徠卡顯微鏡冷凍斷裂和腐蝕簡(jiǎn)介
冷凍斷裂描述了技術(shù)打破了冷凍標(biāo)本展示內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 冷凍蝕刻表面冰的升華在真空下揭示破碎的臉,原本隱藏的細(xì)節(jié)。 金屬/碳混合使樣品在掃描電鏡成像(block-face)或TEM(復(fù)制品)。 它是用來(lái)調(diào)查例如細(xì)胞細(xì)胞器,膜層和乳劑。 生物應(yīng)用技術(shù)是傳統(tǒng),但開始在物理學(xué)和材料科學(xué)發(fā)展的意義。 最近,凍結(jié)骨折電子顯微鏡,特別是凍結(jié)immunolabelling復(fù)制品(FRIL),提供了新的見(jiàn)解的角色動(dòng)態(tài)膜蛋白的細(xì)胞過(guò)程。
圖1:在小麥蚜蟲離開
適合環(huán)境的電子顯微鏡
電子顯微鏡的室轉(zhuǎn)移到一個(gè)非常低的壓力。 活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)放在這個(gè)環(huán)境不能保留由于極其快速蒸發(fā)的水使大多數(shù)細(xì)胞的一部分。
有許多生物樣品的可能性做準(zhǔn)備。 材料可以保存(固定),隨后脫水產(chǎn)生最小破壞體內(nèi)的結(jié)構(gòu),可以用環(huán)境掃描電鏡或水可以凍結(jié)。 高壓冷凍是唯一的方法觀察水化結(jié)構(gòu)在自然狀態(tài)。 冰由高壓冷凍不是六角冰,這顯示了一個(gè)增加體積的水冰但無(wú)定形冰,體積保持不變。 因此結(jié)構(gòu)敏感的滲透和溫度變化是保存(請(qǐng)參閱文章“ 簡(jiǎn)要介紹高壓凍結(jié)”)。
觀察結(jié)構(gòu)如細(xì)胞細(xì)胞器膜,液體乳劑或表面接口,凍結(jié)骨折是唯一的方式。 冷凍樣品壞了武力的刀(或類似)或釋放彈簧負(fù)載和阻力最小的路線。
圖2:凍結(jié)骨折
升華和凝結(jié)的水——凍結(jié)腐蝕和污染
揭示斷裂表面的細(xì)節(jié),冰已經(jīng)被刪除。 這需要通過(guò)升華冰保存標(biāo)本的結(jié)構(gòu)。 冰直接轉(zhuǎn)化為水蒸氣不經(jīng)過(guò)液態(tài)這將導(dǎo)致體積和結(jié)構(gòu)損傷的變化。
圖3:ES,Exoplasmic表面;PF,原生質(zhì)的斷裂臉;英孚,Exoplasmatic骨折臉;PS,原生質(zhì)的斷裂臉;Cyt,細(xì)胞質(zhì)
水的升華/冷凝過(guò)程取決于在特定溫度和飽和壓力的有效部分水壓力室中的水或冰。 注意:一個(gè)好的真空降低了部分水壓力。
例如:冰或冷凍標(biāo)本溫度為-120°C的飽和壓力約為10 7 mbar。 如果這種壓力室設(shè)立,冷凝和蒸發(fā)平衡。 蒸發(fā)的分子的數(shù)量等于凝聚分子的數(shù)量。 在更高的壓力冷凝率高于升華率-冰晶在試樣表面的生長(zhǎng)。 這可以避免。 冷(標(biāo)本)板以上標(biāo)本減少了當(dāng)?shù)氐膲毫凸ぷ髯鳛橐粋€(gè)凝結(jié)的陷阱。 水分子從標(biāo)本優(yōu)先附著在冷表面。 在壓力低于飽和壓力比分子升華冷凝和冷凍蝕刻。
執(zhí)行凍結(jié)蝕刻,直到樣品是完全無(wú)冰的,稱為冷凍干燥。 這個(gè)過(guò)程只適用于小樣本在合理的時(shí)間執(zhí)行。 完成幾個(gè)步驟通過(guò)加熱在-120°C到-60°C維持每一步的溫度在一定時(shí)間。 這可能需要幾天。
圖4:飽和蒸汽壓(1982年由Umrath)
在試樣的溫度低于-120°C蝕刻率非常低,腐蝕時(shí)間增加到不切實(shí)際的時(shí)期。 如果真空室的壓力是固定的,它可以增加腐蝕率提高試樣的溫度。 小心溫度高于-90°C的生物樣本。 蝕刻率極大增加。 此外六角冰形式從?；?導(dǎo)致脫水文物。
純水的理論升華率降低,因?yàn)?
