徠卡顯微鏡在核孔復(fù)合組織提出了新的見解
徠卡顯微鏡在核孔復(fù)合組織提出了新的見解
核孔復(fù)合物 （NPC）在核膜一個大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，表示其柵極連接到所述真核基因構(gòu)成。 這種復(fù)雜的由幾百形成為注定要進(jìn)入或離開核化合物的選擇性柵極蛋白質(zhì)。
正因為如此出色的功能NPC的結(jié)構(gòu)是極大的興趣。 到目前為止，全國人大結(jié)構(gòu)分析已主要限于結(jié)晶研究或電子顯微鏡（EM）。 單組分的幾種結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破譯通過晶體學(xué)。 然而，復(fù)雜的內(nèi)各個蛋白質(zhì)的組織仍然難以捉摸。 一個間隙現(xiàn)已關(guān)閉通過使用超分辨率顯微鏡。
揚(yáng)Ellenberg和他的科學(xué)家團(tuán)隊在EMBL海德堡已經(jīng)獲得了新的見解的NPC結(jié)構(gòu)的徠卡顯微鏡基態(tài)損耗（GSD）的幫助。
安娜·辛波絲卡最近公布的這項研究的科學(xué)文章中的結(jié)果“核孔支架結(jié)構(gòu)由超分辨率顯微鏡和粒子平均分析”和她的成就的意見和基態(tài)損耗顯微鏡的蛋白復(fù)合物的分析在隨后的采訪中的潛力。
什么是GSDIM方法的研究優(yōu)勢？
在我們的研究中，我們試圖了解大型多蛋白復(fù)合物，如核孔復(fù)合物（NPC），都建立。 因為它們的尺寸和復(fù)雜性，例如分子機(jī)器都超出了單個方法的范圍和長期以來一直用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的一個挑戰(zhàn)。 原子分辨率的方法，例如X射線晶體學(xué)或核磁共振需要純化的樣品，并且不適合于非常大的集。 雖然，電子顯微鏡可以觀察大復(fù)合體在其天然環(huán)境中的細(xì)胞，它往往是很困難的分配的電子密度，以個別蛋白質(zhì)。 在熒光顯微鏡中的蛋白質(zhì)的身份是已知的，超分辨率（SR）現(xiàn)在讓我們來可視化低于衍射極限的細(xì)節(jié)。 當(dāng)SR被結(jié)合的顆粒平均，蛋白'位置可以被映射到一個亞納米精度，一個尺度，使得適用于大型復(fù)合結(jié)構(gòu)的研究光鏡。 因此SR顯微鏡可以連接不同類型的數(shù)據(jù)，最終幫助生成的多蛋白組件偽原子模型。 此外，特別是GSDIM等本地化SR方法的一大優(yōu)勢是，他們使用比較簡單，并定期讓蛋白，是10-20納米相隔的分辨率。 這對我們來說很重要，因為我們能夠獲得大的數(shù)據(jù)集，并期待在許多不同的標(biāo)記在一個相對有效的方式。
什么是新的洞察它給了你關(guān)于核孔復(fù)合體的結(jié)構(gòu)？ 你去過哪些細(xì)節(jié)能夠看到第一次？
Nucleoporins是建立核孔（見圖1）的蛋白質(zhì)。 首次，SR顯微鏡使得有可能解決的幾個這些蛋白質(zhì)的組織中的環(huán)周圍的人大。 平均數(shù)千這些環(huán)允許我們測量不同nucleoporins的位置相對于所述孔的與亞納米精度的中心.然后我們可以系統(tǒng)地進(jìn)行比較，構(gòu)成所謂Nup107-160 subcomplex，這是人大最大積木和孔的結(jié)構(gòu)骨架的主要組成部分nucleoporins的徑向位置。
圖1：一個U2OS細(xì)胞標(biāo)記抗核孔蛋白Nup133的抗體和綴合的Alexa Fluor沿著傳輸軸線觀察647.個別的NPC的二次抗體的核的底面是作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)可見。 比例尺：3微米。
如何將我們的核孔復(fù)合物的認(rèn)識已經(jīng)被現(xiàn)在修改？
在我們最近的研究中，我們提供的位置限制為Nup107-160 subcomplex的成員和在此基礎(chǔ)上的數(shù)據(jù)，我們能夠解決一個長期存在的爭論在該領(lǐng)域：本subcomplex的取向的問題相對于所述傳輸軸。 這是理解如何NPC的結(jié)構(gòu)支架的組織又邁進(jìn)了一步。 我們希望，在未來，我們將能夠映射毛孔所有蛋白質(zhì)，并提供這一重要運(yùn)輸機(jī)的全面的結(jié)構(gòu)模型。
請描述您剛剛開發(fā)用于組合數(shù)千超分辨率顯微鏡圖像，達(dá)到低于1納米精密的方法。
