尼康顯微鏡在活細胞顯微術焦點漂移矯正

 直到80年代末，大多數(shù)生命科學研究人員通過捕獲的各種細胞學特征單一的快照使用固定和染色（實際上，非生物）標本研究生物結構的復雜細節(jié)。在過去的幾十年中，然而，研究在生物和醫(yī)學科學已經(jīng)在很大程度上轉(zhuǎn)移重點調(diào)查了發(fā)生在生命系統(tǒng)的分子，細胞和整個生物體水平上的時間尺度范圍從毫秒到小時浩大的動態(tài)過程。 此過渡到成像活細胞的司機已墊付的發(fā)展顯微儀器，更靈敏的數(shù)碼相機，以及新合成和基因編碼的熒光基團，能夠針對特定的細胞器，精度高。 因此，單次顯微照片和固定的，死細胞數(shù)位影像時代使用寬合成的探針，量子點和熒光蛋白的光譜已經(jīng)在很大程度上屈從于活細胞成像，其中重點在顯微鏡載物臺上保持細胞長時間的時間是一個關鍵因素。

在透射光及熒光顯微鏡活細胞時移成像技術的應用越來越普遍也許是*好的，幾乎出現(xiàn)在科學文獻中，每天的研究報告數(shù)量浩繁證明。 在大多數(shù)情況下，細胞活性在專門為使用熒光探針技術聯(lián)接到連續(xù)的圖像捕獲顯微鏡載物臺設計的組織培養(yǎng)成像室監(jiān)測。 *的對比度增強技術，如微分干涉對比（DIC），相位對比，暗視野，熒光，和霍夫曼調(diào)制反差（HMC）可以采用用于記錄的動態(tài)在寬的試樣如以上冗長的時間周期連續(xù)序列的頻譜。 同樣的，更*的熒光技術，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，多光子，和全內(nèi)反射（TIRF）顯微鏡越來越多地被用于隨時間監(jiān)測細胞內(nèi)過程。

除了其在細胞生物學重要性，延時成像，也可用于研究多種液體樣品和固體材料在化學，工業(yè)，和地質(zhì)系統(tǒng)，以及液晶相轉(zhuǎn)變和結構分析的光譜新的和*材料金相。 在基礎生命科學，時間推移成像（也稱為cinemicrography）已被證明是一種有效的工具，調(diào)查粒子運動，分子間的相互作用，細胞遷移，細胞分裂，細胞器動力學，細胞凋亡，分化和神經(jīng)生長過程中，其中一個許多新的和有前途的應用。 *近，在熒光蛋白質(zhì)跨越整個可見光譜的發(fā)展**已導致只能通過觀察隨著時間的推移進行調(diào)查動態(tài)無數(shù)細胞內(nèi)事件的發(fā)現(xiàn)。

示于圖1是一些在活細胞顯微術用于延時成像更加有用和流行的對比度增強技術的例子。 在圖1所示的粘合印度麂鹿皮膚成纖維細胞（一）進行成像在DIC的方式來可視化細胞骨架的應力纖維贅疣。 鼠袋鼠腎上皮細胞在圖1中相位對比成像（PTK1線）（B）揭示了從中止細胞分裂而產(chǎn)生的雙核細胞，而一個單獨的人骨肉瘤（U2OS線）細胞的成功的分割捕捉與HMC中圖1（c）。 這些**的透射光技術被廣泛用于時間推移活細胞成像。 同樣，激光掃描熒光技術和旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（圖1（d）中，DEOS熒光蛋白在中國倉鼠卵巢細胞;在HeLa細胞和圖1（e）中，EGFP-標記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）可被用于許多的觀察，包括光活化，共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），光漂白技術，運動性，以及熒光蛋白分布的動力學。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM，圖2（f）中示出的mCherry熒光蛋白融合到紐蛋白在狐肺成纖維細胞）是用來觀察發(fā)生在靠近蓋玻片細胞膜的事件。

