徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡發(fā)光的基本原理
有很多自然界中的發(fā)光過程。發(fā)光是一個總稱，這些類型的發(fā)光的事件是沒有結(jié)果的高溫。這篇文章描述了不同形式的發(fā)光和熒光的情況下進入細(xì)節(jié)。相關(guān)的技術(shù)術(shù)語描述熒光，就像淬滅，漂白或量子產(chǎn)率，說明在第二部分的文章給予詳細(xì)的洞察熒光分子的基本特征
發(fā)光過程
一些共同的生物學(xué)或生物化學(xué)實驗室方法是基于幾個“... escences”，如磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光和最后熒光的存在。熒光蛋白作為一個引進的話題，它可能是非常有用的學(xué)習(xí)多一點“... escences”。這些現(xiàn)象的起源在于拉丁詞見：escentia，這已經(jīng)意味著我們的視覺系統(tǒng)的連接。所有“... escences”描述，我們可以用我們的眼睛感知的物理，化學(xué)或生物過程。我們添加后綴“...... escence”詞匯的變化，行動或過程像字療養(yǎng)。
所以，很顯然，熒光的東西，我們可以看到，一些涉及變化或過程。我們將學(xué)習(xí)如何熒光滿足這些條件后。首先，我們將采取短期看看其他“... escences”，這是所有l(wèi)uminescences本身發(fā)光發(fā)光，這不是一個高溫的影響是通用的術(shù)語。因此，發(fā)光可以決定作為一個外表冰冷的身體輻射。這種輻射可以是化學(xué)反應(yīng)或亞原子運動或在晶體上的應(yīng)力的一個原因。作為結(jié)果的熱量的物質(zhì)（例如，熱金屬）所發(fā)出的光，以產(chǎn)生發(fā)射的另一種方法是白熱。
化學(xué)發(fā)光的發(fā)光過程中的化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，該產(chǎn)品具有的激發(fā)中間體。這中間落入地面狀態(tài)時，發(fā)光。不同于熒光，化學(xué)發(fā)光材料中的電子被激發(fā)，通過化學(xué)反應(yīng)，而不是由光子的吸收。化學(xué)發(fā)光認(rèn)定其技術(shù)應(yīng)用在例如熒光棒。一個眾所周知的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是魯米諾，它是用來在刑事找到血液的痕跡。在這里為Fe 2 +離子，它是存在于血紅蛋白作為催化劑的功能，使魯米諾發(fā)光配置。
如果一個生物體發(fā)光的，我們講的生物發(fā)光，不管如何產(chǎn)生光。有很多生物體產(chǎn)生光，就像螢火蟲（夜光Lampyris）或螢火蟲（北美產(chǎn)螢火蟲）。其他幾種真菌在一排是一個非常特殊的有機體的的杰克O'Lantern蘑菇（Omphalotus nidiformis），在黑暗中發(fā)光。大量的海洋生物，如一些珊瑚，藻類，crustacaea，甚至魷魚發(fā)光，大多是在藍(lán)色或綠色的頻譜。海居民Aequorea victoria的水母bioluminating 源的綠色熒光蛋白（GFP）。而螢火蟲，例如只使用一個化學(xué)過程，產(chǎn)生光，A. 維多利亞使用化學(xué)發(fā)光和熒光過程。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，水母蛋白水母發(fā)光蛋白的幫助下，通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色光。然后，使用該藍(lán)色光激發(fā)綠色發(fā)光熒光反應(yīng)導(dǎo)致已經(jīng)提到的綠色熒光蛋白在。
