尼康顯微鏡：共聚焦成像模式
共聚焦顯微鏡的主要應(yīng)用是在厚的部分的各種各樣的標(biāo)本類(lèi)型的改進(jìn)的成像。共焦的方法的結(jié)果的能力，通過(guò)試樣序列在高分辨率圖像的各個(gè)光學(xué)部分的優(yōu)點(diǎn)。一些使用不同的成像方式，全部依靠的光學(xué)部分，其基本形象單位。
單光學(xué)部分
光學(xué)部分是圖像的基本單位，在激光共聚焦顯微鏡方法。數(shù)據(jù)可以收集固定和染色標(biāo)本的單，雙，三，或多個(gè)波長(zhǎng)的照明模式，并從多個(gè)標(biāo)記的標(biāo)本采集的圖像將在注冊(cè)與對(duì)方（如果有足夠的校正色差物鏡像差被使用）。輕微的登記錯(cuò)誤，通?？梢允褂脭?shù)字圖像處理方法來(lái)校正。大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCMs）以約1秒獲得一個(gè)單一的光學(xué)部分，雖然有幾個(gè)收購(gòu)?fù)ǔＪ怯绍浖?lái)提高信號(hào)噪聲比的平均值。采集圖像的時(shí)間當(dāng)然會(huì)發(fā)生變化，與以像素為單位的圖像和系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)的速度的大小。在保存時(shí)，一個(gè)典型的8 -比特圖像的768×512個(gè)像素的大小，將需要約0.3 Mb的存儲(chǔ)空間。
圖1中顯示的是同時(shí)收集在三個(gè)不同的激發(fā)波長(zhǎng)（488，568，和647納米），用一個(gè)單一的氪/氬激光的光學(xué)部分。的標(biāo)本是果蠅三齡翼成蟲(chóng)磁盤(pán)標(biāo)記三種基因，涉及圖案翼。三個(gè)基因成像和他們各自的熒光染料標(biāo)記（一）退化的（熒光素 - 496納米）;（二）無(wú)翅（麗絲胺羅丹明 - 572納米），（三）CID（花青5 - 649納米）。合并后的復(fù)合材料的三個(gè)空間翼構(gòu)圖基因表達(dá)域顯示在右下方的（圖像（四））。
時(shí)間的推移和活細(xì)胞成像
時(shí)間推移活細(xì)胞研究加強(qiáng)與激光掃描共聚焦顯微鏡成像分辨率的提高。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行的早期研究，使用16毫米電影膠片連接到相機(jī)上了發(fā)條定時(shí)曝光，以及*近使用時(shí)間推移視頻盒式錄音機(jī)，光存儲(chǔ)硬盤(pán)錄像機(jī)，視頻采集卡。現(xiàn)在，可以使用激光掃描共聚焦顯微鏡，收集在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間間隔單一的光學(xué)部分。
用激光掃描共聚焦顯微鏡的成像生物體組織比固定的標(biāo)本成像極為困難的，并且并不總是一個(gè)實(shí)際的選擇，因?yàn)樵嚇铀婕暗臈l件，可能不能耐受。表1列出了一些要考慮的因素與激光掃描共聚焦顯微鏡成像活細(xì)胞和固定細(xì)胞。有些標(biāo)本根本不會(huì)爽利的顯微鏡的舞臺(tái)上，它們不能維持生命在舞臺(tái)上觀察。的現(xiàn)象或結(jié)構(gòu)還可能無(wú)法訪(fǎng)問(wèn)到物鏡的視場(chǎng)。例如，飛翼成蟲(chóng)盤(pán)的水果太深發(fā)展進(jìn)行成像的幼蟲(chóng)，解剖出時(shí)，他們不能在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因此，目前可用的*的方法，在這種類(lèi)型的組織圖像基因表達(dá)是解剖，修復(fù)和染色采取成蟲(chóng)磁盤(pán)的從不同的試樣在不同的發(fā)展階段。
固定和活細(xì)胞成像與物流及供應(yīng)鏈管理應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心