在時間推移成像的歷史透視

時間推移成像在活細胞中的首次應用是由一個年輕的法國研究生誰正在檢查活動力梅毒螺旋體生產(chǎn)報在100多年前（大約五年前卓別林做了他的*部電影）。 學生，讓Comandon，用一個巨大的電影膠片相機連接到一個更小的暗視野顯微鏡，期間一個復雜的配置捕獲的圖像序列，但認為很粗糙的現(xiàn)代標準。 在后二十世紀上半葉，時間推移圖像序列采用緊湊型16毫米相機上配備相襯照明顯微鏡通常記錄。 連續(xù)的圖像捕獲之間的時間間隔是由粗大的輔助intervalometers，該裝置把燈打開和關閉圖像之間，為了避免試樣的過度照射和加熱控制。用于電子顯微鏡光源百葉窗沒有市售，直到20世紀80年代。

依靠膠片相機的早期時間推移成像技術是受到眾多陷阱。 *重要的，這部電影不得不被發(fā)送出去（在大多數(shù)情況下）為商業(yè)處理，這意味著實驗結果的評估可以通過幾天甚至幾個星期被推遲。 此外，使用薄膜是昂貴的和受主的，通常導致不一致的結果的處理的變化。 例如，暴露的錯誤可能不會發(fā)現(xiàn)，直到周的實驗已經(jīng)結束后，和焦點漂移的共同問題是往往無法檢測，直到處理膜被查看。 雖然許多隨時間推移成像相關的文物，如焦點漂移，樣品不均勻加熱和震動，仍采用現(xiàn)代數(shù)碼相機的時候妨礙*終結果，該技術已顯著成熟，在過去的十年。（本文來源：尼康顯微鏡在活細胞顯微術焦點漂移矯正）

發(fā)生在時間推移cinemicrography的*次重大進步，當視頻管攝像機和圖像采集卡電腦卡終于與顯微鏡結合，開始在20世紀70年代。 雖然由視頻攝像機產(chǎn)生的圖像中較低的分辨率比傳統(tǒng)的基于乳液的膜，大約與膠片攝像機相關聯(lián)的曝光設置的不確定性都大大減少。 作為一個額外的好處，對圖像序列可以采集過程中進行查看，并立即供審查和編輯使用錄像帶輸出延長時間推移實驗的結果。 相比之下，耦合到一個磁帶錄音機攝像機的成本是顯著小于膠片電影攝影機，當膜處理的費用被認為是。 對于錄像帶與電影的重復費用也少得多，而且含有不良序列磁帶可以被擦除或覆蓋，并置于重新投入生產(chǎn)。

活細胞動力學的一個例子是使用photoconvertible 光學熒光筆熒光蛋白標記的線粒體示于圖2。 試樣是一種附著兔腎上皮細胞培養(yǎng)物（RK-13 行）表達融合的紅-綠photoconvertable DEOS熒光蛋白到線粒體靶向肽序列。 當與488納米的激光照射，豐富的綠色熒光線粒體整個細胞質(zhì)中（圖2（a））的觀察。 位于長filopodium單個線粒體是使用從在*幀中的405納米激光的簡要脈沖光轉(zhuǎn)換。 新紅色熒光的細胞器是一個20分鐘的間隔后捕獲為未轉(zhuǎn)換的線粒體途徑（圖2（b））。 片段化后，將未轉(zhuǎn)化的線粒體使一個接近的方法來光轉(zhuǎn)換鄰居（圖2（c）），并且這兩個線粒體隨后保險絲（圖2（d））與細胞器之間分布的光轉(zhuǎn)換熒光蛋白標記。 第二碎片事件（圖2（e））后，將光轉(zhuǎn)換線粒體的一小部分接近第二未轉(zhuǎn)化的線粒體，但不是熔化，形成了一個環(huán)形（圖2（f））。 在圖2所示的幀由包含在2小時內(nèi)收集到*過1000圖像的時移序列被選定。