這使我們的問題是：“什么是熒光？” 熒光物質(zhì)發(fā)光波長較短的光的吸收的效果是一個過程。波長的差異被稱為斯托克的移位。詳細(xì)地說，如果發(fā)生熒光的物質(zhì)吸收光的光子的形式。這導(dǎo)致了電子的偏移到更高的能級。但這種高能量的情況很不穩(wěn)定，這就是為什么電子傾向于返回到基態(tài)。在此過程中的能量，可以被看作是一個發(fā)光的光子的形式再次釋放。磷光相比，電子能量轉(zhuǎn)移是非?？斓?，事實上，在納米秒的范圍內(nèi)（第1圖）。能擁有一種不同的發(fā)光波長與另一種不同的波長激發(fā)后的任何物質(zhì)，這是被稱為熒光染料。在下一節(jié)中討論了這些問題。最受歡迎的發(fā)熒光的物質(zhì)，存在于自然界中有廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜，但具有明確定義的最大激發(fā)和發(fā)射的物質(zhì)是更加有用的熒光顯微鏡。 類似的熒光，磷光與光激發(fā)磷光材料的發(fā)光的現(xiàn)象。即使它是密切相關(guān)的熒光，它是慢得多。熒光相反減速的再次發(fā)射的光子激發(fā)的電子能量由協(xié)會與“禁止”狀態(tài)。不會發(fā)生熒光的情況下盡可能快，因為他們返回到基態(tài)能量被“困”。磷光材料的典型例子是“輝光在這黑暗的”可以“充電”與普通燈泡或日光，然后發(fā)光幾分鐘甚至幾小時的玩具。 圖 1：熒光雅布隆斯基圖的 如上面已經(jīng)提到，熒光染料是任何能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)。在我們的例子中，熒光蛋白是一種熒光染料。在進入細(xì)節(jié)之前，我們將介紹一些詞匯及用語描述一種熒光蛋白。一個字的使用非常頻繁，在與熒光熒光：熒光分子（如蛋白質(zhì)）的那部分，這是負(fù)責(zé)其能力熒光。因此，GFP或其衍生物GFP或其衍生物與任何雜合蛋白的熒光基團（例如，α-微管蛋白-GFP）。但是，不具有熒光團是一種蛋白質(zhì)。FITC，TRITC（20個原子）量子點（100-100,000原子）等小分子，如熒光基團。 尋找稍微深一點到熒光團中，我們到達的發(fā)色團，它是一種分子，它的顏色定義（第2圖）的部分。內(nèi)的發(fā)色基團，電子和互連的發(fā)光（見上文）的能量電平轉(zhuǎn)換發(fā)生。有至少兩種形式的發(fā)色基團。或者為它們的共軛π電子共振系統(tǒng)（GFP），或金屬配合物（葉綠素，血紅素）構(gòu)建。 由于其相關(guān)的顯微鏡，我們將采取仔細(xì)看看GFP生色。事實證明GFP的發(fā)色團的形成沒有其他的輔助因子或酶組分比分子氧是必要的。定義的綠色熒光蛋白的氨基酸主鏈的一級結(jié)構(gòu)，自發(fā)形成中的自催化的折疊機構(gòu)，并通過分子內(nèi)重排完成。進入的細(xì)節(jié)，發(fā)色基團是由三個相關(guān)的氨基酸Ser65，Tyr66，Gly67依次進行的環(huán)化，脫水和氧化。這些反應(yīng)的結(jié)果是一個共軛的π-電子的諧振系統(tǒng)，成熟的綠色熒光蛋白發(fā)色團。 尋找上面的整個GFP結(jié)構(gòu)，環(huán)狀三肽坐落在中間的氣缸。該筒體是由11股線形成的β-桶結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)高的穩(wěn)定性。β桶結(jié)構(gòu)具有的直徑為3nm左右，高度為約4nm（第3圖）。到目前為止已知的所有的FPS有這樣的保護筒光物理性質(zhì)上有很大的影響。在綠色熒光蛋白基因的情況下，量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性也比較高。此外，非常緊湊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的高pH電阻。用GFP標(biāo)記的樣品是相對穩(wěn)健的溫度和高耐受性物質(zhì)，如多聚甲醛，尿素或鹽酸胍變性。 圖 2：層次熒光蛋白 圖3：綠色熒光蛋白（GFP）的分子結(jié)構(gòu) 盡管如此，還是有一定的局限和限制應(yīng)在下一節(jié)中提到的FPS。