徠卡顯微鏡熒光和量子點的基本原理和歷史

我們?nèi)绾味x“熒光”？

在任何搜索引擎中鍵入“熒光的定義”這個短語，你會得到如下的短語或者非常相似的東西;

“由于X射線或紫外線等波長較短的入射輻射，某些物質發(fā)出的可見或不可見輻射?！?/span>

這個定義如何與熒光顯微鏡相關（圖1）“較短波長的入射輻射？”僅僅是用來“激發(fā)”樣本中的熒光團的光源。這種光可以包括可見光譜，紫外線（UV）和紅外線（IR），顯微鏡中的光源可以從汞燈或氙弧燈到激光器。所述的熒光團（“某些物質”在上述的定義）是具有特殊性能，由此它們可以由具有較低波長的光激發(fā)后再發(fā)射更高波長的光/光子的化學化合物。

圖1：通過熒光顯微鏡觀察熒光標記的細胞。

波長的基本單位是儀表，“波長”定義為光波的兩個連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長的符號是希臘字母lambda（l）。在顯微鏡中通常使用的波長在400-700nm之間的可見光譜范圍內(nèi)的納米（nm）范圍內(nèi)，在400nm以下的UV光譜和在700nm開始的IR光譜（圖2）。

熒光團按其激發(fā)和發(fā)射波長分類，通常以顯示最大峰值的圖形的形式存在。熒光基團在所謂的“基態(tài)”中是天然穩(wěn)定的。當它們吸收光子（來自“較短波長”的光）時，光子的能量將熒光團的電子升高到更高能量的“激發(fā)”狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會保持這種狀態(tài)，而是在返回到基態(tài)時失去振動能量并發(fā)射更長波長的光子。對于顯微鏡中使用的熒光團，從激發(fā)到返回到地的一個完整周期占據(jù)0.5到20納秒的區(qū)域。

熒光團激發(fā)和發(fā)射波長通?？s寫為帶有下標“ex”（激發(fā)）或“em”（發(fā)射; l_ex或l_em）的希臘字母λ 。

每個熒光團都具有不同的最大激發(fā)和發(fā)射光譜，并且該屬性用于區(qū)分相同樣本中的不同物鏡。例如，使用熒光染料DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）來突出細胞中的核蛋白以及熒光標記的鬼筆環(huán)肽以突出顯示肌動蛋白細胞骨架。

熒光的Jablonski圖

波蘭物理學家亞歷山大·賈布朗斯基教授（Aleksander Jablonski，1898-1980年）是第一個用三級能量圖來描述地面/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán)的方法，簡稱為“雅布倫斯基圖”。1930年，他在華沙大學獲得博士學位，主題為“論激發(fā)光波長變化對熒光光譜的影響”。1933年，他發(fā)表了他的論文（“染料中的反斯托克斯熒光的效率”），其中包含了Jablonski圖。熒光團行為的這種簡單而有效的說明突出顯示了從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)以及隨著更長波長的光子的發(fā)射而回到地面（圖3）。

圖3：熒光Jablonski圖。熒光團可以吸收光子。光子的能量將熒光團的電子升高到更高能量的“激發(fā)”狀態(tài)。隨后，被激發(fā)的電子在返回到基態(tài)時失去振動能量并發(fā)射更長波長的光子。

雖然圖3是一個簡化的Jablonski圖，但應該指出，熒光團可以存在于許多不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外，取決于分子的電子自旋，熒光團可以經(jīng)由稱為“ 三重態(tài) ”的不同放松狀態(tài)返回到地面。

斯托克斯位移

喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（George Gabriel Stokes，1819-1903）是愛爾蘭的數(shù)學家和物理學家，在他一生中，他在光學和光學領域取得了許多發(fā)現(xiàn)和進展。他于1849年被任命為劍橋彭布羅克學院的盧卡遜數(shù)學教授，直到1903年去世。他寫了一篇精美的描述性文章，于1852年出版，名為“關于光的可變性的變化”。本文中使用的語言不同于我們在現(xiàn)代科學文獻中使用的語言。以下是斯托克斯使用的精彩語言的兩個簡短摘錄。

