尼康顯微鏡平衡電弧放電光源激發(fā)照明
本教程以初始化出現(xiàn)在樣品圖像窗口中隨機(jī)選擇雙重或三重?zé)晒鈽?biāo)記的樣本圖像。臨近這個窗口是一個頻譜圖題為激發(fā)通帶光譜圖，其中顯示了用于染色的標(biāo)本以及在照明光圈激勵均衡濾波器組合的近似傳輸率（白線）的熒光團(tuán)的吸收光譜（見激發(fā)平衡器圖）在可見光譜區(qū)。在熒光探針和它們的目標(biāo)被確定為每個試樣中的教程窗口的左下部旁邊的一個彩色條，與在該激發(fā)通帶曲線的激發(fā)光譜曲線的顏色相一致。圖表上的個別光譜曲線可被打開或關(guān)閉使用適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)的復(fù)選框。新的標(biāo)本可以被加載到使用選擇的樣本下拉菜單教程。
為了操作的教程，使用光圈位置滑塊轉(zhuǎn)移激發(fā)平衡器（在激發(fā)平衡器說明在本教程的右下角部分圖）的長通和shortpass地區(qū)之間的顯微鏡光圈。當(dāng)滑塊被轉(zhuǎn)換為*左邊的孔移動到平衡器與激發(fā)通帶變化的shortpass區(qū)域類似于一個shortpass過濾器的信息。檢體的圖像也變化，以反映熒光強(qiáng)度的來自具有在較長波長區(qū)域發(fā)射光譜探針的損失。移動滑塊到*右邊移動光圈到長通區(qū)域，并產(chǎn)生了激發(fā)通帶圖形和標(biāo)本圖像的相應(yīng)變化。在這兩個極端之間的是混合區(qū)域的激發(fā)通帶類似的兩個截止濾光片的混合（如做標(biāo)本的圖像）。
尼康顯微鏡Eclipse i系列熒光照明器勵磁平衡系統(tǒng)使顯微鏡使用具有雙重或三重激發(fā)濾光片組合的光塊時微調(diào)激發(fā)波長頻帶的照明光圈*大的效率。此功能是有用的，以在包含多個探針，例如，減少從一個探針的熒光發(fā)射，同時增加以優(yōu)化觀測和數(shù)字圖像的記錄的另一個的強(qiáng)度試樣調(diào)整單個熒光強(qiáng)度。標(biāo)本染色，具有兩個或更多的熒光團(tuán)通常表現(xiàn)出不相等的熒光發(fā)射強(qiáng)度值，由于多種因素，其中包括不相等的量子產(chǎn)率，overstaining或understaining，膜的滲透性不足，阻擋差，定影劑掩蔽的抗體結(jié)合位點(diǎn)，低固有抗原的濃度，并簡單的熒光團(tuán)和第二抗體混合的錯誤。激發(fā)平衡器可以幫助減輕這些標(biāo)本的熒光信號的不平衡。
尼康激發(fā)平衡器由一個包含兩個薄膜干涉涂層的作用，可以是長通或shortpass過濾器（或兩者的混合物），這取決于在該光具組的窗口的位置的長方形狀的光學(xué)玻璃窗口，如圖教程和圖1中的矩形過濾器被安裝在位于相鄰的顯微鏡照明孔徑光闌，它被包含在一個可移動的殼體，插入到顯微鏡落射熒光照明器（稱為數(shù)字成像頭在尼康的滑塊Eclipse的i系列顯微鏡）的視場光闌的光學(xué)路徑的前面。的光通過激發(fā)平衡器和激發(fā)照明的數(shù)值孔徑的量可以通過調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小來控制。當(dāng)觀察overstained標(biāo)本，過度熒光發(fā)射通?？梢允褂迷谂c中性密度濾光片組合和由收縮孔徑光圈大小的激發(fā)平衡器降低。
如圖1中所示是長通（黃色曲線）和shortpass（紫色曲線）激發(fā)平衡器濾光片的光譜曲線，連同三個熒光團(tuán)（DAPI，F(xiàn)ITC和德克薩斯紅）相匹配的濾波器的特性的歸一化吸收光譜組合。在實踐中，尼康激勵均衡濾波器組合滑塊是由拉或推的幀處理，從而暴露的激發(fā)光不同的楔形截止濾光片的混合物被翻譯過的照明光圈。當(dāng)滑塊定位，使得該照明光圈與激發(fā)平衡器（紫色曲線下面積）的shortpass部重合，僅通過來自照明用下面520納米的區(qū)域的吸收光譜曲線熒光團(tuán)會被激發(fā)到一個顯著度電弧放電燈。當(dāng)滑塊移動到激發(fā)平衡器窗口的相對端，所述長通的薄膜過濾器部（黃色曲線下的面積）是由孔徑照射，以激發(fā)具有波長大于430納米的熒光探針。需要注意的是熒光團(tuán)，如FITC和Alexa Fluor488，具有在藍(lán)色光譜區(qū)（450-500納米）的激發(fā)帶被激發(fā)以高度的效率，無論激磁平衡器位置的。
