徠卡LAS X功能之共定位分析

熒光共定位分析是對細(xì)胞中兩種帶有熒光標(biāo)記的蛋白、細(xì)胞器或者藥物、納米材料等之間的空間相互位置關(guān)系進(jìn)行分析，以確定它們是否定位于同一區(qū)域或存在相關(guān)性，在細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。 

*直觀*簡單的共定位分析就是直接看不同顏色的熒光之間是否重疊，比如蛋白A標(biāo)有綠色熒光，蛋白B標(biāo)有紅色熒光，如果蛋白A和B共定位則綠色紅色疊加顯示為黃色（圖1）。只是這種方式無法提供準(zhǔn)確的定量結(jié)果，已無法滿足科研工作者越來越高的要求。所以我們需要可以提供量化結(jié)果的更專業(yè)的共定位分析。

圖1. 綠色熒光標(biāo)記的蛋白A（左）；紅色熒光標(biāo)記蛋白B（中）；A和B位置重疊，熒光顯示黃色（右）

 1  進(jìn)入Quantify

 2  在Tools中選擇Colocalization

共定位分析是對兩個熒光通道之間進(jìn)行分析，所以對于通道數(shù)多于兩個通道的數(shù)據(jù)，需要先確定分析哪兩個，把暫不分析的通道點灰，即可得到共定位結(jié)果及散點圖。

 3  Statistics里面即顯示共定位分析結(jié)果：Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等。既可以對整張圖進(jìn)行分析，也可以使用區(qū)域選擇工具圈出感興趣區(qū)域ROI進(jìn)行分析。

 4  Parameters 為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，可以進(jìn)行相關(guān)的參數(shù)設(shè)置。

共定位結(jié)果的精準(zhǔn)度與圖像的分辨率密切相關(guān)。但由于衍射極限的存在，常規(guī)共聚焦光學(xué)分辨率只有200nm左右，如果是觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)當(dāng)然輕松，也很容易就能準(zhǔn)確判斷其共定位程度，但細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器、蛋白結(jié)構(gòu)等尺寸往往更小，我們?nèi)绻枨蟾珳?zhǔn)的結(jié)果就需要選擇與之匹配的*高分辨率成像技術(shù)：如達(dá)到120nm的高分辨率LIGHTNING技術(shù)，達(dá)到30~50nm的*高分辨率STED技術(shù)（圖2）等。隨著分辨率的提高我們可以看到的結(jié)構(gòu)越來越精細(xì)，得到的共定位結(jié)果當(dāng)然越來越準(zhǔn)確。所以在進(jìn)行共定位實驗時我們可以盡量選擇更高分辨率的成像方式。

圖2. 分辨率對共定位的影響，STED成像和普通共聚焦成像

此外在樣品準(zhǔn)備和采圖時：

1) 串色會嚴(yán)重干擾到共定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以實驗時可盡量選擇串色較少的染料組合以避免串色帶來的干擾；如果選擇的染料串色，采圖時也可以優(yōu)化調(diào)節(jié)檢測范圍以排除串色干擾，當(dāng)然也可以使用序列掃描的方式。

2) 采圖時盡量選擇高數(shù)值孔徑的物鏡以獲取*優(yōu)分辨率，同時注意采樣頻率需要滿足Nyquist采樣定理（可通過Optimize xy-Format功能來調(diào)節(jié)format實現(xiàn)），從而得到與*優(yōu)分辨率匹配的pixel size，以避免采樣頻率不足導(dǎo)致的信息丟失，以及采樣頻率過高可能引起的光漂白。

3) 采圖時確保各熒光通道不過曝，盡量獲取信噪比好的圖像。優(yōu)異的原始數(shù)據(jù)是后期定量分析和去卷積處理的*佳保障。

4) 采圖后可進(jìn)行去卷積處理（如Huygens或者HyVolution中的deconvolution）以獲取信噪比、分辨率更好的數(shù)據(jù)，得到更準(zhǔn)確的共定位分析結(jié)果。

5) 共定位分析有多種分析算法，如Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等，每種算法都有各自的特點和*佳適用情況，所以我們需要根據(jù)具體情況來選擇，或者采用結(jié)合多種算法結(jié)果來分析^{【1】【2】【3】}。

*后，祝大家可以輕松愉快地做好共定位分析實驗啦。