“到了去年秋天，當季節(jié)的晚些時候提供了很少的觀察的機會，我從不同的來源得知，那種已經(jīng)被提及的具有如此高程度的內(nèi)部分散性的黃色玻璃是用鈾的氧化物著色“。

和：

“看到管子一下子變成了無形的光芒，它真的是一個奇怪的景象：它實際上是黑暗可見的，總而言之，這種現(xiàn)象有一種神秘的外觀。

“斯托克斯位移”后來被命名為他的榮譽。當激發(fā)的電子返回到基態(tài)并發(fā)射光子時，波長總是比用于激發(fā)熒光團的波長更長。這是由于波長與輻射能量成反比的光的特性。斯托克斯位移描述峰值激發(fā)和熒光團的峰值發(fā)射波長（圖4）之間的差值（單位為納米）。 

隨著斯托克斯位移的增加，區(qū)分熒光團的激發(fā)和發(fā)射成比例地更容易。熒光團在斯托克斯位移方面具有獨特的特征，這是由于它們的電子構型和分子結構。

綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和使用

斯托克斯首先用“熒光”這個詞來形容他所觀察到的現(xiàn)象，但是這個歷史可以追溯到1565年。西班牙的一位醫(yī)生和植物學家尼古拉斯·蒙那德（Nicolas Monardes）描述了一種奇怪的藍色，腎臟。盡管有這些早期的觀察，但是在400年后的今天，一種綠色熒光物質被報道在一個活的有機體中。在1955年Davenport和尼科爾發(fā)表的一篇論文  描述水母稱為類的子類的嗜酸性粒細胞的組織上相水螅。當時，這項工作的作者并沒有意識到嗜酸性粒細胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。

直到1962年，小森下村（* 1928）發(fā)表了一篇文章 ，其中相關成分被認為是一種蛋白質。與他在普林斯頓大學的教授（Frank Johnson）一起，他們從生物發(fā)光水母Aequorea victoria收集樣品。他們有獨特的方法從熒光蛋白中分離熒光蛋白，即通過棉布袋擠壓孤立的生物發(fā)光組織，產(chǎn)生下村被稱為“擠壓”的溶液。

1994年，哥倫比亞大學的Martin Chalfie（* 1947）教授編寫了一篇論文，證明編碼GFP的基因可以在原核和真核細胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元）中功能性表達。該論文指出：“因為這種熒光不需要外源底物和輔因子，所以GFP的表達可以用來監(jiān)測活體中的基因表達和蛋白定位。正是這一出版物為廣泛使用GFP在生物學研究上鋪平了道路。

圖5：C.elegans，GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達

一年之后，圣地亞哥Califronia大學的Roger Tsien教授（1952-2016）（曾研究野生型GFP的突變體）在自然界的科學通信中發(fā)表了他的研究成果。Tsien及其同事選擇了這種單點突變（S65T）的發(fā)現(xiàn)，因為它具有最長的激發(fā)和發(fā)射波長（490/510nm），使其更具光穩(wěn)定性，并導致眾所周知的GFP激發(fā)/發(fā)射峰。

2008年，Shimomura，Tsien和Chalfie共同獲得諾貝爾化學獎，他們的角色和發(fā)現(xiàn)GFP。當Shimomura做了他的諾貝爾演講時，他說：“當我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團時，我認為我已經(jīng)盡了我所能做的所有GFP，并決定終止我在GFP上的工作，以便集中精力去研究生物發(fā)光”。他繼續(xù)承認：“綠色熒光蛋白是一種美麗的蛋白質，但在發(fā)現(xiàn)后的30年內(nèi)，它仍然沒有用。”