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表1
成功的活細(xì)胞成像顯微鏡舞臺(tái)上需要格外小心，整個(gè)成像過(guò)程中應(yīng)采取保持容忍的條件。通過(guò)多次掃描，所以應(yīng)保持在*低限度的必要，以獲取圖像暴露于激光束照射激光束的光損傷可累計(jì)。抗氧化劑如抗壞血酸通常加入到培養(yǎng)基中的氧氣量減少，會(huì)釋放出熒光分子的激發(fā)，導(dǎo)致自由基形成和殺死細(xì)胞。廣泛開(kāi)展初步控制實(shí)驗(yàn)光照射熒光標(biāo)記的細(xì)胞的影響進(jìn)行評(píng)估，保持詳細(xì)的注釋?zhuān)瑢?duì)所有的成像參數(shù)通常是必要的，無(wú)論他們被認(rèn)為是相關(guān)或不。成像測(cè)試，持續(xù)經(jīng)營(yíng)能力的活標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。胚胎，例如，應(yīng)繼續(xù)其正常發(fā)育后，成像過(guò)程中，應(yīng)確定由成像或所使用的熒光染料的任何異常引起。時(shí)間推移成像圖2給出了一個(gè)活生生的果蠅胚胎注射鈣綠色。的一系列的圖像顯示的熒光探針的分布隨著時(shí)間的推移的變化。
生活的特殊要求，必須滿(mǎn)足不同的細(xì)胞類(lèi)型，是將被成像。某些細(xì)胞如昆蟲(chóng)細(xì)胞，通常可以在室溫下保持在適當(dāng)?shù)?a title='介質(zhì)' target='_blank' class='seolabel'>介質(zhì)中的一個(gè)足夠大的體積。然而，大多數(shù)類(lèi)型的細(xì)胞需要一個(gè)階段的加熱裝置，并可能在適當(dāng)?shù)亩趸计胶鈺r(shí)，他們是在顯微鏡載物臺(tái)期間可以保持灌注室。選擇的細(xì)胞類(lèi)型，是更適合于在激光掃描共聚焦顯微鏡的成像條件，可避免許多實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題。現(xiàn)代共聚焦儀器的改善，潛在的問(wèn)題都得到了顯著降低。增加光子的效率，更高的數(shù)值孔徑物鏡（亮），減光毒性染料標(biāo)記活細(xì)胞共聚焦分析一個(gè)實(shí)際的選擇。*好的辦法是用*少的激光功率，使成像，并盡快收集圖像。如果針孔孔徑比非生物固定，以加快圖像采集標(biāo)本的開(kāi)度較大，成像后的卷積有時(shí)可以依靠恢復(fù)丟失的圖像質(zhì)量。
許多生理過(guò)程和事件發(fā)生的速度比他們可以捕捉由的大多數(shù)LSCMs，有圖像采集率通常在每秒一幀的順序。使用LSCMs聲 - 光器件和狹縫掃描速度比的檢流計(jì)驅(qū)動(dòng)的點(diǎn)掃描系統(tǒng)，更實(shí)用的生理研究。這些更快的設(shè)計(jì)結(jié)合了良好的空間分辨率，時(shí)間分辨率好，這可能是每秒30幀的全屏幕分辨率，或接近視頻率。較慢的點(diǎn)掃描顯微鏡系統(tǒng)可達(dá)到*佳的時(shí)間分辨率，只通過(guò)掃描在試樣上大大減少區(qū)域。如果需要完整的空間分辨率，幀必須被收集較少，失去一些時(shí)間分辨率。共聚焦系統(tǒng)也能夠使用磁盤(pán)掃描振鏡掃描方式成像快速生理或其他瞬態(tài)事件。
Z系列和三維成像
甲的z系列是一個(gè)序列的收集在不同的高度的光學(xué)部分垂直于光軸（z軸）內(nèi)的標(biāo)本。Z系列收集協(xié)調(diào)微調(diào)對(duì)焦的顯微鏡圖像采集順序在每個(gè)步驟的一步一步的變化。焦點(diǎn)中的步驟，通常是通過(guò)由計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)電機(jī)，按預(yù)定的增量改變焦點(diǎn)。在計(jì)算機(jī)中可以使用宏程序，以獲取和保存的圖像，通過(guò)編程改變對(duì)焦距離在試樣采集和保存第二個(gè)圖像，再次改變焦點(diǎn)，所以直到編程的圖像數(shù)量已經(jīng)收集。
