徠卡顯微鏡低溫?zé)晒怙@微鏡與低溫電子顯微鏡組合
許多生物的見解可以通過組合熒光顯微鏡（FM）與電子顯微鏡（EM）的力量來研究同一樣品獲得 - 這就是所謂的相關(guān)光學(xué)和電子顯微鏡（CLEM）。 在FM，特異性蛋白可被標(biāo)記和識別，并且其動(dòng)態(tài)和交互可以在固定或活細(xì)胞可視化。在EM中，充分的環(huán)境的上下文中可以看出，能夠得到高分辨率的細(xì)節(jié)。在這篇文章中，我們介紹CLEM的理念，特別注重對低溫CLEM：低溫FM與冷凍EM的組合。
熒光和電子顯微鏡的局限性
當(dāng)研究在細(xì)胞內(nèi)或在分子間的相互作用的水平的生物事件，科學(xué)家經(jīng)常被調(diào)頻的空間分辨率的限制。所謂的“*級分辨率”的方法大大有助于克服這種限制，以允許單個(gè)熒光標(biāo)記的，其分辨率達(dá)幾十納米的本地化某種方式。調(diào)頻也是有限的，因?yàn)樗鼉H視像化的熒光標(biāo)記物，并沒有提供關(guān)于在此標(biāo)記被觀察到的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)的上下文信息。該第二限制也可以是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗峁┑奶禺愋?，從而允許標(biāo)記的分子在一個(gè)致密的海未標(biāo)記的分子來鑒定。
相反，觀察具體的標(biāo)記分子，EM形象化的電子密度的地方差異。這使它成為理想的技術(shù)來分析大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或描述細(xì)胞形態(tài)和環(huán)境。在EM中，但是，它難以直接區(qū)分特定類型的分子。在CLEM實(shí)驗(yàn)，調(diào)頻和EM都進(jìn)行了同樣的樣品，以從調(diào)頻鏈接特定的或動(dòng)態(tài)的信息，具有高分辨率或自EM的環(huán)境信息。
為TEM和低溫EM樣品制備
理解CLEM的挑戰(zhàn)，有必要檢討了EM樣品的性質(zhì)。 在透射電子顯微鏡（TEM），電子束照射的樣品和投影圖像被記錄。當(dāng)A投射到試樣，被加速的電子相互作用和被吸收或散射。樣品需要足夠薄的電子束穿過樣品。由于存在于顯微鏡柱的真空，樣品也需要在干燥，固體狀態(tài)下它們不會(huì)立即分散到真空將被成像。
生物標(biāo)本用于TEM中*常見的制備方法是按順序更換所有的水樣品通過醇，然后嵌入與被聚合的樹脂，從而產(chǎn)生固體塊。此塊然后用切片機(jī)，得到切片的TEM成像足夠薄切片。以提高對EM圖像的信號和對比度，可樣品制備過程中加入電子致密材料，例如重金屬染色。
用于樣品制備的替代的可能性是迅速凍結(jié)的樣品玻璃化所有包含的水。 這可以通過快速切入含薄標(biāo)本為液化天然氣，如乙烷網(wǎng)格或通過使用高壓冷凍裝置，隨后冷凍切片來實(shí)現(xiàn)。這種技術(shù)的好處是，樣品保持水合以緊密到天然狀態(tài)和其分子結(jié)構(gòu)被*佳保留。 由此產(chǎn)生的“低溫的樣品”可以然后在EM成像（這是冷凍EM），只要它們保持在任何時(shí)候都在溫度接近液氮。（奧林巴斯顯微鏡）
在冷凍的EM圖像對比度的效果僅由在生物分子和周圍的冰之間的電子密度的差異。因此，該圖像包括對樣品的分子結(jié)構(gòu)的信息。冷凍EM可以達(dá)到<5納米單個(gè)圖像分辨率。當(dāng)與計(jì)算的平均方法相結(jié)合，所關(guān)心的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以在*好的情況下得到解決，以0.3納米的分辨率。
兩種方法CLEM
取決于所使用的EM樣品制劑的類型，并且取決于調(diào)頻的類型而進(jìn)行的，人們可以使用不同的CLEM方式。一種方法是進(jìn)行活細(xì)胞熒光成像制備樣品用于后續(xù)EM之前。這使得在FM和EM觀察狀態(tài)之間至少幾秒鐘一個(gè)典型的時(shí)間間隔，由于同時(shí)固定或固定化樣品損失的時(shí)間。因此，這種策略并不理想，研究快速移動(dòng)過程或信號非常精確的定位。第二種方法是，既發(fā)揮EM和FM在相同的樣品，一旦它已準(zhǔn)備EM。此過程提供高相關(guān)性的精度。這第二種方法可應(yīng)用于嵌入在特定的條件下樹脂樣品。它也可以適用于冷凍樣品 - 這是低溫CLEM。
挑戰(zhàn)和低溫CLEM要求
冷凍CLEM的特殊挑戰(zhàn)是必須保持樣品溫度低于-140℃的任何時(shí)候，以避免形成晶體的冰，并且該樣品不能暴露于濕度，以避免水的凝結(jié)。這些條件必須保持在所有階段，包括調(diào)頻中，并同時(shí)將所述樣品制備設(shè)備，熒光顯微鏡，及冷凍EM裝有TEM之間的樣品。
冷凍的CLEM需要配用特殊的冷凍階段在成像期間保持低樣品溫度熒光顯微鏡。在冷凍階段，必須將試樣的污染引起的環(huán)境濕度結(jié)霜*小化。一個(gè)理想的系統(tǒng)的光學(xué)性能應(yīng)使高分辨率成像靈敏度高，以允許高精度的相關(guān)性。
許多低溫階段和相關(guān)的工作流已經(jīng)開發(fā)了用于冷凍CLEM。這些包括反轉(zhuǎn)配置，其中所述顯微鏡物鏡從樣品通過載玻片分開，以及使用長工作距離的物鏡直立設(shè)置。我們利用一個(gè)堂堂正正的顯微鏡配置和冷卻的物鏡面前，讓我們的冷凍FM設(shè)置采用高NA物鏡，用短的工作距離，同時(shí)保持陶瓷成功冷凍CLEM標(biāo)本。
工作與我們原來的設(shè)置，在描述提供了經(jīng)驗(yàn)促成了徠卡EM冷凍CLEM解決方案（圖1）的開發(fā)。這種解決方案使得能夠以更可靠的和直觀的方式進(jìn)行冷凍CLEM。
圖1：徠卡EM低溫CLEM系統(tǒng)。
為什么冷凍CLEM這樣有用嗎？
冷凍CLEM使我們能夠找出感興趣的生物對象（這可能是動(dòng)態(tài)的，罕見的，或以其它方式難以找到），根據(jù)它們的熒光信號。 然后，我們可以找到非常相同的對象，將獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，在上下文中，通過冷凍EM（圖2）。 在許多情況下，這樣的信息不能以任何其他方式來獲得。
圖2：A）低溫FM一個(gè)GFP標(biāo)記噬菌體的圖像（圓圈白色）。 標(biāo)記為黃色多色信號從熒光微球起源。B）的樣品的相同部分的低溫EM概覽圖像。標(biāo)記A中的微球再次標(biāo)記為黃色。它們的位置用于定位所述熒光噬菌體的坐標(biāo)中的冷凍的EM圖像。 C）高倍率冷凍EM圖像的識別坐標(biāo)。 圓圈指示信號，其內(nèi)的噬菌體被看見的預(yù)測起源。