尼康顯微鏡：三色成像激光掃描共聚焦顯微鏡的方法及應(yīng)用

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）通常用于產(chǎn)生數(shù)字圖像的單，雙，三熒光標(biāo)記的樣本。使用紅色，綠色和藍(lán)色（RGB）顏色的信息用于顯示多達(dá)三個(gè)標(biāo)記細(xì)胞的熒光探針，任何共定位觀察到不同的加色的彩色圖像時(shí)，合并成一個(gè)分布單三色圖像。

在本節(jié)中，我們提出了生產(chǎn)三色共聚焦圖像，采用了時(shí)下流行的圖像處理程序，Adobe公司的Photoshop先前公布的方法的簡(jiǎn)化版本。此外，多個(gè)應(yīng)用程序的顯示共聚焦圖像的三色的合并協(xié)議進(jìn)行了討論。請(qǐng)注意，這些數(shù)字化的方法不局限于使用激光掃描共聚焦顯微鏡的圖像，并可以適用于導(dǎo)入到Photoshop中的數(shù)字圖像，從許多不同的來源。

熒光標(biāo)記的樣本圖像使用一個(gè)型號(hào)Bio-Rad公司MRC-600激光共聚焦掃描系統(tǒng)，收集用人前面描述的方法在文獻(xiàn)中。選定的圖像共聚焦顯微鏡微電腦主機(jī)轉(zhuǎn)移到另一臺(tái)計(jì)算機(jī)的二進(jìn)制文件。圖像被直接導(dǎo)入到Adobe Photoshop中，無論是作為純二進(jìn)制文件（RAW）或標(biāo)簽圖像文件格式（TIFF）文件。在RAW文件的情況下，共焦圖像的實(shí)際尺寸必須被輸入，例如，一個(gè)典型的圖像大小為768×512像素，與一個(gè)76個(gè)字節(jié)的頭。標(biāo)題是特定的Bio-Rad公司專有的PIC文件格式，并從不同的公司可能會(huì)隨成像系統(tǒng)。這種信息的圖像文件應(yīng)免費(fèi)提供從各焦公司。相比之下，TIFF文件直接導(dǎo)入到Photoshop中打開。如果有必要，共聚焦圖像文件可以轉(zhuǎn)換為TIFF文件使用市售的程序設(shè)計(jì)操縱聚焦的文件或其他軟件，如NIH圖像，這是在互聯(lián)網(wǎng)上提供下載。存在的一些方案，共聚焦圖像，可用于進(jìn)一步的處理。

產(chǎn)生三色的圖像在Photoshop，粘貼各共聚焦顯微鏡觀察到紅色，綠色和藍(lán)色通道的RGB彩色圖像的灰度圖像。在下面的描述的過程中，包括在Photoshop程序內(nèi)的各種命令的位置（用斜體表示）后，每一個(gè)操作。不同版本的Photoshop可能使用略有不同的命令結(jié)構(gòu)，特定的命令或菜單位置，進(jìn)行相同的操作。在一個(gè)特定版本的具體操作上更多的詳細(xì)信息可在Photoshop的用戶指南。

一旦三個(gè)灰度圖像在Photoshop中打開，構(gòu)造一個(gè)空白的RGB圖像（文件，新建）。圖像必須為相同的尺寸和像素的分辨率為原來的三個(gè)灰度圖像的共聚焦顯微鏡，在這個(gè)例子中，768×512像素和72像素/英寸。可確定的大小和分辨率的圖像調(diào)整（圖像，圖像大小）。這種新的RGB圖像應(yīng)該是黑色的，因?yàn)樵跓晒鈭D像的背景通常是非常接近或黑色（黑= 0，白色= 255）。可以選擇另一種顏色的背景以美容為目的，但實(shí)際劃定的圖像區(qū)域的黑掩模的結(jié)構(gòu)應(yīng)能夠與實(shí)際的圖像中的信息的新的背景顏色不會(huì)干擾。