淬滅的過程中，例如，熒光團的強度，以可逆的方式降低。這種衰變的原因有多種。一方面，有可能是一個復(fù)合物的形成或一個內(nèi)部轉(zhuǎn)換。另一方面淬滅可以是能量傳遞過程的效果。稱為FRET顯微應(yīng)用需要利用這個程序。在福斯特共振能量轉(zhuǎn)移或熒光共振能量轉(zhuǎn)移到受體熒光A.熒光的D降低，而A增加的熒光，能量轉(zhuǎn)移的供體熒光e。 淬滅是一個可逆的過程相反，是一種不可逆的熒光下降過程被稱為漂白。永久熒光損失是基于長時間暴露在激發(fā)光的熒光破壞。漂白的量依賴于光源的強度，照射時間和能量。每個熒光漂白劑之前有一定的激發(fā)和發(fā)射周期。在GFP的情況下，每個分子可興奮約10 4 -10 5倍。符合0.1-1小號。 使用共聚焦激光掃描顯微鏡的光強度約為10 6 W /米2是常見的。這種高能劑量提供光子過量導(dǎo)致的現(xiàn)象，很多熒光分子的激發(fā)狀態(tài)。在這種情況下，他們不再在其通常的波長吸收光。有了它，有效的染料濃度的減少，或者換句話說，在顯示器上示出的像素是不再染料濃度的直接函數(shù)。與此相反，以用一個簡單的弧燈的照明，可以使用高能量的激光的激發(fā)和發(fā)射之間的一種非線性的關(guān)系。 談到熒光蛋白的效率，我們應(yīng)該提到的量子產(chǎn)率。這是另一種熒光團的特征相比，光子的輸入和輸出。對于某些熒光量子產(chǎn)率計算，除以發(fā)射光子吸收的 亮度的熒光蛋白是應(yīng)用熒光顯微鏡時要考慮的另一個重要特點。根據(jù)顯微鏡的質(zhì)量參數(shù)是在一個實驗的成功的一個關(guān)鍵點。一種客觀的方式來指定一種熒光蛋白的亮度是其摩爾消光系數(shù)的乘法運算，其量子產(chǎn)率除以1,000。摩爾消光系數(shù)的一種物質(zhì)，告訴我們一些關(guān)于其在不同的波長的光的吸收。詳細(xì)地說，摩爾消光系數(shù)是一個維度中的物質(zhì)的摩爾濃度為1厘米以上的距離在不同的波長的電磁輻射的吸光度。因此，對應(yīng)的單位是M -1 cm -1的。 在此計算中的幫助下，它可以用來比較的亮度不同的熒光蛋白。如果我們把摩爾消光系數(shù)為5.6萬平方米-1厘米-1和量子產(chǎn)率0.6EGFP的例子中，我們得到了一個價值33.6 M -1厘米-1。有時人們談?wù)摰南鄬α炼鹊臒晒獾鞍住?/span>在這種情況下的亮度乘以摩爾消光系數(shù)與量子產(chǎn)率和綠色熒光蛋白（33.6 M -1厘米-1）的亮度值除以計算。通過這樣做，相對亮度轉(zhuǎn)換為眾所周知的EGFP的速度稍快，使不同的熒光蛋白的比較 處理大量的熒光顯微鏡實驗觀察活細(xì)胞。以淬滅等特點，并考慮到漂白，生命細(xì)胞成像很明顯，是高度依賴于時間。即使在組織學(xué)的或固定的細(xì)胞樣品的情況下，重要的是不要太長的時間和太多的光強度，照射試樣。描述感興趣的抗蝕劑降低其熒光行為的機制的熒光蛋白的能力的參數(shù)的耐光性，耐光性被表示為通，直到為初始亮度的50％消失了的秒數(shù)。為了進行比較，和最多為10瓦/厘米2的弧光燈提供照明，而高強度的光源，如激光（高達100瓦/厘米2），可能會產(chǎn)生的非線性效應(yīng)。此外，測量和比較的耐光性，熒光蛋白樣品的pH值是標(biāo)準(zhǔn)化，以適于一個典型的哺乳動物細(xì)胞的大小的7.0和蛋白質(zhì)溶液的液滴。相鄰的具有上述的光源照明，是連續(xù)的。平行輻射產(chǎn)生的光子進行計數(shù)。EGFP的情況下，需要174秒的原始亮度的一半褪色（沙納等，2005）。換言之，排放量減少至1,000至500光子/秒174秒。 了解不同的特點，如激發(fā)和發(fā)射極大值，亮度，量子產(chǎn)率等有一定的熒光染料或蛋白實驗者能夠選擇不同的候選人或觀測條件滿足他的要求，具有一定的實驗設(shè)置。此外，他是能夠詳細(xì)地解釋結(jié)果，如果他知道照片的物理特性不同的熒光染料或蛋白質(zhì)。
熒光染料
淬滅和漂白
量子產(chǎn)率
亮度
耐光