當(dāng)在顯微鏡的照明孔徑被定位在包含兩個長通和shortpass過濾器的部分“混合”的區(qū)域中，激發(fā)效率而變化為具有在紫外吸收帶和可見光譜的黃綠色區(qū)域的熒光團(tuán)。如在該照明光圈前面的拉頭的一部分由含有專門的shortpass干涉濾光器成含有兩個濾波器的比例相等的區(qū)域的區(qū)域被翻譯的，吸收紫外線的熒光團(tuán)的吸收效率為約100％至50％持續(xù)下降。同時，吸收綠光的熒光團(tuán)的吸收效率穩(wěn)步增加，從零到50％，而該吸收藍(lán)光的熒光基團(tuán)保持不變。當(dāng)滑塊運(yùn)動持續(xù)到含有較大的長通濾波器的比例地區(qū)出現(xiàn)了相反的效果。在這種情況下，吸收紫外線的熒光團(tuán)的吸收效率下降，從50％到零的吸收綠光的熒光基團(tuán)的增加，從50％的效率為100％。再次，激發(fā)在藍(lán)色區(qū)域的熒光團(tuán)的吸收效率保持恒定。
各種常見的熒光團(tuán)，包括Alexa的熒光染料，酞菁染料（在CYX系列），BODIPYs，熒光蛋白，MitoTrackers，SYTOX核酸污漬和許多傳統(tǒng)的合成和天然探頭可以組合使用的激勵與均衡在雙迎刃而解或三重激發(fā)濾片集。例如，在一系列的圖像，如圖2中說明沾上的Alexa Fluor405（微管），SYTOX綠色（核）和德克薩斯紅（絲狀肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)）瑞士白化小鼠胚胎細(xì)胞單層培養(yǎng)和成像用DAPI -FITC得克薩斯紅三重過濾組合使用激勵平衡器。在圖2（a）中，激發(fā)平衡器滑塊位于與shortpass薄膜濾波區(qū)域中的照射孔徑的前面，以優(yōu)先激發(fā)的紫光和藍(lán)光的熒光團(tuán)（的Alexa Fluor405和SYTOX綠）。平移滑塊進(jìn)入激發(fā)平衡器（含有兩個濾波器的比例相等）的中心區(qū)域產(chǎn)生含有來自所有3的熒光（圖2（b））的圖像。*后，移動滑塊到含有長通濾光片的區(qū)域（圖2（c））的消除了紫色熒光團(tuán)，得到由熒光團(tuán)（SYTOX綠和德克薩斯紅）興奮的可見光的藍(lán)色和黃綠色區(qū)域產(chǎn)生的圖像光譜。代替DAPI-FITC-德克薩斯紅三重激發(fā)帶濾波器組合與一種設(shè)計用于DAPI，F(xiàn)ITC和TRITC會產(chǎn)生類似的結(jié)果，但對于具有吸收曲線從黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光優(yōu)化（TRITC與德克薩斯紅）的波長。
激發(fā)平衡器也非常適合分離含采用了時下流行的雙帶通濾波器的激勵組合，如DAPI-FITC，F(xiàn)ITC-TRITC和FITC標(biāo)記的得克薩斯紅兩種熒光探針樣品熒光發(fā)射。圖3示出幾個例子。圖3（a）是小鼠小腸沾上核探針的Hoechst33258（藍(lán)色熒光）和Alexa Fluor 488綴合到鬼筆環(huán)肽（綠色熒光）通過與的shortpass部分的雙過濾DAPI-FITC結(jié)合成像的薄組織切片在該照明光圈前面的激發(fā)平衡器來激發(fā)兩個熒光團(tuán)。平移激發(fā)平衡器入長通區(qū)域（圖3（b））的消除了紫外線吸收核染料（Hoechst的33258）。采用這種方式，激勵均衡器是用于控制在已經(jīng)overstained核標(biāo)本的熒光發(fā)射非常有用。
耦合到藍(lán)色和綠色的雙激發(fā)濾光片組合（FITC-TRITC和FITC-德克薩斯紅），激發(fā)平衡器可用來控制從樣品標(biāo)記有熒光團(tuán)的吸收在通過橙色波長范圍內(nèi)的綠色發(fā)光強(qiáng)度水平。示于圖3（c）是印度麂鹿沾上的Alexa Fluor555（橙色熒光）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對，和Alexa Fluor488的皮膚成纖維細(xì)胞中的貼壁單層培養(yǎng)的圖像共軛的山羊靶向抗過氧化物酶的抗小鼠抗體膜蛋白（PMP-70）的初級抗體。使用FITC-TRITC雙波段激發(fā)濾光片組合設(shè)置與激發(fā)平衡器定位成使得長通薄膜濾波區(qū)域與照明孔徑一致的圖像被捕獲。平移激發(fā)平衡器到shortpass區(qū)域（圖3（d））的減少（或消除）從吸收綠光的熒光團(tuán)（的Alexa Fluor555）的熒光發(fā)射。類似地，F(xiàn)ITC-德克薩斯紅濾波器產(chǎn)生類似的效果（圖3（e）和圖3（f））的。在后兩個幀中的檢體是標(biāo)記的Alexa Fluor594綴合的鬼筆環(huán)肽（肌動蛋白）和的Cy2偶聯(lián)的靶向小鼠抗-α-微管蛋白的一抗的二抗大鼠胸主動脈細(xì)胞培養(yǎng)物。