奧林巴斯顯微鏡三重染色貼壁細(xì)胞

2020-09-03 14:22:39

 活力和物理的貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)生長特性可以用一個受歡迎的熒光染色，包括一個染色的探針組合很容易確定（線粒體）隨著鬼筆環(huán)肽（或phallacidin）與低分子量的熒光探針的合成。在細(xì)胞的絲狀肌動蛋白細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)可視化的有用的熒光標(biāo)記中羅丹明，熒光，Alexa Fluor系列，與花青染料。對染使用流行的各種染料核如下處理與線粒體和肌動蛋白探針。此協(xié)議的細(xì)節(jié)的廣義程序染色各種細(xì)胞類型。

奧林巴斯顯微鏡

圖1給出了一個合并的共聚焦顯微鏡圖像堆棧（4光學(xué)部分）顯示細(xì)胞核，線粒體，和在一個正常的喜馬拉雅塔爾羊卵巢絲狀肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)（OV HJ1。線）的上皮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，詳述如下在生長培養(yǎng)基中用MitoTracker Red CMXRos染（紅色），其次是鬼筆環(huán)肽共軛的Alexa Fluor 488，它的目標(biāo)是聚合的肌動蛋白（綠色）。細(xì)胞核染色用Hoechst 33342。標(biāo)本成像與100X油浸物鏡（沒有變焦）使用*大的針孔直徑設(shè)置在奧林巴斯顯微鏡FluoView fv1000在405納米的紫激光二極管組合（Hoechst），488納米的氬離子激光器（Alexa Fluor 488），和一個543納米氦氖激光（染色）。圖像的灰度通道依次收集并隨后pseudocolored逼近的各探針的熒光發(fā)射光譜的顏色。雖然這種熒光結(jié)合產(chǎn)生有用的圖像，其他探針在紅外吸收（如Mitotracker有深紅色的633和操縱核染料）可以采用相同的成功。

試劑

  • 粒線體介質(zhì)

    -染色的染料是含有50微克的再結(jié)晶提供探針瓶。重建完成與二甲基亞砜（

    二甲基亞砜

    ）使*終濃度為1毫摩爾的。二甲基亞砜加入量取決于染料的分子量和如下。添加DMSO后，渦溶液徹底讓混合物坐在黑暗中室溫5分鐘。重復(fù)的渦流作用，然后離心樣品搬遷分散液滴到管底和稀適當(dāng)?shù)牡确衷嚇印?/trans>所有染色的染料，稀3微升至10毫升（300納摩爾終濃度）的生長介質(zhì)中進(jìn)行工作的解決方案。

    • MitoTracker Red CMXRos94微升DMSO每小瓶。

    • 粒線體橙CMTMRos117微升DMSO每小瓶。

    • Mitotracker有綠色FM74微升DMSO每小瓶。

    • 染色的紅58069微升DMSO每小瓶。

    • 粒線體的深紅色63392微升DMSO每小瓶。

  • 粒線體的洗滌介質(zhì)

    細(xì)胞是洗兩次完成介質(zhì)染色的治療后，需要6毫升沖洗介質(zhì)在攝氏37度每培養(yǎng)皿。

  • 固定劑

    準(zhǔn)備百分之3.7多聚甲醛溶解在完全生長的含血清培養(yǎng)基使用前。每個培養(yǎng)皿中大約需要3毫升的培養(yǎng)基。

  • 通透性緩沖

    百分之0.2的Triton X-100在PBSA（后立即使用30分鐘至一小時*聲洗滌緩沖）。

  • 洗滌緩沖液（通透后）

    -除了那些需要專門的緩沖區(qū)的所有步驟使用“核染料。

  • 封閉液

    百分之1牛血清蛋白（

    牛血清白蛋白

    ）在含有百分之0.05的Triton X-100 PBSA（增加2-3毫克疊氮化鈉每100毫升緩沖消除微生物的生長）。

  • 鬼筆環(huán)肽或phallacidin工作液

    熒光鬼筆毒肽被提供作為凍干固體含300單位產(chǎn)品。內(nèi)容必須溶解在1.5毫升的甲醇產(chǎn)量的*終濃度為每毫升200單位。一個單位的定義是必要的染色一蓋玻片固定細(xì)胞的量，相當(dāng)于5微升的甲醇溶液。通過稀釋原液適量為封閉緩沖液制備的鬼筆環(huán)肽或phallacidin工作稀釋。例如，50微升的溶液稀釋至1毫升與緩沖將使每使用100微升10蓋玻片蓋玻片染色。

