徠卡顯微鏡入射光熒光顯微鏡里程碑

2020-09-03 14:11:58

落射熒光顯微鏡

約翰·塞巴斯蒂安·普洛姆1927年出生在薩瓦倫托（蘇門答臘），是一名荷蘭煤礦工程師的兒子。在幼年時期，他和父母一起回到了荷蘭，在那里他創(chuàng)作了繪畫作為他的激情之一。高中畢業(yè)后，他發(fā)現(xiàn)了另一個迷人的色彩領(lǐng)域，我們將在稍后學習。普洛姆決定學習醫(yī)學，并在烏得勒支，哈佛和阿姆斯特丹接受教育。之后他在邁阿密和阿姆斯特丹大學工作，之后被提升為荷蘭萊頓醫(yī)學院的教授。

在他的研究活動中，他發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡是一個**的工具。在20世紀60年代，特殊類型的標本照明開始流行起來，事實上，早在1925年，Policard和Paillot就已經(jīng)知道了這種照明，他們對絲蟲的自發(fā)熒光事件感興趣（Policard and Paillot，1925）。一些研究人員重新啟動了兩名法國科學家的項目，將熒光照明和樣品檢測放在顯微鏡的同一側(cè)。這種使用入射光的原理被稱為“落射照明”“與透射顯微鏡相反。使用這種技術(shù)用于熒光顯微鏡的一大優(yōu)點是避免檢測由光源傳送的發(fā)射光（圖1）。另一個好處是具有更多的機械特性：在透射照明中，聚光鏡和物鏡有兩個分開的光軸，必須仔細對準。在落射照明中，物鏡是：聚光鏡和光收集物鏡。像這樣，可以避免對齊問題。



圖1：熒光顯微鏡中epi-照明的好處：在透射照明（左）的情況下，光源和圖像檢測位于目標的相反側(cè)。 使用這種設置，一個明顯的限制是激發(fā)光（淺藍色）的不必要的檢測。 相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用照明目標以及圖像檢測。 對于熒光顯微鏡來說，這意味著用戶不會暴露于激發(fā)光。

圖1：熒光顯微鏡中epi-照明的好處：在透射照明（左）的情況下，光源和圖像檢測位于目標的相反側(cè)。使用這種設置，一個明顯的限制是激發(fā)光（淺藍色）的不必要的檢測。相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用照明目標以及圖像檢測。對于熒光顯微鏡來說，這意味著用戶不會暴露于激發(fā)光。



分色光束分光鏡

幾年前蘇聯(lián)的兩位研究人員已經(jīng)提供了熒光落射照明顯微鏡的一個非常重要的輸入。Brumberg和Krylova開發(fā)了一種用于入射光紫外激發(fā)的所謂二色分光鏡（Brumberg and Krylova，1952）。二色性材料能夠讓某一波長范圍的光線通過，而其他波長的光線則被反射（圖2）。 

這個原理對于熒光落射照明是不可或缺的，因為激發(fā)光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中（圖3）。更確切地說，二向色分束器對于來自光源的期望的激發(fā)光的波長是不可穿透的并且將激發(fā)光反射到樣本。來自樣本的熒光又可以將二向色分束器傳送到檢測側(cè)。



圖2：透射圖說明了二向色分束器的功能。 反射較短波長的光（藍色箭頭），較長波長的光（紅色箭頭）可以通過濾波器。

圖2：透射圖說明了二向色分束器的功能。反射較短波長的光（藍色箭頭），較長波長的光（紅色箭頭）可以通過濾波器。

圖3：熒光落射照明需要能夠?qū)⒓ぐl(fā)光（藍色）反射到樣品并將發(fā)射光（綠色）傳遞到檢測側(cè)的分色鏡（灰色）。 激發(fā)光的波長可以用相應的濾光片（橙色）預選。 面向檢測側(cè)（紫色）的過濾器專門使熒光團的波長通過，并排除來自激發(fā)的剩余雜散光。

圖3：熒光落射照明需要能夠?qū)⒓ぐl(fā)光（藍色）反射到樣品并將發(fā)射光（綠色）傳遞到檢測側(cè)的分色鏡（灰色）。激發(fā)光的波長可以用相應的濾光片（橙色）預選。面向檢測側(cè)（紫色）的過濾器專門使熒光團的波長通過，并排除來自激發(fā)的剩余雜散光。



不幸的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，普洛姆不知道俄羅斯的發(fā)展。盡管如此，他自己也開始使用二色分光鏡。在Ploem的特殊情況下，他和著名的特種玻璃Schott（美因茨）生產(chǎn)商一起開發(fā)了一種分光鏡，它反映了藍光和綠光（Ploem，1965）。之后，他用Leitz公司提供的中性分束器修改了一個“Opak”落射照明器，通過引入一個帶有四個不同二向色分束器的滑塊，他可以實現(xiàn)紫外，紫光，藍色和綠色（Ploem，1967）（圖4）。