如果尚未打開，打開“ 通道“調(diào)板中應(yīng)該在這個(gè)時(shí)候（“ 窗口“，顯示頻道）。三個(gè)灰度圖像，現(xiàn)在準(zhǔn)備將其粘貼到新創(chuàng)建的RGB圖像。這是通過選擇*灰度圖像（選擇所有），并將其復(fù)制到新的RGB圖像（編輯，復(fù)制）所需的紅色，綠色或藍(lán)色通道，通過點(diǎn)擊在新創(chuàng)建的RGB圖像，并用鼠標(biāo)然后在“ 通道“調(diào)板中列所需的通道。例如，對(duì)于紅色通道，點(diǎn)擊紅色窗口在列。*后，灰度圖像粘貼到RGB圖像（編輯，粘貼）。圖像現(xiàn)在將出現(xiàn)在“ 通道“調(diào)板中列在紅色和RGB通道。正在選擇的第二和第三灰度圖像，復(fù)制和粘貼，分別為綠色和藍(lán)色通道的RGB圖像，使用相同的例程。這些操作的結(jié)果是一個(gè)單一的三色合并后的圖像（圖1（a）和（b）條），這是通過雙擊在頻道調(diào)色板列的RGB圖像上顯示。有從三個(gè)原始源圖像的位深度的信息沒有損失，因?yàn)?個(gè)8位的圖像合并成一個(gè)單一的24位圖像。的圖像顯示在圖1中的果蠅胚胎分別在三個(gè)不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，然后將其分配給不同的顏色通道，使用Photoshop產(chǎn)生三色的合并后的圖像的兩個(gè)版本的相同的三個(gè)采集圖像的創(chuàng)建。

在合并后產(chǎn)生的圖像的色彩層次可以改變使用水平（圖像，調(diào)整，色階）獨(dú)立調(diào)整紅，綠和藍(lán)色值的圖像。*后，對(duì)于呈報(bào)而言，圖像的亮度和對(duì)比度（圖像，調(diào)整亮度/對(duì)比度）是微調(diào)。可以查看和選擇圖像的微妙變化，利用變化（圖像/調(diào)整/變化）。在這個(gè)時(shí)候使用嵌套在Photoshop中的圖像處理功能，可以實(shí)現(xiàn)很多額外的操作。特別有用的功能允許除了圖形和匯編成多屏顯示的數(shù)字圖像。圖形其后更方便的編輯，如果他們被粘貼到一個(gè)單獨(dú)的層中的圖像，而不是永久地取代實(shí)際圖像本身的像素。

圖像保存到計(jì)算機(jī)的硬盤，選擇另存為（文件，另存為）。TIFF格式的圖像通常保存在壓縮使用的Lempel-Ziv的韋爾奇（LZW）計(jì)劃，這是完全損失。聯(lián)合圖像專家組（JPEG）壓縮其他的壓縮方法，如可以引入文物可能更加復(fù)雜，每次被重新存入一個(gè)文件。*終圖像存檔到CD-ROM或DVD-ROM。

彩色硬拷貝的圖像可以直接從Photoshop中使用一個(gè)高分辨率的數(shù)字彩色幻燈片機(jī)或數(shù)字熱升華打印機(jī)或其他顏色。這些設(shè)備是從Photoshop插件，避免了需要將圖像傳輸?shù)搅硪粋€(gè)程序尚未直接控制。詳細(xì)方面的海量存儲(chǔ)和編制的硬拷貝已在*近的文獻(xiàn)中廣泛檢討。單色圖像往往缺乏對(duì)比上熱升華打印機(jī)打印時(shí)。某種程度上，這個(gè)問題可以克服，由生產(chǎn)單一的RGB圖像，因?yàn)樵诖酥?，調(diào)整三個(gè)通道的相對(duì)水平，因此有資料打印的所有通道（圖像，調(diào)整，色階）。

對(duì)于合并兩個(gè)圖像，使用這種方法，第三通道空置。早期版本的Photoshop需要使用一個(gè)空的或黑色的，用于第三通道的空白背景圖像的紅色圖像的紅色通道，綠色圖像的綠色通道，在藍(lán)色通道的RGB圖像的空白圖像以產(chǎn)生一個(gè)紅/綠雙標(biāo)簽圖像。使用3.0.5版的Photoshop（或更高版本），可以粘貼到一個(gè)新創(chuàng)建的黑色RGB圖像灰度圖像。例如，要產(chǎn)生一個(gè)紅/綠圖像，單獨(dú)的圖像粘貼到紅色和綠色通道（圖2（a））。

