徠卡顯微鏡：熒光蛋白 - 從入門到諾貝爾獎(jiǎng)
熒光蛋白是*近熒光顯微鏡及其現(xiàn)代應(yīng)用的根本。他們的發(fā)現(xiàn)和隨后的發(fā)展是*令人興奮的創(chuàng)新在上個(gè)世紀(jì)的生命科學(xué)和無(wú)數(shù)自然現(xiàn)象破譯的起點(diǎn)之一。這篇文章是獻(xiàn)給誰(shuí)參與了熒光蛋白的命運(yùn)輸入其科學(xué)的參與到人。它應(yīng)該給一個(gè)*美麗的生化工具，從一開始到諾貝爾獎(jiǎng)的漫長(zhǎng)道路的洞察。
早期的熒光觀察
熒光蛋白的人的興趣可以追溯到公元一世紀(jì)時(shí)，羅馬自然哲學(xué)家老普林尼描述[ 1 ]（蓋烏斯皮林紐斯Secundus，公元23年-公元79年）在地中海的一個(gè)發(fā)光的水母（Pulmo MARINUS） 。在他的眼睛這些動(dòng)物發(fā)出的光，其發(fā)光強(qiáng)度，它幾乎可以被用來(lái)作為一個(gè)火炬（博恩，1855）。除了 這種水母有豐富的其他生物，吸引了我們的注意，因?yàn)樗麄冊(cè)诤诎抵邪l(fā)光。事實(shí)上，他們沒有做到這一點(diǎn)趕上我們欽佩，但其他的理論之中，與他們的同種（螢火蟲發(fā)揮自己的隊(duì)友，例如一拉就）溝通，吸引獵物（如蛙魚）或嚇唬天敵（短尾魷魚例如）。這些迷人的生物都生活在黑暗的世界-如深海-燈是一種原始屬性。而上200米的海洋底下的邊境滲透陽(yáng)光，現(xiàn)存*的照明是由生活在那里的生物。
利用化學(xué)發(fā)光和熒光發(fā)光，演變發(fā)展的*令人印象深刻的和***的工具，這是基于科學(xué)的好奇心幾個(gè)人*近的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)之一。他們的努力，發(fā)現(xiàn)應(yīng)在下面提及。
中世紀(jì)后，隨著即將到來(lái)的自然科學(xué)的興趣，喜歡西班牙醫(yī)生和植物學(xué)家尼古拉斯莫納德斯描述一個(gè)閃閃發(fā)光的木1565降香nephriticum的提取物制成。后來(lái)這種光可以歸因于這是發(fā)現(xiàn)在這家工廠，并表明泛著不僅限于動(dòng)物黃酮類化合物的氧化產(chǎn)物。三個(gè)多世紀(jì)后（1858年），愛爾蘭數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家喬治·加布里埃爾·斯托克斯，形成那種自然發(fā)生的現(xiàn)象：熒光的名稱。他認(rèn)為這個(gè)詞后的藍(lán)色發(fā)光螢石礦物，并擴(kuò)大了觀察動(dòng)物在植物石頭的輻射對(duì)象
圖 1，2：維多利亞水母。來(lái)源：Ssblakely，通過(guò)維基共享資源
然而有這個(gè)令人費(fèi)解的問(wèn)題，為什么會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色光完整的生物體中提取，而在綠色發(fā)光？下村和他的同事們幾年來(lái)解開這個(gè)謎。但*后他們的研究表明，藍(lán)色的光芒來(lái)自水母，只是另一種閃閃發(fā)光的蛋白 - 水母綠色熒光蛋白（GFP）的能量來(lái)源。他們意識(shí)到，水母發(fā)光蛋白所發(fā)射的光的吸收，用這種能量產(chǎn)生綠色熒光的綠色熒光蛋白。
圖3：綠色熒光蛋白（GFP）的分子結(jié)構(gòu)
等待下一個(gè)開創(chuàng)性步驟凱旋游行的GFP克隆技術(shù)的發(fā)明，在20世紀(jì)70年代。而美國(guó)微生物學(xué)家道格拉斯普拉舍的工作，在1992 [ 3 ] 的*次克隆了完整的GFP基因。A.維多利亞cDNA文庫(kù)之前，他準(zhǔn)備與他的同事米爾頓科米爾一起在佐治亞大學(xué)的，已經(jīng)知道準(zhǔn)的GFP。不幸的是，由美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)的資助Prashers跑了出來(lái)，他才可以開始在細(xì)菌表達(dá)的重組GFP。
由Martin Chalfie的，一位美國(guó)生物學(xué)家，誰(shuí)可以受益于普拉舍的前期工作，初步懷疑，GFP不會(huì)在外面工作的水母被抹去。通過(guò)引入GFP基因插入大腸桿菌和線蟲，他可以表明，有沒有其他的水母特定的蛋白質(zhì)或必要因素產(chǎn)生綠光[ 4 ]。
GFP在活細(xì)胞成像
有了這些經(jīng)驗(yàn)，門被打開了綠色熒光蛋白在生命科學(xué)，開始其***的職業(yè)生涯。GFP成為觀察活細(xì)胞和生物合成的標(biāo)簽，而不需要或熒光抗體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。在免疫熒光染色的情況下，在細(xì)胞內(nèi)的抗體的訪問(wèn)目標(biāo)結(jié)構(gòu)一致來(lái)保證。這是通過(guò)用洗滌劑（例如），這不可避免地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的透化細(xì)胞。此外，大多數(shù)抗體變性抗原的偏好。因此，免疫熒光技術(shù)，使用代理，像第甲醛變性細(xì)胞靶蛋白結(jié)構(gòu)。共使用GFP可以克服這些非生理?xiàng)l件和生活細(xì)胞成像鋪平了道路。
