利用金屬鍍膜可視化DNA分子
重金屬（如鉑）的精準(zhǔn)小角度旋轉(zhuǎn)投影可用于透射電子顯微鏡（TEM）成像，以觀察先前被吸附在細(xì)小顆粒度、電子束可穿透的碳薄膜上的樣本分子細(xì)節(jié)。
為了得到*高的對比度和更好的成像質(zhì)量，鍍膜必須是方向性的，而且需要和樣品有一個(gè)精準(zhǔn)的角度。此外，覆蓋樣品表面的金屬層顆粒精細(xì)度和鍍膜材料的厚度均一性，也是獲得高質(zhì)量TEM圖像的關(guān)鍵要求。
今天小編給大家介紹的是電子束蒸發(fā)在DNA分子可視化中的應(yīng)用。本文中的實(shí)驗(yàn)方法*初由José Sogo博士在蘇黎世ETH研究所實(shí)驗(yàn)室獲得，改進(jìn)后由Massimo Lopes教授在蘇黎世大學(xué)IMCR研究所得以推廣[1]。由于該方法在2018年又進(jìn)行了優(yōu)化[1]，因此，給大家簡要介紹其*新關(guān)鍵步驟，以及生物科學(xué)家如何使用徠卡EM ACE600高真空鍍膜儀獲得高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖1. 徠卡高真空鍍膜儀EM ACE600
小角度旋轉(zhuǎn)投影
徠卡新一代EM ACE600（圖1）可產(chǎn)生均勻、非常薄且顆粒度小的電子可穿透性碳層，因此可用于吸附生物樣本（如DNA分子、蛋白質(zhì)或DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物）。然后使用精確且可再現(xiàn)的投影角度將單個(gè)分子或吸覆在碳膜上的大分子復(fù)合物投影，從而產(chǎn)生高對比度TEM圖像。
圖2. 科學(xué)家和EM ACE600
實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟、DNA樣品的準(zhǔn)備
該方法適用于已經(jīng)純化好的、不含蛋白質(zhì)和RNA分子的DNA樣品，可以基于DNA鏈的不同厚度來區(qū)分雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈DNA(ssDNA)。
*步 DNA分子在甲酰胺，乙二醛和去垢劑芐基-二甲基-烷基-氯化銨（BAC）中形成穩(wěn)定溶液。這種混合物通過特定的擴(kuò)散方式散布在水表面上，DNA分子形成單分子層膜。
第二步 用400目TEM銅網(wǎng)接觸水面上的DNA單分子層膜，在該銅網(wǎng)表面形成均勻、低顆粒度的薄層（4-8nm）。然后將其立即浸入乙醇和乙酸雙氧鈾溶液中。
第三步 對吸覆DNA分子的銅網(wǎng)進(jìn)行精準(zhǔn)的小角度旋轉(zhuǎn)投影，鍍鉑8nm。這種負(fù)染對于dsDNA鏈的可視化特別有效。
圖3. EM ACE600高真空樣品倉和傾斜式雙鍍膜靶源
如何利用EM ACE600制備高質(zhì)量的碳膜層？
高質(zhì)量的碳膜和精確的小角度旋轉(zhuǎn)鉑金投影的結(jié)合才能產(chǎn)生高質(zhì)量的DNA鏈的TEM圖像。使用EM ACE600高真空鍍膜儀在V2高級云母片上產(chǎn)生碳膜，然后將其漂浮在水的表面上，*后在上面放置400目銅裸網(wǎng)，無額外的方華膜和支撐材料，這種方法產(chǎn)生的碳膜高效吸收DNA分子，并且不需要輝光放電（glow discharge）。
如何利用EM ACE600進(jìn)行小角度旋轉(zhuǎn)投影的鍍鉑？
400目銅網(wǎng)表面吸附的DNA分子，需要進(jìn)行精準(zhǔn)的小角度旋轉(zhuǎn)投影。借助ACE600，8 nm鉑膜制備將十分簡單，只需將銅網(wǎng)固定在EM ACE600的GRID臺子上（圖3），運(yùn)行EM ACE600兩個(gè)不同的程序即可。