水的深度標(biāo)本升華物低于水的表面。
溶劑鹽和大分子減少升華速度。
相當(dāng)一部分的束縛水的生物樣品升華率較低。
冷凍斷裂生成圖像
冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術(shù)需要在真空條件下沉積在裂縫表面極薄重金屬和碳薄膜。
冷凍斷裂的樣品在用金屬角后跟一個(gè)碳備份薄膜包衣（徠卡EM ACE600凍結(jié)骨折或徠卡EM BAF060與徠卡EM VCT100），以產(chǎn)生一個(gè)副本，以在TEM或掃描電鏡塊面進(jìn)行成像。
對(duì)于這兩種方法有一定量的蝕刻時(shí)間以同樣的方式經(jīng)過(guò)該斷裂面涂敷。第一?。?-7 nm）的重金屬下角涂層產(chǎn)生地形對(duì)比度（陰影）。第二個(gè)90°下涂布在厚的碳層（15-20納米），以穩(wěn)定的超薄金屬膜。在這一點(diǎn)上，蝕刻過(guò)程停止。將圖像的非常小的結(jié)構(gòu)的重金屬是在非常低的角度（2-8°）的施加和涂層過(guò)程中的樣品被旋轉(zhuǎn)。這增加了對(duì)比的絲狀和小結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)被稱為低角度的旋轉(zhuǎn)陰影。
電子束蒸發(fā)應(yīng)當(dāng)用于重金屬膜。這是涂層技術(shù)，給人一種非常精細(xì)和定向沉積。碳的支承層穩(wěn)定它們由金屬露出的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)將改變溫度的升高而在其輪廓，樣本不會(huì)是完全導(dǎo)電的，副本也不會(huì)粘在一起。
單向凍結(jié)破碎酵母的陰影
圖5:左:低溫掃描電鏡,BSE(背散射電子)的形象。 右:復(fù)制品,TEM圖像(由Electronmicroscopy蘇黎世理工學(xué)院)
應(yīng)用程序
圖6:高通濾波器,徠卡EM VCT100轉(zhuǎn)移到徠卡EM BAF060冷凍蝕刻和低溫涂料使用電子束***和旋轉(zhuǎn)試樣架。 徠卡EM VCT100轉(zhuǎn)移到低溫掃描電鏡。 托公式在油/水基地,大約。 3分鐘-100°C(升華)暴露脂質(zhì)層(粗糙紋理晶片+乳化劑)。 由斯蒂芬·維斯納博士,拜爾斯道夫,漢堡
圖7:高通濾波器,徠卡EM VCT100轉(zhuǎn)移為冷凍斷裂/冷凍蝕刻和徠卡EM BAF060 cryo-coating使用電子束***和旋轉(zhuǎn)試樣架。 EM VCT100轉(zhuǎn)移到低溫掃描電鏡。 有翼的硅藻混合文化的原生生物游仆蟲屬。 羅蘭博士的斑點(diǎn),NIBSC陶工酒吧,英國(guó)
圖8:高通濾波器,凍結(jié)破碎、冷凍蝕刻和低溫caoted徠卡EM BAF060 /萊卡EM VCT100過(guò)戶到低溫掃描電鏡。 油/水乳化暴露骨折洋蔥狀薄片形成液滴的成分。 由斯蒂芬·維斯納博士,拜爾斯道夫,漢堡
圖9:酵母細(xì)胞在TEM復(fù)制品。 高壓冷凍黃金標(biāo)本在徠卡EM BAF060運(yùn)營(yíng)商和冷凍斷裂。 由Elektronenmikroskopie蘇黎世理工學(xué)院
圖10:Funghus大麥葉片。 安裝在徠卡EM BAF060標(biāo)本表通過(guò)冷卻和冷凍標(biāo)本表在液態(tài)氮。 徠卡EM BAF060部分冷凍乾(冷凍干燥標(biāo)本溫度較高)。 與鎢涂層。 徠卡EM VCT100轉(zhuǎn)移到低溫FESEM 5凱文。