為清楚地輸送收集的生物信息，通過共聚焦顯微鏡內(nèi)的三色的合并后的圖像的顏色的組合是很重要的。兩個(gè)*常用的熒光團(tuán)的真正的發(fā)光顏色，若丹明，熒光素，是便利，紅色和綠色，分別重疊域的表達(dá)是黃色的。這些都是用肉眼觀察顏色，配備適當(dāng)?shù)倪^濾器套同時(shí)雙標(biāo)成像，這是現(xiàn)在大部分的顯微鏡制造商在傳統(tǒng)的落射熒光顯微鏡。需要注意的是在一個(gè)三重標(biāo)簽樣品制備的共聚焦分析的第三信道通常在遠(yuǎn)紅外發(fā)射，例如菁（Cy5標(biāo)記），這是方便地顯示為數(shù)字圖像中的藍(lán)色，而往往是極其困難的真正的Cy5的排放可視化的眼睛和不那么容易描繪的數(shù)字圖像。

使用Photoshop，它是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的任務(wù)，實(shí)驗(yàn)的各種顏色組合成不同的渠道重新排列圖像。圖1中顯示的三色合并圖像的兩個(gè)版本作為參考。的檢體是一個(gè)果蠅胚上面的蜂窩胚盤階段，三重標(biāo)記的三個(gè)分割蛋白：毛在綠色（圖1（a））或紅色（圖1（b）），藍(lán)色（圖1（a） ，目前已知共有*過20種KLFs的）或綠色（圖1（b）），巨紅（圖1（a））或藍(lán)色（圖1（b））。不同版本的實(shí)現(xiàn)清理組件不同渠道使用分離通道（“ 窗口“，顯示通道，通道面板的下拉菜單中，分離通道）和重組合并通道（通道面板下拉菜單的圖像灰度圖像的RGB三色圖像合并通道，RGB顏色模式）。使用指定頻道的輸入框，該組件灰度圖像可以被分配給不同的信道的RGB圖像。因此，顏色并不一定對(duì)應(yīng)的試樣的實(shí)際顏色。

額外的顏色可以通過將兩個(gè)版本的相同的圖像，所述第二圖像中的第三信道合并成兩個(gè)，三個(gè)通道的雙標(biāo)簽圖像中包括。例如，紫色和綠色的圖像所產(chǎn)生的相同的圖像粘貼到紅色和藍(lán)色通道，得到紫色，并且被放置到所述第二圖像的綠色通道（圖2（b））。附加的顏色組合是紅色和淡藍(lán)色，淡藍(lán)色包括藍(lán)色和綠色通道;或藍(lán)色和黃色的，其中包括紅黃色和綠色通道（圖2（c））。在此，重疊的表達(dá)總是顯示為白色的圖像中的時(shí)間向所有三個(gè)通道的重疊信號(hào)（圖2，（b）和（c）項(xiàng)）。不同的顏色組合表現(xiàn)出這里利用一個(gè)果蠅三齡翼成蟲盤標(biāo)本雙標(biāo)無翅，紅色，綠色，或藍(lán)色（圖2（a）至圖2（c）），綠色，紫色achaete，或黃色（圖2（a）至圖2（c），分別）。這些額外的色彩組合時(shí)，可以使用多面板的數(shù)字*過三種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的圖像顯示在單獨(dú)的面板，讓不同的顏色分配給每個(gè)蛋白質(zhì)的幾個(gè)雙標(biāo)。請(qǐng)注意，細(xì)胞核，共表達(dá)無翅及achaete的顯示在圖2（a）和白在圖2（b）和圖2（c），為黃色。

這種合并共聚焦圖像的方法被廣泛用于映射雙重和三重標(biāo)記標(biāo)本中的大分子分布。由于絕妙的特異性免疫熒光法，很多的圖像時(shí)是相當(dāng)抽象的視為單一灰度圖像，在許多情況下，當(dāng)?shù)诙虻谌龍D像的組織內(nèi)的公知的地標(biāo)顯示在同一時(shí)間只能被解釋。這是典型的核標(biāo)記的熒光原位雜交（FISH）。這些圖像通常由相對(duì)較少的明亮像素大多是黑色的背景上，只能解釋當(dāng)?shù)诙€(gè)，復(fù)染的形象與明亮的彩色雜交中心的整個(gè)細(xì)胞核或染色體蔓延收集和合并的圖像。污漬如YOYO-1（激發(fā)*大值491納米）或TOTO-3（激發(fā)*大值642納米）的二聚核酸*counterstains為這些目的。近日，已*過三探頭定位于同一染色體組合標(biāo)記策略。在這里，更復(fù)雜的計(jì)算機(jī)圖像合并和測(cè)量方法已經(jīng)發(fā)展到在影像中顯示的生物信息。