從z系列通過(guò)一個(gè)地區(qū)的利益采取一些圖像可能被提取，并在圖像處理程序合并，突出感興趣的細(xì)胞。的z系列也可以作為一個(gè)蒙太奇圖像，如在圖3中所示的顯示。這種類(lèi)型的圖像組合和顯示，以及許多其他的圖像操作，是目前大多數(shù)商業(yè)圖像采集和處理軟件的標(biāo)準(zhǔn)功能。圖中所選擇的圖像（圖3）是表示沿z軸的增量更小的更大范圍內(nèi)的一系列的代表。綠色發(fā)光污垢定位外周神經(jīng)系統(tǒng)的被標(biāo)記為與指定的抗體22C10果蠅胚胎。
它可以是概念上是困難的復(fù)雜的相互連接的結(jié)構(gòu)從幾百光學(xué)部分用激光掃描共聚焦顯微鏡的試樣的體積，通過(guò)采取了一系列的可視化。一旦收集，然而，Z-系列是理想的進(jìn)一步加工成的標(biāo)本使用量可視化技術(shù)的三維表示。這種方法是目前常用的澄清的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，在生物和醫(yī)學(xué)研究的組織。重要的是，圖像被收集在一個(gè)適當(dāng)?shù)膠電機(jī)的步長(zhǎng)改變焦點(diǎn)，使試樣的實(shí)際深度反映在圖像中。只要試樣本身不移動(dòng)的圖像采集過(guò)程中，在激光掃描共聚焦顯微鏡產(chǎn)生的z系列將是**的寄存器，并保存在數(shù)字格式，它們被相對(duì)容易地加工成一個(gè)三維表示的試樣。圖4給出了一個(gè)單一的光學(xué)與z系列的凸臺(tái)（b）條的（a）部分的比較，并且示出的值，該值在此技術(shù)中，在可視化的果蠅染色，外周神經(jīng)系統(tǒng)的抗體22C10。
所采取的步進(jìn)電機(jī)的步長(zhǎng)大小，并設(shè)置由顯微鏡操作員，是關(guān)系到光學(xué)部分的厚度，但他們可能不具有相同的值。光學(xué)部分的厚度是指通過(guò)顯微鏡成像的樣品的部分的厚度，和取決于物鏡和所用的針孔的直徑。聚焦步長(zhǎng)和光學(xué)部分的厚度在某些情況下具有相同的值，但是，這可能是一個(gè)混亂的根源。
以下收購(gòu)的Z系列文件，它通常是出口到計(jì)算機(jī)專(zhuān)為處理共聚焦圖像三維重建程序。這種軟件程序在圖形工作站上以極高的速度運(yùn)行，或當(dāng)前速度更快的處理器和大量的RAM，可以相當(dāng)有效地運(yùn)行在個(gè)人電腦上或工作站共聚焦顯微鏡。的三維軟件程序包可以被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)三維表示的試樣或電影序列的試樣不同的意見(jiàn)，可產(chǎn)生的效果，旋轉(zhuǎn)或其它空間變換的增強(qiáng)試樣的贊賞編制立體字。該軟件允許各種長(zhǎng)度，深度和體積的測(cè)量值進(jìn)行，和的圖像的特定參數(shù)，如不透明度可以交互地改變，以顯示在試樣中的不同層次的結(jié)構(gòu)還。
中，串聯(lián)的光學(xué)部分從時(shí)間推移序列可能被利用的另一種方法是對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使時(shí)間的z軸成三維表示。這是一個(gè)有用的方法，可視化有機(jī)體發(fā)展過(guò)程中的生理變化。這種方法已經(jīng)被使用的一個(gè)例子，其中在澄清鈣動(dòng)力學(xué)在顯影海膽胚胎。顏色編碼的在不同深度的光學(xué)部分是顯示三維信息的一個(gè)簡(jiǎn)單的方法。在實(shí)踐中的顏色（通常為紅色，綠色，或藍(lán)色）被分配給每個(gè)得到的光學(xué)部分在不同的試樣中的深度，然后在彩色圖像被合并，且操縱的顏色，使用圖像處理程序，以達(dá)到預(yù)期的效果。
四維成像