1 在碳網(wǎng)表面上噴鍍0.4 nm的鉑金層，此過程鍍膜夾角為1°且不旋轉(zhuǎn)GRID臺子；
2 同樣以1°夾角鍍膜7.6 nm的鉑層，但將GRID臺子的旋轉(zhuǎn)速度設(shè)定為1級。
結(jié)果優(yōu)化須知
將蒸發(fā)參數(shù)（主要是蒸發(fā)速度）設(shè)定為在恒定值（0.03-0.08 nm/s）以保持合適的蒸發(fā)速度，對于形成理想碳膜厚度和小角度旋轉(zhuǎn)投影非常重要。為了得到高質(zhì)量的細(xì)顆粒金屬層，電子槍和蒸發(fā)室必須保持極其清潔。
圖4. EM ACE600觸控屏交互方式
新一代高真空鍍膜儀優(yōu)點(diǎn)
與上一代MED蒸發(fā)鍍膜儀相比，新一代徠卡EM ACE600高真空鍍膜儀具有眾多優(yōu)點(diǎn)。
鍍膜儀采用優(yōu)化的設(shè)計(jì)和堅(jiān)固的硬件，使其具有良好的操作性和結(jié)果穩(wěn)定性。電子槍的改進(jìn)和新式電子控制系統(tǒng)可以讓用戶在觸控屏上查看、設(shè)置所有參數(shù)。此外，EM ACE600還具有安全警報(bào)功能，如果張力和電流*過一定值，則不會產(chǎn)生電子蒸發(fā)，這有助于用戶的安全操作和設(shè)備的自我保護(hù)，獲得可靠結(jié)果同時(shí)延長設(shè)備使用壽命。
DNA分子（寬度約2.2-2.4 nm）的可視化，要求非常精準(zhǔn)且可再現(xiàn)的投影角度，因此對鍍膜儀的要求很高！
新一代徠卡EM ACE600采用參數(shù)可視化和精準(zhǔn)控制的交互方式（圖4），允許用戶無需具備深厚相關(guān)工作經(jīng)驗(yàn)和大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，甚至可以直接調(diào)用其他用戶已保存的單個(gè)或整個(gè)操作參數(shù)，即可完成意想不到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果！
結(jié)果
使用BAC、醋酸鈾染色和EM ACE600制備的小角度旋轉(zhuǎn)投影可視化溶液中質(zhì)粒DNA分子的TEM圖像（圖5）。這些圖像表明，該方法可以有效可視化、區(qū)分ssDNA和dsDNA。
比例尺（大約相當(dāng)于1 kb DNA長度）。紅色箭頭表示質(zhì)粒復(fù)制區(qū)域。dsDNA厚度約為20 ? （1 ? = 1x10-10 m= 0.1 nm）。在該實(shí)驗(yàn)條件下，0.36 nm大致對應(yīng)于1 bp的dsDNA。該結(jié)果使用某品牌透射電子顯微鏡，在80 KV下成像。
圖5a. 使用EM ACE600鍍膜儀可視化溶液中質(zhì)粒DNA分子的TEM圖像。成像條件如上述
圖5b. 使用EM ACE600鍍膜儀可視化溶液中質(zhì)粒DNA分子的TEM圖像。成像條件如上述
圖5c.含復(fù)制叉的DNA TEM照片，DNA提取自芽殖酵母S.cerevisiae。
比例尺（大約相當(dāng)于1 kb DNA長度），成像條件如上述
參考文獻(xiàn)
[1] Zellweger R., Lopes M.. Dynamic Architecture of Eukaryotic DNA Replication Forks In Vivo, Visualized by Electron Microscopy. Methods Mol Biol. 2018;1672:261-294. doi: 10.1007/978-1-4939-7306-4_19
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043630
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