)計(jì)，以解決共同的問題，并提供出色的成像特性如下所述。
Bioptechs三角洲T開放系統(tǒng)室
三角洲T Bioptechs 培養(yǎng)室系統(tǒng)提供了一些創(chuàng)新的設(shè)計(jì)圖案，可以利用一個(gè)令人驚訝的優(yōu)勢(shì)，廣泛的靜態(tài)和灌注活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。仿照傳統(tǒng)的開放室培養(yǎng)皿后，三角洲T培養(yǎng)室由一個(gè)35毫米的菜融合到一個(gè)170微米的蓋玻片跨越整個(gè)底部采用了表面的熱轉(zhuǎn)印技術(shù)，以保持溫度控制（如圖10所示）。熱控制策略是基于后，銦-錫氧化物（ITO），施加到蓋玻片的下表面的透明導(dǎo)電層的薄膜涂層。相反的蓋玻片邊緣沉積導(dǎo)電接觸，搞了一系列電極菜是正確就位時(shí)，在專業(yè)舞臺(tái)適配器。溫度的調(diào)節(jié)，通過熱敏電阻器的反饋回路（容納在一個(gè)外部控制器單元），它適用于涂覆底面蓋玻片電流，從而整個(gè)烹調(diào)加熱到所需的溫度。使用這種技術(shù)的熱響應(yīng)是每秒約0.1攝氏度。
德爾塔T系統(tǒng)的快速響應(yīng)時(shí)間，使控制器切換電流的流動(dòng)，在幾秒鐘內(nèi)打開和關(guān)閉，從而有可能以補(bǔ)償溫度變化，發(fā)生由于表面蒸發(fā)，熵，或灌注中的菜。耦合到快速的響應(yīng)時(shí)間是一個(gè)高速的安全電路設(shè)計(jì)控制器錯(cuò)誤事件中保護(hù)細(xì)胞。該系統(tǒng)提供了高分辨率的成像能力通過無應(yīng)變均勻的玻璃表面，并可以用護(hù)罩玻璃的各種厚度，包括數(shù)字1.5的高數(shù)值孔徑的應(yīng)用程序設(shè)計(jì)的蓋玻片。這道菜環(huán)境兼容流行的對(duì)比增強(qiáng)模式，明，暗場(chǎng)，偏光，相襯，DIC，HMC，熒光，多光子共聚焦顯微鏡。
在1993年引入，使用蓋玻片上的薄膜涂層的第一表面的熱傳遞技術(shù)提供了廣泛的修改和變化的基本原理的基礎(chǔ)。例如，德爾塔T和類似的系統(tǒng)是有用的，在調(diào)查過程中溫度的控制，可以從物鏡在適當(dāng)?shù)慕咕嗟墓鈱W(xué)參考平面懸浮在組織切片標(biāo)本。此外，適配器可以很容易地安裝，長(zhǎng)時(shí)間保持低容積灌注。緊密配合蓋也可利用高數(shù)值孔徑實(shí)驗(yàn)標(biāo)本介質(zhì)或成像緩沖區(qū)完全充滿以上定義一個(gè)光學(xué)表面的溫差計(jì)算菜肴。此裝置消除空氣和介質(zhì)的表面之間的界面，從而防止圖像對(duì)比度的變化，結(jié)果在介質(zhì)上的物鏡卷，從微小的波動(dòng)。此外，可用于低倍率的傳輸或高倍率熒光實(shí)驗(yàn)的電加熱的，光學(xué)透明蓋玻璃蓋。蓋罩玻璃的熱控制，可以防止冷凝的下表面上形成。此外，另外的氣體端口可以被用于保持在培養(yǎng)氣氛中的二氧化碳的濃度在長(zhǎng)時(shí)間的加熱蓋。可以通過潛入菜盤管循環(huán)的制冷劑液體冷卻標(biāo)本三角洲T系統(tǒng)。
Bioptechs FCS-2閉環(huán)系統(tǒng)室
介紹一個(gè)的獨(dú)特的微渡槽控制灌注技術(shù)，Bioptechs關(guān)閉系統(tǒng)FCS-2培養(yǎng)室，是一種先進(jìn)的解決方案，許多的困難，經(jīng)常遇到的剪切應(yīng)力和在灌注室中的流動(dòng)幾何。在這個(gè)系統(tǒng)中，微渡槽觀察室制作成一個(gè)定義的表面的光學(xué)諧振腔（參見圖圖1（b），圖8（d），圖11（b）），將灌注槽。這種設(shè)計(jì)消除共同的許多其他腔室通過創(chuàng)建只有一個(gè)單一的分離灌注從蓋玻片滑動(dòng)墊片的光學(xué)腔灌注環(huán)。的物理配置的微渡槽槽產(chǎn)生優(yōu)秀的層流區(qū)域的光學(xué)諧振腔中，而的單密封墊設(shè)計(jì)使研究者定義的尺寸，體積，厚度，及形狀的腔室。此外，微渡槽灌注室提供大光圈流，輸入和輸出，從而減少體積交換率的問題。為了進(jìn)一步提高性能的FCS-2室系統(tǒng)的第一表面的熱傳遞技術(shù)（如上所述）施加的玻璃微渡槽，熱均勻性，從而增加腔室，即使在沒有流動(dòng)的期間。因此，細(xì)胞培養(yǎng)物保持在一個(gè)溫度控制的光學(xué)光學(xué)顯微鏡的所有模式兼容的環(huán)境安全。
東海希多孵化載物臺(tái)
行銷下的各種商號(hào)及配置，東海希多載物臺(tái)頂部孵化器（型號(hào)INU）是由幾個(gè)主要的顯微鏡制造商，無論是作為一個(gè)的灌注設(shè)備或作為靜態(tài)室的組合系統(tǒng)，可以利用模擬條件在濕潤(rùn)的二氧化碳培養(yǎng)箱中（圖11（a）中示出）。高濕度均維持通過一個(gè)圓形，恒溫水槽配備二氧化碳注射器喂食由遠(yuǎn)程氣體混合單元。聚光鏡光圈護(hù)罩玻璃加熱由第一表面上的涂層，以防止結(jié)露的形成，同時(shí)使透射光微分干涉對(duì)比和偏振光成像技術(shù)在低數(shù)值孔徑的應(yīng)用。在蓋玻璃上的接入端口允許圖像采集會(huì)話過程中的代謝物和藥物注射。腔室的設(shè)計(jì)與的灌注配件和一種抗漂移板的上方插入到隔離培養(yǎng)皿中，從加熱元件的加熱載物臺(tái)，從而最大限度地減少焦點(diǎn)偏移。一個(gè)可選的物鏡加熱器可用于與浸沒物鏡維持樣品溫度。室的設(shè)計(jì)和多種氣體混合是最流行的商業(yè)顯微鏡。
最全面的商業(yè)包裝成像室是由華納儀器，專家，電生理和細(xì)胞生物學(xué)研究工具。該公司提供了驚人的陣列成像和錄音室，載物臺(tái)適配器（參見圖7（c）），溫度控制器，灌注系統(tǒng)，物鏡暖，漏油傳感器，專為廣泛的應(yīng)用在灌注加熱器。此外，由于活細(xì)胞成像技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室成為一種比較流行的，越來越多的創(chuàng)新培養(yǎng)室結(jié)構(gòu)，打算灌注和靜態(tài)文化，將不斷推出由廠家售后?；罴?xì)胞成像的特定商業(yè)培養(yǎng)室系統(tǒng)之前，研究者應(yīng)仔細(xì)細(xì)讀豐富的上線和發(fā)表的科學(xué)文獻(xiàn)。