徠卡顯微鏡：熒光簡介

熒光是由喬治·加布里埃爾·斯托克斯在1852年首次被發(fā)現(xiàn)。他指出，螢石開始發(fā)光后，用紫外光照射。熒光是一種形式的，它描述了由輻射產生的光子的材料被光照射后的光致發(fā)光。所發(fā)射的光具有比激發(fā)光的波長較長的。這種效應被稱為斯托克斯位移（Stokes shift）。

發(fā)光描述一個電子從激發(fā)態(tài)到較低的能量的狀態(tài)下的變化所造成的發(fā)光效應的發(fā)生。電子可以存在于不同的能量狀態(tài)。電子的基態(tài)是一個非常穩(wěn)定的狀態(tài)，并具有最低的能量水平。如果電子吸收能量時，它們可以被提升到一個更高的能量水平，提供一個激發(fā)態(tài)。由于更高的能量比基態(tài)激發(fā)態(tài)，能量被釋放時返回它的基態(tài)電子。這種能量可以釋放的形式發(fā)射光子。

有幾種形式不同的方式，系統(tǒng)被激發(fā)，例如，在電致發(fā)光系統(tǒng)通過電流激發(fā)發(fā)光，化學發(fā)光的發(fā)生是由于發(fā)生化學反應而從通過光子激發(fā)的光致發(fā)光的結果。

可以進一步分成兩個小組，熒光和磷光的光致發(fā)光。熒光和磷光之間的主要區(qū)別是其發(fā)光的持續(xù)時間。熒光照明停止時立即結束。與此相反，磷光可以持續(xù)幾個小時后的激發(fā)已經(jīng)結束。

圖 1：當使用一定波長的光（激發(fā)波長）的光子被吸收的分子的電子擊中的分子（例如熒光團）。然后，電子被從它們的基態(tài)（S ₀）提升到一個更高的能量水平，激發(fā)態(tài)（S ₁ '）。這個過程被稱為激勵（1）。激發(fā)態(tài)壽命很短（通常為10 ^-9 -10 ^-8秒），在這段時間（2）的電子的能量損失。當電子離開（₁）激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)（3），他們失去了在激勵過程中采取了剩余的能量。在熒光基團的情況下，能量被發(fā)射的光（熒光發(fā)射）的較長波長比激發(fā)光（并因此使用更少的能源）。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯移位。

熒光染料的熒光是當它們存在對應的波長的光照射。的波長取決于熒光團的吸收光譜，它必須確保合適數(shù)量的能量被傳遞到提升到激發(fā)態(tài)的電子。后電子被激發(fā)，它們可以駐留在這種高能量的狀態(tài)下，只有很短的時間。當電子放寬到基態(tài)或其他國家具有較低的能量水平，釋放能量，作為一個光子。在此過程中由于一些能量丟失，增加的波長和能量較低的光由熒光染料相比，所吸收的光的發(fā)射。

圖 2：COS 7細胞，綠色：未知的蛋白，綠色熒光蛋白，紅色：α-微管蛋白，CY3，藍：細胞核，DAPI。禮貌的卞偉教授，細胞研究中心研究院生物化學與細胞生物學研究所，上海生命科學研究院，中科院，上海，中國

 

圖 3：小鼠成纖維細胞，綠色：F-肌動蛋白，F(xiàn)ITC紅：微管蛋白，CY5，藍核，DAPI。由君特·吉斯博士，醫(yī)學研究的馬克斯普朗克研究所，海德堡，德國

 

圖 4：小鼠海馬神經(jīng)元，藍標記的轉染細胞，綠色：肌動蛋白，TRITC，紅色：紅色，灰色，德州GluA AMPA受體單元：突觸囊泡蛋白，CY 5

 

圖 5：果蠅幼蟲，綠色：RNA結合蛋白，Alexa的488

 

磷光的機理

由于磷光的分子可以更長的時間比熒光染料的發(fā)光，就必須有一個不同的方式中，它們存儲激發(fā)能量。這種差異的基礎上，發(fā)現(xiàn)在兩種形式的激勵水平，單線激發(fā)態(tài)和激發(fā)三重態(tài)，這是基于對不同自旋對齊。

自旋電子的屬性。以簡化的術語的自旋描述的電子通過其旋轉造成的角動量。一個電子的自旋的方向可以是正的（1/2）或負（-1 / 2）。自旋對較高的能量水平可以是在它們的方向彼此平行或反平行。在反平行自旋對個別的角動量相互補償，總自旋得到的值為零。這被稱為自旋排列單線態(tài)。兩個平行的旋轉不補償，并得到一個非零的值。在這種情況下，自旋被說成是在三重狀態(tài)。

熒光發(fā)生當電子從單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。但在某些分子，被激發(fā)的電子的自旋可以切換到在這個過程被稱為系統(tǒng)間橫穿三重態(tài)。這些電子失去能量，直到他們在三重態(tài)。此狀態(tài)是更高的能量比基態(tài)，但也比單線激發(fā)態(tài)能量較低。因此，電子無法切換回單狀態(tài)，也不是他們可以輕松地返回到基態(tài)，總自旋允許值為零，由于量子力學。因此，這些分子都被困在他們的能量狀態(tài)。 

但是，來自三重態(tài)到基態(tài)的一些變化是可能的時間。這些變化會引起輻射產生的光子和磷光。由于只有少數(shù)事件是可能的時間，三重態(tài)呈現(xiàn)一種能源水庫，使磷光可能在一個較長的時間段。

圖 6：果蠅幼蟲體育場，綠色：Feb211陽性神經(jīng)元和軸突，Alexa的488，紅色的纖維部分：中樞神經(jīng)系統(tǒng)（即所有軸突），CY3，藍核，DAPI。禮貌，德國克里斯托夫Melcher先生，博士研究所卡爾斯魯厄，毒物學和遺傳學研究所，Eggenstein-Leopoldshafen

 

圖 7：鼠標腎部分，綠色：腎小球和曲小管，Alexa的488 WGA：F-肌動蛋白（多見于腎小球和刷狀緣），紅，藍：細胞核，DAPI

 

 

 8：新生兒心肌細胞，黃色：DNA，的DAPI，綠：Myomesin，Cy3的紅色：鈣粘蛋白，德州紅，藍：肌動蛋白，Alexa的633

 

圖 9：中期蔓延FISH - 收購染色染色體熒光體視顯微鏡。的蘇托由美子博士，人類演化實驗室，前沿科學研究生院，東京大學提供

 

熒光顯微鏡

顯微鏡，熒光發(fā)光是最有用的一種。可以很容易地與他們的特定波長通過特定的光源（例如燈和過濾系統(tǒng)或激光）可區(qū)別于所發(fā)射的光的激發(fā)光的波長（斯托克斯移位）激發(fā)熒光染料。

使用熒光成像，實驗者可以表征分子在細胞內的量和本地化。熒光顯微鏡的另一個優(yōu)點是，可以同時使用多個熒光染料。的熒光染料只需要在他們的激發(fā)和發(fā)射波長變化。因此，可以同時觀察到不同的目標分子，允許一個巨大的各種試驗，例如，以進行共定位研究。