另一個(gè)人誰(shuí)是實(shí)現(xiàn)和發(fā)展的巨大潛力GFP是錢永健。來(lái)自鈣調(diào)節(jié)領(lǐng)域，美國(guó)細(xì)胞生物學(xué)家興趣追蹤活細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用。劍橋和伯克利在哈佛的學(xué)習(xí)和工作后，他終于落戶在加州大學(xué)，圣迭戈。藥理學(xué)，化學(xué)和生物化學(xué)教授，他GFP的提高了工作效率，通過(guò)利用在進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)非常普遍的原則：突變。1994年，他和他的團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)單點(diǎn)突變（S65T）GFP一個(gè)更好的強(qiáng)度和光穩(wěn)定性比野生型版本。除了明亮的光暈S65T的變異體有另一個(gè)引人注目的技術(shù)效益。而野生型GFP有兩個(gè)激發(fā)*大值在395納米和475納米，在484 nm處只有一個(gè)變異版本。安裝的“新的”綠色熒光蛋白的光譜特性，通過(guò)保持其發(fā)射波長(zhǎng)在509 nm處，幾乎成古典FITC熒光的屬性（FITCex：496納米，F(xiàn)ITCem：520-530納米）。由于其增強(qiáng)GFP變種被稱為“增強(qiáng)”綠色熒光蛋白或EGFP。
做結(jié)構(gòu)GFP錢學(xué)森和他的同事研究制定進(jìn)一步的熒光衍生物。與GFP結(jié)構(gòu)在他們手中，他們成立的一個(gè)變種（T203Y）照耀在明亮的黃色，因此定名為“黃色熒光蛋白”或YFP。其次青色（CFP）和藍(lán)色（BFP）形成。
圖4：線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，青色：CFP，綠色環(huán)保：綠色熒光蛋白，黃色：YFP，紅色：紅色熒光蛋白
圖5：GFP小鼠
珊瑚蟲熒光蛋白
延伸到紅色的頻譜范圍內(nèi)時(shí)，生物化學(xué)家 Sergey A. 我們簡(jiǎn)直不敢相信，他是自2003年以來(lái)，俄羅斯科學(xué)院一名對(duì)應(yīng)的成員，發(fā)現(xiàn)紅珊瑚的熒光蛋白的熒光蛋白的調(diào)色板。買完這些刺胞動(dòng)物門在莫斯科的一家寵物商店盧科亞諾夫研究這些原始的動(dòng)物運(yùn)往俄羅斯海洋水族館的熒光行為。其中包括，他發(fā)現(xiàn)紅色熒光的蛋白來(lái)自Discosoma的一個(gè)Corallimorpharia -他稱之為DsRed的。除了紅色熒光蛋白，簡(jiǎn)直不敢相信和他的同事確定其他發(fā)光珊瑚蟲的蛋白質(zhì)生化時(shí)間后的使用時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，這是一個(gè)整體的調(diào)色板。
諾貝爾文學(xué)獎(jiǎng)
所有的努力，研究發(fā)現(xiàn)，理解和增強(qiáng)熒光蛋白導(dǎo)致了大范圍的應(yīng)用在生命科學(xué)的投入。GFP及其變種打開門，科學(xué)家觀看的FE轉(zhuǎn)移或血管生成生物體。此外，的五彩熒光的神經(jīng)（Brainbow）的使用將有助于了解大腦中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。裝飾瘧疾的病原體瘧原蟲的寄生蟲，如熒光蛋白的可能性，它是可以實(shí)現(xiàn)的，看著自己的命運(yùn)在宿主細(xì)胞。的機(jī)會(huì)，可以繼續(xù)的名單幾乎是無(wú)止境的，不僅包括臨床相關(guān)的項(xiàng)目，但還有其他基礎(chǔ)科學(xué)的企業(yè)。
總之GFP及其突變體的使用改變了我們的生活和其病理修改在一個(gè)戲劇性的方式，2008年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)給他們?nèi)齻€(gè)人誰(shuí)參與了綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展得到了回報(bào)。修下村修，馬丁Chalfie的錢永健，裝飾與他們的工作“的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白”在科學(xué)中的*高榮譽(yù)。
在化學(xué)（2008），諾貝爾委員會(huì)由的M?ns埃倫貝格教授代表“ ...的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白（GFP）從根本上改變科學(xué)議程。改進(jìn)變種GFP和GFP類似的蛋白質(zhì)協(xié)同的眼睛目前高分辨率顯微鏡，計(jì)算技術(shù)和**的理論方法助長(zhǎng)了復(fù)雜的生物系統(tǒng)側(cè)重于定量分析的科學(xué)**，現(xiàn)在的世界**看不見的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)原則逐步外觀影響幾乎所有方面的生物，醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥的研究... “
此報(bào)價(jià)為2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的頒獎(jiǎng)辭一次代表當(dāng)前生命科學(xué)和高沖擊的熒光蛋白，在未來(lái)即將到來(lái)的利用率，也引起我們的好奇心。*近的事態(tài)發(fā)展，像的熒光筆蛋白（photoactivateable光開關(guān)或photoconvertable的FPS）和建立新的*分辨率光學(xué)設(shè)施，如顯微鏡，明確的，即熒光進(jìn)化仍在進(jìn)行中，離終點(diǎn)不遠(yuǎn)。