  • 核染色

    制備的核染色新鮮稀釋前染色。

  • 核染色洗滌緩沖液

    -赫斯特和SYTOX染料需要漢克斯平衡鹽溶液（

    漢克斯BSS

    ），而DAPI，以及單體和二聚體菁核染色，可用于計(jì)算。

核染液稀釋

  • 赫斯特（33342和33258）

    稀釋在150毫升的漢克斯BSS 5微升10毫克/毫升原液（30分鐘治療）。

  • SYTOX綠色和橙色

    稀10微升的濃縮原液（二甲基亞砜5毫摩爾）在250毫升的漢克斯BSS（30分鐘治療）。

  • DAPI

    稀150毫升PBSA稀釋百分之50雙蒸餾水5微升10毫克/毫升原液（5分鐘治療）。

程序

注：染色處理對活細(xì)胞貼壁。從生長的細(xì)胞去除介質(zhì)和更換預(yù)熱（37攝氏度）含藥血清并在適當(dāng)濃度的粒線體探針介質(zhì)（約350-400納摩爾）。培養(yǎng)細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱45到60分鐘。

從培養(yǎng)皿的粒線體中吸出，加入3毫升的預(yù)熱（37攝氏度）每60毫米培養(yǎng)皿中。將清洗介質(zhì)在37度5分鐘允許未綁定的粒線體擴(kuò)散到介質(zhì)。重復(fù)此過程，一旦固定前。

固定細(xì)胞貼壁快吸*后介質(zhì)清洗和預(yù)加百分之3.7多聚甲醛熱（37度）的完全培養(yǎng)基，包括血清。使細(xì)胞孵育15分鐘，在固定器在37攝氏度。

固定后，用洗滌液洗三PBSA變化的細(xì)胞（2至5分鐘洗）。慢慢旋轉(zhuǎn)含有蓋玻片培養(yǎng)皿作為他們被洗滌在軌道搖床轉(zhuǎn)速每分鐘5-10。

溶解的貼壁細(xì)胞膜具有10至15分鐘的緩沖處理法。慢慢旋轉(zhuǎn)含有蓋玻片培養(yǎng)皿所透在軌道搖床轉(zhuǎn)速每分鐘5-10。

通透后，隨著PBSA Triton洗滌液洗滌細(xì)胞三的變化（每5分鐘洗）。慢慢旋轉(zhuǎn)含有蓋玻片培養(yǎng)皿作為他們被洗滌在軌道搖床轉(zhuǎn)速每分鐘5-10。

塊非特異性鬼筆環(huán)肽（或phallacidin）阻斷1小時的緩沖區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。慢慢旋轉(zhuǎn)含有蓋玻片培養(yǎng)皿都被封鎖在軌道搖床轉(zhuǎn)速每分鐘5-10。

蓋玻片染色的支持

準(zhǔn)備染色的鬼筆環(huán)肽支持覆蓋2×3英寸的顯微鏡載玻片和封口膜，如圖2所示。確保封口膜使其緊密附著并沿玻璃表面的均勻分布（無水泡）。阻斷后，小心地取出蓋玻片從培養(yǎng)皿放細(xì)胞側(cè)下阻斷沉積在膜緩沖稀釋的鬼筆環(huán)肽100微升滴蓋滑。在3和6上可以放置在一個單一的幻燈片。下一步，將幻燈片在濕度室用鋁箔覆蓋保護(hù)熒光光（見圖3）。將蓋幻燈片在濕度室30分鐘在室溫。

鬼筆環(huán)肽治療后，彩色蓋玻片返回他們各自的Petri菜洗三次PBSA Triton洗滌緩沖液（每5分鐘洗）。蓋上皿蓋用鋁箔或鋁烤盤（防止光）和緩慢旋轉(zhuǎn)的細(xì)胞，他們被洗滌在軌道搖床轉(zhuǎn)速每分鐘5-10。

DAPI和菁核counterstains，加入稀釋的染料在PBSA到培養(yǎng)皿和治療的貼壁細(xì)胞的推薦時間：5-10分鐘DAPI；15-30分鐘菁染料（保護(hù)鋁箔光）。當(dāng)使用Hoechst或SYTOX污漬（30分鐘的孵育），先洗細(xì)胞漢克斯平衡鹽溶液三緩沖交流之前，復(fù)染。

濕度室結(jié)構(gòu)

與PBSA或漢克斯平衡鹽溶液洗滌染色細(xì)胞（取決于核染料）三次，每5分鐘洗。從保護(hù)鋁箔光。徹底清洗在這個階段要刪除所有的痕跡，未結(jié)合的鬼筆環(huán)肽是必要的（或phallacidin）。

為了去除多余的鹽分，洗滌細(xì)胞三次，2～3分鐘（每洗）在蒸餾水。請注意，這一步是必要的如果蓋玻片被風(fēng)干過夜之前安裝。

*后的蒸餾水洗滌步驟之后，小心地取出蓋玻片用鑷子從培養(yǎng)皿，擦去多余的水從背面和邊。精益的蓋玻片上培養(yǎng)皿蓋兩側(cè)對標(biāo)記，讓他們干通宵。保護(hù)干燥蓋玻片與鋁烤盤的光。干燥后，將蓋玻片（細(xì)胞的一面朝下）在干凈的載玻片使用適當(dāng)?shù)陌惭b介質(zhì)。