圖4：帶有四個分色器的熒光多波長落射照明器，安裝在滑塊上，用于紫外，紫色，藍色和綠色激發(fā)光的入射照明。 修建在阿姆斯特丹大學（1965年，Ploem）。

圖4：帶有四個分色器的熒光多波長落射照明器，安裝在滑塊上，用于紫外，紫色，藍色和綠色激發(fā)光的入射照明。修建在阿姆斯特丹大學（1965年，Ploem）。



熒光濾光激發(fā)塊

二向色分束器的發(fā)展以產(chǎn)生具有離散波長的激發(fā)光具有重要的優(yōu)點。紫外光譜（?100nm?380nm）的激發(fā)在當時是非常普遍的，但具有惱人的副作用：自發(fā)熒光。許多組織物質(zhì)被紫外光激發(fā)，導致微弱的背景發(fā)光（圖5）。通過將分色鏡的反射波長擬合到綠色或藍色范圍，Ploem能夠達到在那些時間非常普遍使用的兩種熒光染料FITC（494nm ）和TRITC（541nm）的激發(fā)*大值，而沒有產(chǎn)生自發(fā)熒光。FITC（熒光素異硫氰酸酯）和TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6） - 異硫氰酸酯）可以與抗體偶聯(lián)，并仍然用于免疫熒光顯微術(shù)。通過在很小的范圍內(nèi)激發(fā)它們的*大值，組織標本的對比度顯著增強（圖5）。用Ploem的二向色分光鏡產(chǎn)生的激發(fā)光束如此有效地擬合到FITC的激發(fā)*大值，甚至可以使用具有相當差的發(fā)射光譜的光源。



圖5：左側(cè)：用寬帶UV激發(fā)照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。 注意藍色自體熒光的組織結(jié)構(gòu)。 右：使用窄帶藍（490nm）光照射epi照射的FITC標簽具有相同的組織和相同的免疫染色。 注意增加的圖像對比度（Ploem，1967）。

圖5：左側(cè)：用寬帶UV激發(fā)照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。注意藍色自體熒光的組織結(jié)構(gòu)。右：使用窄帶藍色（490nm）光照射epi照明的FITC標簽具有相同的組織和相同的免疫染色。注意增加的圖像對比度（Ploem，1967）。



考慮到這些事實，現(xiàn)在有可能通過應用藍色和綠色的窄帶激發(fā)，利用普通高壓汞弧燈供電，利用落射照明的優(yōu)點。這種增強滿足了即將到來的生命科學和醫(yī)學熒光顯微鏡的需求。 

Leitz出于應用Ploem的發(fā)明，設計了一種新型的多波長熒光落射照明裝置，配有四個旋轉(zhuǎn)的二向色分光鏡，可以在紫外線，紫色，藍色和綠色的光線范圍內(nèi)激發(fā)樣品：Leitz PLOEMOPAK。

Leitz員工W. Kraft完成了進一步的成就，他將一個二向色分束器與適當?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射過濾器結(jié)合在一個工件中，即所謂的過濾器立方體或激發(fā)塊（Kraft，1969 und Kraft，1972） 6）。他的調(diào)查結(jié)果是設計了一個落射照明器，其中有幾套這樣的濾光片立方體，它們?nèi)匀皇钱斀袼卸嗖ㄩL熒光顯微鏡的基礎(chǔ)。



圖6：左圖：Leitz員工W. Kraft于1970年左右將激發(fā)濾光片（橙色），二向色分光鏡（灰色）和發(fā)射濾光片（紫色）放在一個工件 - 濾光片立方體中。 中間：過濾器立方體的工程圖。 右圖：在現(xiàn)代顯微鏡下，熒光濾光片立方體可以輕松地進出。 研究人員甚至可以根據(jù)自己的需要，用不同的濾光片和二向色分光鏡來修改立方體。

圖6：左圖：Leitz員工W. Kraft于1970年左右將激發(fā)濾光片（橙色），二向色分光鏡（灰色）和發(fā)射濾光片（紫色）放在一個工件 - 濾光片立方體中。中間：過濾器立方體的工程圖。右圖：在現(xiàn)代顯微鏡下，熒光濾光片立方體可以輕松地進出。研究人員甚至可以根據(jù)自己的需要，用不同的濾光片和二向色分光鏡來修改立方體。



概要

憑借Ploem及其同時代人和接班人共同構(gòu)建的技術(shù)基礎(chǔ)，我們今天享受到通過將足夠的濾光片放入落射照明器中觀看無數(shù)不同熒光團的特權(quán)（圖7）。研究人員甚至可以建立自己的立方體，根據(jù)需要定制激發(fā)和發(fā)射參數(shù)。

由于現(xiàn)代研究顯微鏡的自動化，在實驗過程中切換濾光片立方體不過是點擊一個按鈕?？茖W家們可以在不同熒光基團之間切換，因此甚至可以觀察到不同基因表達熒光標記的活標本。


圖7：熒光顯微鏡的演變。 左：透射光的熒光顯微鏡的基本問題是激發(fā)光的檢測。 中間：這就是為什么人們利用落射照明將光源移動到顯微鏡的檢測側(cè)。 這種方法需要一個二向色分束器。 右圖：將激發(fā)濾光片，發(fā)射濾光片和二向色分光鏡組合成一個區(qū)塊便于快速切換專用于某些熒光團的不同區(qū)塊。

圖7：熒光顯微鏡的演變。左：透射光的熒光顯微鏡的基本問題是激發(fā)光的檢測。中間：這就是為什么人們利用落射照明將光源移動到顯微鏡的檢測側(cè)。這種方法需要一個二向色分束器。右圖：將激發(fā)濾光片，發(fā)射濾光片和二向色分光鏡組合成一個區(qū)塊便于快速切換專用于某些熒光團的不同區(qū)塊。