徠卡顯微鏡單細胞分析激光顯微切割后
Morbus (M.) 得老年癡呆癥后， M.Parkinson是第二個*常見的進行性神經(jīng)變性疾病。 前的*初癥狀顯現(xiàn)出來，高達70％的中腦多巴胺釋放的神經(jīng)元已經(jīng)死亡。 生物學博士。 哼哼。 福爾克施勞德拉夫（德國烏爾姆大學的一般生理研究所）用現(xiàn)代激光顯微切割的方法來從M.Parkinson患者為了獲得分子洞察疾病采取驗尸組織標本分離和分析細胞。
M.Parkinson研究
M.Parkinson的特征標志是多巴胺能神經(jīng)元在中腦的惡化，特別是在黑質 （SN，黑色物質）。不同的原因和這種疾病的形式已經(jīng)確定。 在基因家族形式的情況下，例如，它一直未能識別出具有分枝Parkinson因果影響的各種基因。 但是，我們仍然不知道是否所有相關的基因已被確定，或者他們對發(fā)病機制究竟是如何作出貢獻。
對于如何在疾病起源有幾種說法。 M.Parkinson可以比作一個謎。 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多的作品，并可以把一些他們在一起，但我們不知道是什么的全貌樣子。 我們還沒有制定出一些作品的意義的是，我們也不知道有多少的拼圖碎片，我們仍然需要找到之前，我們可以提出M.Parkinson的全貌，并真正了解這種疾病。
我集中在黑質多巴胺能個人腦的神經(jīng)元的基因表達分析。 這些細胞選擇性退化，因為他M.Parkinson病的進展。 一旦患者注意到M.Parkinson的主要癥狀，如靜止性震顫是本病的特征，*過70％的多巴胺能神經(jīng)元的SN都已經(jīng)死了。
我的一個研究的目的是開發(fā)*優(yōu)化的qPCR（定量聚合酶鏈反應）為基礎的方法，使有效的從M.Parkinson患者的基因表達人類驗尸組織有前途的候選基因中單個神經(jīng)元的基因表達的比較從健康對照組相同的神經(jīng)元。 我們開發(fā)了一種定量PCR為基礎的平臺，它可以被用來分離單個細胞的天然組織和獲得高度可比的基因表達分析。 我們的分析，例如試樣中的RNA的質量，表明結果的質量不被染色工藝和激光顯微切割的影響。
實驗過程
圖1：流圖的實驗程序。 流程圖表示的協(xié)議用于UV LMD和定量RT-PCR的基因表達來自人死后的大腦PD和對照個體的SN多巴胺神經(jīng)元的分析的實驗過程。 發(fā)表于：核酸研究1-16（2008）; DOI：10.1093/nar/gkn084，版權所有：牛津大學出版社。
在黑質多巴胺能神經(jīng)元
不同的驗尸樣本的分析都像在 M.Parkinson的特定階段的快照。 我可以相互比較這些快照。 但我不能使用這些樣本來檢測一個改變基因的表達是否是結果或疾病的原因。 我們需要做的關于這個問題的進一步研究。
我檢測基因表達的M.Parkinson患者的選擇性多巴胺能神經(jīng)元的策劃改變。 這種變化影響到參與多巴胺代謝的調節(jié)以及基因離子通道代碼基因。 我們發(fā)現(xiàn)，例如，涉及的合成和提供多巴胺在存活的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)個基因的高表達。 我們還研究了離子通道，調節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的活性不同的基因表達模式。 在這里，我們注意到，在某些分枝Parkinson病患者的研究基因的表達的改變。
圖2A：單個神經(jīng)元的UV-LMD。 （A）左圖：cresylviolet（CV）染色小鼠腦冠狀部分前（左）后（右）紫外激光顯微切割整個區(qū)域的指示的黑質致密部（黑質）的區(qū)域。 右側面板：定性逆轉錄（RT）多重巢式PCR產(chǎn)品，適用于整個LMD黑質凝膠電泳結果。 用于RT-PCR信號的所有八個不同的多巴胺能（TH，DAT，GIRK2，D2S / l）和nondopaminergic（GAD，GIRK1，GFAP，CB）的標記基因，多巴胺，GABA能和神經(jīng)膠質細胞的異質細胞混合物中檢測到。 （DNA梯：100-bp的標記）。
圖2B：上：CV-染色紫外lasermicrodissection 15個人DA能神經(jīng)元后冠狀腦部分。 中：選擇和激光顯微切割從上部的個人神經(jīng)元。 較低：個別神經(jīng)節(jié)（左）和上限控制的UV-LMD后（右）展示成功分離。
圖2C：PCR產(chǎn)物的定性多重RT-巢式PCR凝膠電泳個別LMD SN DA能神經(jīng)元和小SN DA池后。上部和第二屏：多巴胺能標記基因（TH，DAT，GIRK2，D2，不GIRK2，GAD67，GFAP）相似的基因表達模式的20個游泳池和一個SN DA能神經(jīng)元的敏感性說明協(xié)議和特異性。 第三小組：表達一個人鈣結合蛋白陽性CB（+）SN DA神經(jīng)元（D和E）采用cDNA的10％，由15鼠標SN DA能神經(jīng)元池為ENO2基因表達的實時定量RT-PCR分析簡介模板。 神經(jīng)元的UV-LMD-收集從新鮮或存儲（1周），并重新用于組織切片。
