尼康顯微鏡：物鏡的蓋玻片校正

如果均質(zhì)油浸物鏡被設(shè)計(jì)為使用浸油，蓋玻片，和吸液的檢體，匹配的物鏡前透鏡元件，然后計(jì)算過程是簡(jiǎn)單的介質(zhì)的折射率和分散液，因?yàn)樗械拿襟w可以被認(rèn)為是延伸的所述前透鏡元件。

然而，與非油浸物鏡，蓋玻片可以成為一個(gè)源的色像差，從而增加與蓋玻片厚度和分散。 另一光學(xué)工件，球面像差，也是蓋玻片的厚度成正比。 在設(shè)計(jì)的物鏡，不被用于均勻浸漬，一個(gè)假定的存在下，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片和其他特定的光學(xué)媒體之間的前透鏡元件和所述試樣。由于條件脫離這些指定的規(guī)格，球面像差和彗差的數(shù)值孔徑的增加而物鏡。會(huì)出現(xiàn)這種情況，因?yàn)檩^長(zhǎng)的數(shù)值孔徑的切線的入射角的正弦值（這是負(fù)責(zé)偏離需要校正這些像差的正弦條件）之間的差異變得更大。

使用油浸物鏡時(shí)，它可能會(huì)出現(xiàn)，蓋玻片厚度是有限的關(guān)注，因?yàn)樗?a title='折射' target='_blank' href='http://http://pooher.com/xinwen/shownews.php?lang=cn&id=740' class='seolabel'>折射率近似匹配，浸油。 這是真實(shí)的，當(dāng)樣品被安裝在加拿大香脂或其他安裝介質(zhì)折射率類似于蓋玻片。 然而，它不再是真實(shí)的試樣被安裝時(shí)，例如，在生理食鹽水或其它含水介質(zhì)，其折射率是顯著不同的蓋玻片。 在這些條件下，即使聚焦通過一個(gè)薄的水層，只有10微米厚的可導(dǎo)致明顯的像差和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的上方和下方的焦平面，不再對(duì)稱。 這是因?yàn)橛徒?/span>物鏡的設(shè)計(jì)假設(shè)，均勻地浸標(biāo)本。 樣本，除非區(qū)域相鄰的蓋玻片（甚至在含水環(huán)境中），來計(jì)算的像差校正光學(xué)假設(shè)不再有效。

一旦這一特點(diǎn)的油浸物鏡的行為被確認(rèn)，顯微鏡制造商開始生產(chǎn)修正后的水浸物鏡（1994年左右）。 平常APO水浸物鏡的配備校正衣領(lǐng)的數(shù)值孔徑在1.2左右，（即使他們有一個(gè)較小的數(shù)值孔徑比他們的浸油）是通過水的解決方案能夠克服固有的局限性成像（見圖2）。 *新的水浸物鏡的設(shè)計(jì)現(xiàn)在可以集中精力通過約200微米的水介質(zhì)，仍然保持出色的校正。 不幸的是，這些物鏡的價(jià)格是非常高的，和圖像對(duì)焦時(shí)，仍可以降低深內(nèi)折射的組織或細(xì)胞元素。

對(duì)比度傳遞一個(gè)60x/1.2數(shù)值孔徑的水浸泡和一個(gè)60x/1.4數(shù)值孔徑的油浸物鏡（包括平常復(fù)消色差），測(cè)量帶和不帶蓋玻片和測(cè)試光柵之間的水層，在圖2中給出的值。 這些圖表表明，水浸物鏡執(zhí)行即使與水層的厚為153微米的對(duì)比度傳遞的理論極限的油浸物鏡的對(duì)比度傳遞函數(shù)，而顯著降低，并減少一半的分辨率極限，當(dāng)測(cè)試光柵成像，通過一個(gè)50微米厚的水層。 連續(xù)行，理論上計(jì)算出的對(duì)比度傳遞函數(shù)無像差的相應(yīng)的數(shù)值孔徑的物鏡，在546納米的波長(zhǎng)。