盡管越來越多的研究正在成為使用熒光蛋白參與了活細胞時移序列采集，數(shù)字靜像繼續(xù)被廣泛地用于在延長的時間周期記錄在細胞培養(yǎng)物中的動態(tài)事件。 在許多情況下，間歇性單圖像可以以更高的分辨率使用照明水平大于都是可行的串行延時成像捕獲的具有改進的信號與噪聲。然而，在計算機體系結構和數(shù)據(jù)存儲容量技術的迅速發(fā)展也助推延時cinemicrography到復雜的一個新的水平。 在主內(nèi)存，快速緩存，處理器速度和硬盤容量上一個局限被克服，使包含數(shù)千幀的組成和幾個GB復雜的圖像序列，可以在本地存儲主機上。 硬件的進步已通過并聯(lián)可控制幾乎所有方面的高速圖像采集，包括載物臺運動，光照強度，曝光時間（和其他的相機參數(shù)），輔助的光學元件（如放置DIC棱鏡在新的和復雜的軟件程序包光路）和波長。 **的軟件也可以進行采集后圖像處理，增強的視頻功能。 在簡單的系統(tǒng)中，介質(zhì)的性能的計算機可使用通過一些接口來控制一個科學級的數(shù)碼相機。

在專門的熒光顯微鏡技術，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，TIRF和多光子耦合到新興的電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）技術，使科學家能夠觀察廣，利用新開發(fā)的熒光動力學事件的頻譜現(xiàn)代進步探頭針對特定的細胞區(qū)室，生物分子和受體蛋白。 通過采用這種*的方法，多個事件可以同時記錄在四個或更多個尺寸（橫向，軸向，在時間上和光譜上）提供一種非侵入性的窗口進入細胞內(nèi)的活性在一定時間范圍內(nèi)選定。 此外，活細胞成像技術已經(jīng)在幫助領導**目前在細胞生物學，這是提供具有空間和時間信息的科學家，這是以前沒有的。

焦點漂移的起源

盡管有各種各樣的，在過去的幾年里已經(jīng)發(fā)生了光學顯微鏡的技術進步，通過緩慢的變化表現(xiàn)為標本聚焦在時間推移成像過程中的軸向波動仍然是一個顯著的問題。 術語焦點的漂移通常是用來描述一個顯微鏡無法維持所選擇的焦平面在一段較長的時間。 分別發(fā)生在活標本的自然運動的這件神器，主要受一些影響因素，下面列出。 一般情況下，采用高放大倍率和數(shù)值孔徑油浸物鏡時（有重點的非常淺的景深）比它更低的放大倍率（10倍和20倍），與更廣泛的震源深度物鏡，重點漂移是更多的問題。

• 熱漂移 -溫度的變化也許是焦點漂移的*常見來源。 波動溫度所產(chǎn)生的空調(diào)和中央供熱單位在實驗室中的結果，在顯微鏡激烈的照明光源，以及加熱不均的物鏡和階段通常是在焦點漂移的主要元兇。 此外，不同的膨脹和收縮率的材料用于構成培養(yǎng)腔室和/或光學顯微鏡列車可導致距離的物鏡前透鏡與蓋玻片之間的變化，從而導致聚焦的損失。 具有*高倍率物鏡，只需1度的變化通常足以產(chǎn)生0.5至1.0微米的焦平面偏移。

• 蓋玻片的Flex -熱梯度和在培養(yǎng)室的溫度等變化，以及與灌注期間迫使流體通過所述成像室相關聯(lián)的工件，可以制作隔膜作用在該標本彈離焦的蓋玻片彎曲。 這神器往往是顯而易見的內(nèi)庭，其中灌注系統(tǒng)控制不佳。 蓋玻片彎曲可能不會在圖像捕獲序列可以灌注會話之間是交錯的情況下，呈現(xiàn)顯著的問題，但它會嚴重影響那些需要較高的時間分辨率（2秒或更少）的研究。 蓋玻片撓曲可以通過減少在流動室的灌注輸入口的直徑，并通過裝備在顯微鏡用物鏡加熱器以補償腔室的溫度波動*小化。 小，但可再現(xiàn)的，在蓋玻片的運動也可以發(fā)生在培養(yǎng)室，均設有導電性，透明涂層，以維持溫度。 在這種情況下，施加的電流負載，以涂布的蓋玻片上可以產(chǎn)生收縮或暫時打亂焦點擴展。 正確的焦平面通常將重新建立一次電流負載被刪除。