激光顯微切割的影響
在過去的幾年中已經(jīng)出現(xiàn)了比較M.Parkinson患者健康組織的黑質的完整組織標本許多研究。 然而，這種比較是誤導性的，因為在這些患者中，有70％認為有明顯參與了疾病的神經(jīng)元已經(jīng)墮落在其發(fā)病。 此外，所述組合物和被檢查的腦組織切片是非常不均勻的。 所以我們做了到現(xiàn)在為止的“組織”的做法是像梨比較蘋果。
我們希望有選擇地查看所涉及的致病過程，并使用激光顯微切割為在單細胞水平驗證比較中腦多巴胺能神經(jīng)元。 這種技術使得能夠精確地切割個別的多巴胺能神經(jīng)元的輸出復雜的組織，沒有接觸或污染，并分析單個細胞的基因表達。 *常見的類型組織中的大腦是支持組織：神經(jīng)膠質細胞是10至50倍，比我們都沒有激光顯微切割感興趣的神經(jīng)元比較常見的，這將是幾乎不可能清晰地刻畫比較少見的神經(jīng)細胞上的分子水平，他們將無法從背景噪聲區(qū)別開來。
單個細胞的分析通常會導致從那些從一個完整的組織檢查獲得不同的結果。 研究表明，某些微RNA的表達在M. Parkinson病患者的組織發(fā)生變化。 我們追蹤這些語句之一，起初我們能夠確認的結果為整個組織。 但是，我們也同時在顯微檢測細胞。 在這里，我們發(fā)現(xiàn)，微RNA的表達沒有在單細胞水平改變。 該組織神器是用激光顯微切割的輔助檢測。
我們使用激光顯微切割系統(tǒng)，它使單個細胞的無接觸解剖或者，如果需要的話，更大的組織的區(qū)域。 解剖的材料被捕獲在一個管的蓋子，并且可以立即進行處理。
圖3：LMD和人PD個別SN DA能神經(jīng)元的基因表達分析和控制死后的大腦。 的neuromelanin陽性[NM（+）]的神經(jīng)元（A和B）池是通過從PD（A）cresylviolet染色水平中腦冰凍切片LMD分離和大腦控制（B）。 上圖：從黑質NM +神經(jīng)元的小水池LMD后Parkinson?。ˋ）和對照組（B）冰凍切片。 較低的面板：代表PD（A）和對照組（B）黑質新墨西哥州（+）神經(jīng)元前（左）和解剖后（右）。 插入：UV-LMD后帽控制。 比例尺：250毫米，20毫米，分別為。 （三）分散的a-synuclein基因的表達，水平PD和控制大腦的情節(jié)。 α-突觸核蛋白基因的表達15海里（+）和TH（+）黑質神經(jīng)元被給定為PG-當量從每個細胞人類SN-組織（標準曲線定量）由來的總cDNA的每個池，通過定量實時確定實時PCR。 棒表示平均每個brain_SEM的黑質池的a-synuclein的表達。 （四）情節(jié)的意思的a-synuclein基因水平（_SEM）針對每個大腦中的RNA的完整性數(shù)目。 腦銀行代碼表示相鄰的點（參見圖5C和表1）。 （E）之間的線性意味著-突觸核蛋白的表達和RNA的完整性號所有個人分析控制和PD大腦回歸分析顯示無正相關關系組織的高品質的RNA之間以及檢測到-突觸核蛋白的表達層次（對照組：黑色虛線，R2 = 0.0506;Parkinson病的大腦：紅色虛線，R2 = 0.9950;所有分析的大腦結合：黑線，R2 = 0.4369）。 請注意，PD的大腦表現(xiàn)出RNA的完整性之間有很強的負相關性，并檢測到-突觸核蛋白的表達層次（紅色虛線，R2 = 0.9950）。 （六）平均A-SYN，TH和ENO2的表達水平顯著高于個人新墨西哥州（+）從SN PD人腦DA能神經(jīng)元與對照組相比（見表1和表2）。 發(fā)表于：核酸研究1-16（2008）; DOI：10.1093/nar/gkn084，版權所有：牛津大學出版社。
在M.Parkinson研究未來的挑戰(zhàn)
目前，沒有測試診斷M.Parkinson在早期階段，并且有本病的許多變種，并有類似癥狀的疾病。 因此M.Parkinson案件的一定比例被診斷錯誤或不能確診的。
的前提，成功治療 M.Parkinson將是有效的早期診斷。 如果這種疾病可能在哪些神經(jīng)元是剛剛開始墮落的初始階段被診斷，有可能防止進行性神經(jīng)元變性，使疾病不打出來的。
在血液或腦脊液生物標志物的鑒定是目前的一大研究熱點。 有基因并非只在腦中表達，但無所不在 - 在所有細胞中。 如果這些基因的表達中的一個分枝Parkinson情況下，多巴胺能神經(jīng)元被改變，這將是可能的，研究更容易獲得組織診斷的目的。 *個步驟已經(jīng)采取了，但還有很長的路要走，這樣的測試才能實施，并進一步的長期研究需要進行。