對(duì)于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的的蓋玻片厚度和折射率/分散液（0.17毫米和n（D）= 1.515），偏離標(biāo)準(zhǔn)厚度與設(shè)計(jì)用于的物鏡是不是太關(guān)鍵，當(dāng)物鏡具有一個(gè)數(shù)值孔徑為0.4或更?。ㄈ缌杏诒?/span>1）。 然而，對(duì)于高數(shù)值孔徑的的非均質(zhì)油浸物鏡，這個(gè)問題變得尤其重要，這樣離境蓋玻片厚度甚至兩微米或降低的圖像與高數(shù)值孔徑0.65或更大的干物鏡。 這個(gè)概念在圖3中所示，呈現(xiàn)所計(jì)算出的*大強(qiáng)度的在蓋玻片厚度相對(duì)于偏差的一個(gè)點(diǎn)對(duì)象的圖像，從理想值0.17毫米，作為客觀的數(shù)值孔徑的函數(shù)。 為了彌補(bǔ)這樣的錯(cuò)誤，以及校正后，高干物鏡配備校正，可以利用調(diào)整其根據(jù)蓋玻片厚度的中間透鏡元件的間距的項(xiàng)圈。 以相同的方式，物鏡設(shè)計(jì)用于查看通過硅樹脂或塑料的層，或不同的浸沒介質(zhì)（水，甘油，油），配備校正鋌。

蓋玻片厚度變化的性能下降

表1

蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17毫米，它被指定為一些*?玻璃蓋。 不幸的是，并非所有的1?蓋眼鏡制造這種緊密的公差，許多標(biāo)本有媒體和它們之間的玻璃蓋。 蓋玻璃厚度的補(bǔ)償可以通過利用專門的校正領(lǐng)子的改變鏡筒內(nèi)的物鏡，關(guān)鍵的透鏡元件之間的間距，通過調(diào)整機(jī)械管長(zhǎng)度的顯微鏡，或（如前面所討論的）。 修正環(huán)進(jìn)行調(diào)整，以彌補(bǔ)這些細(xì)微的差別，并確保*佳的物鏡性能。 適當(dāng)?shù)膽?yīng)用程序的顯微鏡物鏡與校正鋌要求有經(jīng)驗(yàn)，有足夠的警惕，重設(shè)領(lǐng)，使用適當(dāng)?shù)膱D像標(biāo)準(zhǔn)。 在大多數(shù)情況下，重點(diǎn)可能會(huì)轉(zhuǎn)移和圖像可以漫步在調(diào)整過程中的修正領(lǐng)。 使用下面列出的步驟，同時(shí)觀測(cè)樣品圖像的變化，使微小增量調(diào)整物鏡的修正領(lǐng)。

·修正的物鏡桶上的指示標(biāo)記，以便領(lǐng)恰逢0.17毫米刻度刻在領(lǐng)住房的位置。

·標(biāo)本放置在載物臺(tái)上，集中在一個(gè)小樣本的顯微鏡功能。

·非常輕微的旋轉(zhuǎn)校正鋌并重新聚焦的物鏡，以確定是否有所改善的圖像或退化。由于遭受玻璃蓋/媒體三明治太粗的事實(shí)，大多數(shù)樣品準(zhǔn)備，開始旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，試圖補(bǔ)償值（0.18-0.23）*。

·重復(fù)前面的步驟，以確定如果圖像被改善或降解作為校正衣領(lǐng)是在一個(gè)單一的方向上轉(zhuǎn)動(dòng)。

如果圖像有下降，按照同樣的步驟，向相反的方向旋轉(zhuǎn)校正領(lǐng)（向較低的值）找到的位置，提供*佳的分辨率和對(duì)比度。

圖1示出一個(gè)具有0.85的數(shù)值孔徑的配備用于聚焦在表面上或通過一個(gè)蓋玻片*多至1.5毫米的厚度，而不改變透鏡系統(tǒng)的焦距設(shè)置的校正鋌60x的物鏡的一個(gè)例子。 在光學(xué)列車的中心的可調(diào)節(jié)透鏡組是膠合的三重峰，可以被重新定位，以適應(yīng)在蓋玻片厚度的變化。