• 成像室加熱的不均勻性 -活細胞成像腔室產(chǎn)生的各種各樣的配置，往往利用完全不同的技術用于保持試樣在恒定溫度。 例如，腔室具有被加熱的導電涂層（圖3（a））的蓋玻片往往產(chǎn)生在整個玻璃表面優(yōu)異的導熱一致性比這樣做只加熱周圍的蓋玻片的周圍的金屬腔。 在后者的情況下的熱梯度可以很大（圖3（b））。 此外，高的數(shù)值孔徑的油或水浸物鏡可以作為一個散熱器，以傳導熱量遠離所述試樣腔室和進金屬物鏡，這樣就產(chǎn)生在液浸介質(zhì)中的區(qū)域中的熱梯度。 其他文物，如從電源并在室溫顯著波動電流的變化也可以負責在樣品室加熱違規(guī)行為。



• 振動 -一種常見的神器與眾多的起源，振動往往是由多種與儀器配置有關，此外就是出現(xiàn)在周圍的環(huán)境資源要素的生產(chǎn)。 在顯微鏡及配件，過濾器車輪，百葉窗，自動階段，過濾器的炮塔，和零部件等機電運動是振動與穩(wěn)定的重點干擾的常見原因。常見的外部（非顯微鏡）的振動源是空氣處理系統(tǒng)，步行交通，冰箱壓縮機，電梯，并且成像設置近重型設備的議案。 隔離表，減震墊，以及臺式平臺上，可從各種各樣的分銷商的，是有用的，以減少振動。

• 機械不穩(wěn)定性 -滿載物鏡的一個物鏡轉(zhuǎn)換器可以在3和5英鎊，這往往代表對涉及顯微鏡對焦機構的機械組件的顯著重力應變之間的權衡。 其結果是，聚焦偏移的發(fā)生原因只是由于重力對物鏡轉(zhuǎn)換器的拉力。 此神器可以只使用一個單一的物鏡來記錄時間推移錄像可以減輕到一定程度。 此外，明智的做法是確保（如果可能），該顯微鏡配備有具有短長度的機械精密聚焦系統(tǒng)，并維持聚焦張力控制的適當?shù)脑O置。機械不穩(wěn)定性的其他來源包括松散的齒輪組中的焦點機架或聚光鏡支柱，以及作為輔助成分。

• 浸沒介質(zhì)波動 -在高分辨率活細胞研究，用于延時實驗的顯微鏡物鏡可能需要包括油，水或甘油浸入介質(zhì)。 在過去的收集到足夠的數(shù)據(jù)，粘度波動和成像介質(zhì)的化學分解所需的時間太久，會影響性能和浸泡媒體的傳播。 浸油的粘度和折射率通常隨溫度變化和水很容易蒸發(fā)，必須考慮和監(jiān)測，以避免焦點漂移的因素。 新開發(fā)的高性能有機精油，可在大范圍內(nèi)的折射率（包括等同于水和甘油值），并提供了一個很好的解決方案，以使用傳統(tǒng)的浸入式媒體。 在某些情況下（取決于成像室配置），一個墊圈或套管可被用于形成物鏡和蓋玻片，以減少水蒸發(fā)的水平之間的密封。

• 加入試劑 -許多研究需要的培養(yǎng)基或添加化學試劑時延時成像序列變化。 導入試劑到培養(yǎng)室的物理行為可以產(chǎn)生機械沖擊，這將導致在焦點漂移和添加試劑不屬于在同一溫度作為成像介質(zhì)可以產(chǎn)生類似的效果。 在加熱的灌注系統(tǒng)，引入新的媒體或化學品通常產(chǎn)生微不足道的變化的軸向聚焦平面，但用移液管或注射器中加入液體以一個開放的腔室可以擾亂焦點。

• 橫向運動階段 -在某些情況下，房間的溫度波動或振動將產(chǎn)生一個小的橫向-機械階段，（在某些情況下）會導致軸向集中的漂移（x和y）的翻譯。 這通常是一個微不足道的問題，但可以成為嚴重如果一個開放導管的顯微鏡直接推動冷或暖空氣。 如果該階段配備一個夾具，它應該起延時成像之前被啟用，但在其他方面也有一些補救措施。 采用步進電機*的顯微鏡階段一般不受到橫向移動文物。