多標(biāo)簽的是共焦成像發(fā)育生物學(xué)家研究細(xì)胞譜系的一個(gè)，或有時(shí)兩個(gè)分布，蛋白質(zhì)可以作為地標(biāo)映射顯影組織內(nèi)的第三感興趣的蛋白質(zhì)的克隆和分析一個(gè)**的工具。此外，熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽是一個(gè)方便的探頭包括在成像細(xì)胞輪廓的三重標(biāo)簽策略。染料的具體組合，例如羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞的輪廓，TOTO-3標(biāo)簽核（Cy5的通道），以及抗體，該抗體的蛋白質(zhì)的感興趣（熒光通道）可以用在一個(gè)三標(biāo)簽策略映射到細(xì)胞核的蛋白質(zhì)的位置，到細(xì)胞質(zhì)中，或細(xì)胞外基質(zhì)。

除了 顯示多達(dá)三個(gè)不同的大分子在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)分布相結(jié)合的三幅圖像，這種方法可以用來作為一種替代試樣內(nèi)的顯示深度信息的三維（3-D ）重建。使用激光掃描共聚焦顯微鏡，一系列的圖像不同的焦平面內(nèi)的試樣收集到一個(gè)單一的文件或z系列。這些圖像保持從檢體的x，y，和z登記，并具有相同的尺寸和像素的分辨率。三幅影像選自這樣的z系列，導(dǎo)出為單一圖像文件到Photoshop，然后將它們合并和以前一樣，使紅色，綠色和藍(lán)色的顏色被分配給在不同的深度范圍內(nèi)的試樣（圖3（結(jié)構(gòu)一個(gè)）和（b））。以類似的方式，單個(gè)圖像可以提煉出三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)收集的共聚焦顯微鏡并結(jié)合成一個(gè)三色的合并后的圖像的隨時(shí)間推移的電影序列文件。這些文件是z系列的文件類似，不同的是時(shí)間已取代z維度。在這里，顏色差異是用來總結(jié)的位置結(jié)構(gòu)的變化，隨著時(shí)間的推移在一個(gè)單一的形象。

在圖3（a）所示的圖像合并三個(gè)圖像從彩色顏色是編碼，使試樣中的深度的Z系列投影的結(jié)果。上皮細(xì)胞核顯示為綠色與規(guī)模形成在藍(lán)色和紅色在不同級(jí)別上皮細(xì)胞的細(xì)胞核。標(biāo)本是一個(gè)整體安裝蝴蝶蛹翼上皮細(xì)胞用碘化丙啶染色。在圖3（b）中，不同的結(jié)構(gòu)在一個(gè)雙標(biāo)簽圖像映射到深度比圖3（a）一個(gè)整體安裝在稍晚的發(fā)展階段的蝴蝶翅膀上皮。細(xì)胞核被標(biāo)記為與TOTO-3，和在更背側(cè)的位置在上皮細(xì)胞核的新興鱗翅與得克薩斯紅鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。

Photoshop中還可以提供一個(gè)進(jìn)一步的處理的圖像文件是兼容的，因?yàn)榕c許多其他程序的橋梁。例如，發(fā)展的共聚焦圖像序列已使用Photoshop處理，隨后轉(zhuǎn)移到市售的變形程序，加工成短動(dòng)畫序列的發(fā)展。這些序列可以進(jìn)一步編輯和編譯使用Adobe Premiere視為使用蘋果的QuickTime軟件，直接在電腦上（以及其他適用的軟件可以用來）數(shù)字電影，用于演示目的或?qū)С龅戒浵駧稀?/span>

Photoshop是可用于許多不同的計(jì)算機(jī)平臺(tái)，并可以運(yùn)行在大多數(shù)的共聚焦顯微鏡主機(jī)電腦。一些更復(fù)雜的共焦成像系統(tǒng)是能夠收集，合并和使用三個(gè)檢測(cè)器的系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠消除Photoshop的使用，同時(shí)上色三個(gè)圖像。但是，它通常是需要使用額外的實(shí)驗(yàn)室微型計(jì)算機(jī)操作以便騰出共焦工作站，它的主要目的，采集圖像的共聚焦圖像。此外，用于編譯的*后數(shù)字，它可能有必要在*終的板從其他來源的圖像相結(jié)合共聚焦圖像，并且在這種情況下，一個(gè)單一的圖像處理程序，可以用在許多不同的實(shí)驗(yàn)室計(jì)算機(jī)的通用性是非常寶貴的。