自從Tsien的發(fā)現(xiàn)以來，他的實驗室設計了許多GFP變體，覆蓋了很多可見光譜，并且確實革新了光學顯微鏡和成像領域。由于這樣的基因工程，GFP的顏色范圍從藍色部分（EBFP; 380/460 nm）到黃色部分（YFP; 514/527 nm）。 

探針

與成像領域一樣，熒光團可以用作“記者”來研究細胞和生物體中的基因表達。酶螢光素酶以及編碼GFP的基因是通常用于檢查特定基因是否由細胞表達的那些。用遺傳修飾的病毒DNA或在靶基因表達時發(fā)熒光的質粒轉染生物體或細胞。細胞內(nèi)的感興趣的細胞器或部位可以在轉染的細胞中可視化和檢查。

用熒光團標記（或“標記”）的抗體通常稱為“ 熒光探針 ”。在廣泛使用GFP和發(fā)現(xiàn)之后的其他熒光團之前，兩種最常用的標記抗體的熒光團是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（四甲基羅丹明異硫氰酸酯）。盡管FITC和TRITC仍在使用，但是在這一領域已經(jīng)取得了重大進展，熒光團和探針的選擇至少是非常廣泛的。

當然，實驗室中使用最廣泛的熒光團之一是“Alexa Fluor”染料?？捎玫腁lexa Fluor染料的當前范圍跨越可見光譜范圍從346到784 nm的激發(fā)波長。 

量子點

量子點（或“Qdots”）是1981年由俄羅斯科學家阿列克謝·?；颍ˋlexey Ekimov）在玻璃矩陣中首次發(fā)現(xiàn)的，同時在圣彼得堡的瓦維洛夫州立光學研究所（Vavilov State Optical Institute）工作。然而，量子點的第一個膠體溶液是由位于新澤西州AT＆T貝爾實驗室從事半導體工作的Louis Brus發(fā)現(xiàn)的。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學化學教授。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中，Brus描述Qdots為“小型半導體微晶”。

量子點表現(xiàn)出獨特的方式 - 盡管它們含有少至100到100000個原子，但它們表現(xiàn)出的性質好像是由單個原子組成的。但是，它們確實符合熒光團的性質，從而它們能夠吸收光能，在返回基態(tài)時被激發(fā)并釋放出光子的光子。但是它們發(fā)射的光的波長取決于Q點的尺寸，Q點越小，發(fā)射波長越短。這個性質是由于更小的Qdots具有更大的“最小帶隙”。這是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量的量。由于較小的量子點需要更多能量用于激發(fā)，所以隨后發(fā)射更低波長的光（波長與激發(fā)能量成反比）。

幾乎是20年后的2002年，Qdots成為加利福尼亞Quantum Dot Corporation的生命科學研究人員的商業(yè)化產(chǎn)品。

量子點是用于熒光應用的非常明亮和穩(wěn)定的工具。研究表明，量子點比傳統(tǒng)熒光團亮幾個數(shù)量級，盡管與有機染料相比，它們的亮度有一些變化。在光穩(wěn)定性方面，量子點報道比傳統(tǒng)熒光團穩(wěn)定多達100倍，在一次體內(nèi)成像研究中，它們?nèi)员３譄晒忾L達四個月。

在常規(guī)熒光探針中，一個或多個熒光團可以連接到單個感興趣的抗體。然而，由于Qdots的表面積非常大，許多分子和抗體可以附著到單個點上，這可能具有許多優(yōu)點，包括熒光信號放大。量子點的使用也提供了多重檢測的優(yōu)勢，在多重檢測中可以同時對多種波長進行成像。在這樣的測定中，唯一的變量是由研究人員選擇的Qdot的大?。ㄒ约耙虼说陌l(fā)射波長）?？梢允褂冒坠馔瑫r進行大量Q點的激發(fā)，否則會使用多個激光器并進行許多調整以形成最終圖像。