• 不安全的樣品室 -試樣成像室的延時序列中移動會導致焦點漂移由于蓋玻片的新位置。 在固定玻璃底培養(yǎng)皿在載物臺光圈階段適配器，改變菜的位置可發(fā)生彎曲鉗或機械構件，如干擾電線及氣/液管連接室控制器和其他的結果輔助元件。 此外，多井成像室往往從輕微變化放置時蒙受單獨蓋玻片連接到每個孔中，從而在掃描板聚焦誤差。 室運動和蓋玻片高度不一致是必須定期解決一個共同的神器。

• 標本運動 -在活細胞成像的一個不可避免的神器是試樣的運動遠離顯微鏡焦平面。這通常使用正處于有絲分裂，其中的細胞顯著改變形狀的中期貼壁細胞采集時間推移順序發(fā)生時。 在其他情況下，試樣可以完全移出視場的，無論是通過從蓋玻片分離或通過蠕動。 除了使用凝膠和試劑，如纖連蛋白錨定的細胞和組織的蓋玻片，沒有機械，化學，或?qū)z體的運動的電氣補償。

解決方案聚焦漂移

許多年來，用于校正焦點偏移的*佳解決方案是站，以便提供一個學生或技術員在顯微鏡近手動重新聚焦在必要時。不幸的是，這是*不適合長期成像實驗相對成本過高以及基本無效的解決方案。焦點漂移的問題已經(jīng)通過各種渠道，包括軟件算法，專用顯微鏡硬件，抗振動墊和表格，并封閉在保護環(huán)境的顯微鏡（如圖4）中得到解決。這些方法都得到不同程度的成功，但都沒有提供，可以擴展到幾乎所有的活細胞成像場景焦點漂移的通用解決方案。

熱不穩(wěn)定性，這也許就是焦點漂移的*顯著源，可以在很大程度上是與大型有機玻璃外殼（稱為消除環(huán)境試驗箱 ;圖4（c）），從外部環(huán)境隔離的顯微鏡，并提供了良好的條件，促進登錄相位細胞的生長。培養(yǎng)箱式外殼包圍顯微鏡載物臺，物鏡，熒光過濾器，以及透射光聚光，幾乎涵蓋整個顯微鏡以及試樣。這些室可用于各種培養(yǎng)容器，包括標準培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，載玻片與蓋玻片安裝及各種開式和閉式成像室的。溫度保持與外部加熱裝置（通常是強迫空氣）和二氧化碳濃度被控制與耦合到由純氣體的氣瓶供給的調(diào)節(jié)器的感測單元。

環(huán)境試驗箱還可以配備濕度控制及多種設計提供橡膠手套的訪問，以避免在成像過程中操縱細胞，當干擾環(huán)境的平衡。為了保持溫度控制程度高，避免焦點漂移，幾個比較成熟的孵化室括幾乎整個顯微鏡除外目鏡，攝像頭，并lamphouses的。在缺點方面，環(huán)境試驗箱可以阻礙快速獲取標本，并在繁瑣重復操作是必要的。此外，該室內(nèi)部的高濕度水平可以添加到保持在儀器由于齒輪潤滑劑的過早降解和金屬表面和透鏡涂料氧化的費用。作為替代，其耦合到階段頂孵化物鏡加熱器可以被使用，但這些裝置并不總是與具有保護桶，很難除去浸泡物鏡兼容。

在過去的幾十年中，眾多軟件算法已被設計來解決焦點漂移基于對比度或邊緣檢測。 許多這些*終被納入科學成像軟件包設計也處理圖像并控制顯微鏡。 焦點漂移的軟件控制需要被配備有數(shù)碼相機和計算機控制下的電動物鏡轉(zhuǎn)換器的顯微鏡。 通常情況下，重點調(diào)查基于軟件的顯微鏡需要兩個互補的算法來實現(xiàn)聚焦控制。 *確定了物鏡的軸向（z）的位置和真實的焦點之間的對應。 第二個是一個搜索算法（圖5），通過捕獲圖像樣本的焦平面，以確定*大焦點“得分”的位置（*佳位置）。 大部分的重點軟件控制開發(fā)的算法有，但是，在使用靜態(tài)的標本具有穩(wěn)定的幾何結構創(chuàng)建和當時間推移調(diào)查適用于動態(tài)活細胞是遠不如有效。 此外，該算法通常用于特定照明場景（明場，相襯等）進行優(yōu)化，并在應用到對比度增強技術（如熒光），用于它們的目的不是可能失敗。