雖然SR顯微鏡讓我們想象周圍的NPC中心nucleoporins的組織，這些圖像的原始分辨率將不足以直接看到相同的subcomplex個別蛋白質(zhì)之間的微小差異。 因此，我們開發(fā)了一種分析方法，其中，染色用特定的標(biāo)記個別的NPC的許多圖像在空間中仔細(xì)對齊的孔的中心，或者在標(biāo)記的第二信道的參考蛋白質(zhì)的位置，然后被相加，以產(chǎn)生的平均圖像（見圖2）。 由于我們使用幾千相同的結(jié)構(gòu)的圖像，該注冊過程是非常精確的。 我們隨后能夠通過用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型擬合平均信號，以確定的熒光標(biāo)記物的位置。 重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，這個平均化過程的精度在很大程度上取決于對原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量在一定程度上。 為了使我們的測量不同的蛋白和實(shí)驗之間絕對的可比性和消除低質(zhì)量的染色潛在的文物，我們實(shí)現(xiàn)了一個自動分析的管道控制參數(shù)，如定位精度和密度。 關(guān)于生產(chǎn)的統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)據(jù)，我們可以在從GSDIM方法的可靠性和堅固性和有效的漂移補(bǔ)償（SUMO）階段加成益處。
圖2：平均過程示例結(jié)果。 （A）的NPC的圖像標(biāo)記對Nup96抗體（高斯濾波）。 （B）NPC的平均圖像用針對Nup96抗體通過比對和8000圖像各個毛孔的總結(jié)產(chǎn)生。 （三）各地人大的中心上Nup96熒光標(biāo)記，從平均圖像的輪廓確定的平均位置。 比例尺：0.1微米。
總而言之，我們的方法是通用的，并允許確定該熒光標(biāo)記的位置相對于中心對稱結(jié)構(gòu)的或具有亞納米精度和精度的參照蛋白質(zhì)。 應(yīng)用這種方法的核孔的幾個不同的蛋白質(zhì)，我們可以相對于所述結(jié)構(gòu)的中心分配它們的相對位置。 此信息使我們能夠確定在NPC支架單個subcomplex的方向（見圖3）。
圖3：應(yīng)用的平均化過程在Nup107-160 subcomplex（由不同顏色描繪）的幾個表位，它們的相對位置可被確定。 染色通過使用GFP融合蛋白的納米抗體的標(biāo)簽來實(shí)現(xiàn)。 位置信息是與覆蓋全國的細(xì)胞質(zhì)環(huán)的EM結(jié)構(gòu)。 電子密度圖禮貌O. Medalia教授
什么是要克服用于制備超分辨率的樣品的一般障礙？ 你使用這個研究，標(biāo)記？
當(dāng)工作在這個項目中，我們意識到，獲得最佳的熒光標(biāo)記是在一個SR實(shí)驗中最關(guān)鍵的步驟和超分辨率方法一般需要更高質(zhì)量的樣本比傳統(tǒng)的顯微鏡。 盡管幾個方面的樣品制備的，如低背景和良好的結(jié)構(gòu)保存，是重要的，這兩個最重要的限制因素在我們的情況下是標(biāo)記試劑的大小，和可實(shí)現(xiàn)的標(biāo)簽密度。 最初我們使用間接免疫熒光用抗核孔蛋白的抗體，這使得內(nèi)源性蛋白在細(xì)胞中的特異性標(biāo)記。 然而，使用的抗體的一個主要問題是它們的大小 - 它們可以通過最多為15nm可能抵消從目標(biāo)表位的熒光團(tuán)。 此外，我們的平均方法需要具有高密度的標(biāo)簽樣本。 這僅是可實(shí)現(xiàn)具有非常高的親和力的抗體和我們只能夠獲得這樣的試劑，用于我們感興趣的，我們通過表達(dá)nucleoporins作為GFP融合蛋白和染色的樣品的熒光小解決這兩個問題的nucleoporins的一個子集標(biāo)記的抗GFP納米抗體,這是只有十分之一的常規(guī)IgG的大小，從而減少了潛在的一半以上的偏移。 重要的是，這個標(biāo)簽是由基因編碼它使我們能夠在一個簡單的和可比的方式標(biāo)注幾個nucleoporins。 為了達(dá)到最大的標(biāo)記密度，我們通過RNA干擾耗盡內(nèi)源性未標(biāo)記的蛋白質(zhì)。（奧林巴斯顯微鏡）
你看到了使用新的GSD 3D技術(shù)在你的研究領(lǐng)域是什么可能性？
像所有的大蛋白質(zhì)復(fù)合物，人大是一個三維結(jié)構(gòu)，并為了了解它是如何建成，超分子組裝體的所有部分的一個高分辨率三維視圖將是必要的。 盡管我們最近的研究提供了新的見解全國人大支架的組織，我們只能夠確定nucleoporins的位置在一個方向 - 沿孔的半徑。 在3D執(zhí)行這樣的測量將更加翔實(shí)。
此外，我們相信，超高分辨率顯微鏡將成為不只是核孔結(jié)構(gòu)的研究，還包括其他大蛋白組件的有價值的工具。然而，在人大的情況下，我們是由以下事實(shí)，即細(xì)胞核幾百孔的底部是在相同的方向可見幫助 - 這簡化我們的分析。 這種擇優(yōu)取向沒有找到許多其他有趣的多蛋白組件的，和超分辨率這種復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究將只可能與3D成像。