活體組織制劑或其他標(biāo)本表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的現(xiàn)象提出利用激光掃描共聚焦顯微鏡三維數(shù)據(jù)收集時(shí)間推移序列提交時(shí)間作為第四維的可能性。Z系列數(shù)據(jù)收集的時(shí)間間隔，會(huì)產(chǎn)生隨時(shí)間的4維的數(shù)據(jù)集，三個(gè)空間維度（Y，?）作為第四維數(shù)，這可以被視為使用4D瀏覽器程序。這種方案允許立體聲對(duì)以建造在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并作為一場(chǎng)電影，或，或者，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三維重建回放可以被處理和顯示的電影或一蒙太奇。
XZ成像
如果所需的試樣，如上皮細(xì)胞層的垂直切片，xz部分的縱斷面圖，可以產(chǎn)生以下兩種方式之一。的檔案中，可以通過(guò)掃描的試樣（x -軸）的一個(gè)單一的線(xiàn)橫跨在不同的z軸的深度由步進(jìn)電機(jī)控制的焦點(diǎn)發(fā)生變化，則顯示一系列作為一個(gè)合并的圖像構(gòu)造。另一種方法是使用一個(gè)三維重建程序中提取的檔案中，從現(xiàn)有的z系列光學(xué)部分的剖切面選項(xiàng)。在建設(shè)蝴蝶翅膀上皮細(xì)胞在圖5中的圖像進(jìn)行掃描，激光通過(guò)單一的線(xiàn)（水平黑線(xiàn)在左手的圖像）在不同的z軸位置，或深度，進(jìn)展成試樣。共焦成像系統(tǒng)就建立起來(lái)了，并顯示在圖5中的的xz圖像的呈現(xiàn)。翼上皮由兩個(gè)上皮細(xì)胞層，但作為熒光強(qiáng)度下降更大的深度中的試樣，只有上層是清晰可見(jiàn)的。
反射光成像
反射或后向散射光成像，所有的早期的共聚焦顯微鏡中使用的攝像模式。許多標(biāo)本可以在激光共聚焦顯微鏡觀察未染色狀態(tài)，利用反射光，或試樣可以用探針就是高度反光，如免疫膠體金或銀顆粒標(biāo)記。的反射光的方法，特別是對(duì)活組織樣本的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，光漂白是沒(méi)有問(wèn)題的。某些類(lèi)型的探頭，衰減激光束，另一個(gè)潛在的問(wèn)題是，在某些顯微鏡，可能會(huì)發(fā)生內(nèi)部反射從光路中的光學(xué)元件。在狹縫的多波束版本的激光共聚焦顯微鏡的反射問(wèn)題是不存在的，工具很是麻煩的情況下，使用的偏振器或成像相差的工件并可以減輕它離開(kāi)光軸。
透射光成像
不僅可以用在激光掃描共聚焦顯微鏡，包括相襯，微分干涉相差（DIC），暗場(chǎng)，或偏振光的透射光的成像模式中通常采用顯微鏡。甲透射光檢測(cè)器是用來(lái)收集試樣的光通過(guò)，一個(gè)光纖導(dǎo)光發(fā)送信號(hào)的光電倍增管的顯微鏡系統(tǒng)的掃描頭中的一個(gè)。透射光圖像和共聚焦螢光圖像可以被收購(gòu)，同時(shí)使用相同的照明光束，確保所有的圖像都登記。當(dāng)圖像組合或合并使用圖像處理軟件，標(biāo)記的細(xì)胞組織內(nèi)的精確位置可以被映射。在一些研究中的一個(gè)的信息的方法是與一種或多種共聚焦熒光標(biāo)記的細(xì)胞的圖像在同一試樣的透射光圖像的檢體，非共結(jié)合。使用這種方法將允許的，例如，確定的空間和時(shí)間方面的一段時(shí)間的小時(shí)或什至數(shù)年的未標(biāo)記細(xì)胞的人口內(nèi)的標(biāo)記的細(xì)胞的遷移的一個(gè)子集。
彩色透射光檢測(cè)器現(xiàn)已實(shí)施，收集發(fā)送的信號(hào)中的紅色，綠色和藍(lán)色（RGB）顏色通道來(lái)創(chuàng)建一個(gè)實(shí)際的彩色圖像的方式，是類(lèi)似的一些數(shù)字彩色攝像機(jī)。這種探測(cè)器是特別有用的病理學(xué)家，他們習(xí)慣于觀看真面目組織在透射光熒光數(shù)據(jù)覆蓋這些圖像。