重點軟件算法通常依賴于一個良好的聚焦圖像包含比失焦圖像對比度更高或更精細的細節(jié)（實際上，更高的頻率）的事實。 作為一個例子，采用了拉普拉斯算子來估計焦點時，該算法計算出一個采樣圖像的二階空間導數(shù)，移動物鏡向上或向下通過一個預先確定的量，然后重復該過程，直到*佳擬合被確定。 在分析過程中越來越小的步驟通常采取在兩個方向上。 從過濾器高輸出值表明大強度變化的區(qū)域，通常在圖像內(nèi)表示的邊緣。 在任何圖像，*高的頻率成分發(fā)生在邊緣，應該是*突出的特點，當試樣*佳聚焦。 為重點漂移，邊緣模糊，產(chǎn)生在圖像下二階導數(shù)。 采樣反復進行，直至*合適的判定。 通常，這可能需要幾分鐘，這遇事推諉的軟件例程的重點只需要使用圖像采集間隔期長的延時實驗。

在共聚焦時間推移顯微鏡，其中每幅圖像保持清晰的對焦不論儀器是否正在經(jīng)歷軸向偏移，聚焦校正可以通過定期收集從樣品的一系列Z-堆棧（光學部分），不論厚度來實現(xiàn)。 單個堆疊然后分析使用軟件來確定在Z堆疊并且記錄在該序列的開頭的參考圖像中的每個圖像之間的Pearson相關系數(shù)。 堆棧分析后，具有像素強度的*大相關系數(shù)的圖像是用來識別正確的聚焦平面（對應于基準圖像的平面）。 協(xié)同定位信息可以被用來復位物鏡的焦平面。 雖然這種技術應該工作得非常好提供的軟件和硬件接口正確，目前還沒有商業(yè)應用。

從理論上講，使用軟件算法上的熒光標本應因明亮的熒光結構和黑暗的背景之間有極強的對比度產(chǎn)生極好的效果。 然而在實踐中，基于軟件的補償技術要求是基于幾個圖像的熒光物種，從而導致光漂白和光毒性被加重與試樣的每個暴露于光效果的捕獲的計算。 此外，該算法是使用能產(chǎn)生清晰的聚焦光學部分，無論軸向焦點位置（如共聚焦，多光子，與DIC）的文書確定的重點幾乎無用。 使用軟件時，保持焦點另一個缺陷是，該算法往往能決定一個*佳的焦平面是從選定的時間推移序列的開始的初始平面不同。 當在軟件焦點判定的算法組合使用熒光，另一種是執(zhí)行用試驗片的透射光圖像的焦點分析步驟。 然而，這需要機械快門的應用兩個熒光和透射光路，可引入附加的振動。

如圖6中所示要么是沒有任何焦點的漂移校正（圖6（a），6（b）和圖6（c））或具有基于硬件的焦點維護系統(tǒng)，如下面討論的（圖2進行時移序列圖6（d），6（e）和6（f）段）。 該標本是狐貍肺的文化（FoLu線）表達融合mPlum熒光蛋白和靶向序列產(chǎn)生明亮熒光的細胞器線粒體成纖維細胞。 圖像聚集在組合熒光和DIC的模式在一段7小時共聚焦顯微鏡工作在30秒的時間間隔。 如果沒有自動對焦系統(tǒng)，在顯微鏡很快失去焦點，就證明了熒光強度的圖6的連續(xù)虧損（b）和圖6（c），其中發(fā)生在不到45分鐘。 與此相反，硬件自動對焦管理（通過圖6（六）圖6（d））為整個調(diào)查產(chǎn)生清晰，重點突出的圖像。

聚焦漂移補償系統(tǒng)

多年來，已經(jīng)開發(fā)出了一系列旨在彌補焦點漂移的基于硬件的解決方案。 在大多數(shù)情況下，這些設備試圖測量，以保持試樣在焦點對長時間的目的和樣品支架或臺之間的距離。 例如，附連到顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器的渦流傳感器的設計是由1發(fā)明人來監(jiān)視距離，以使用DC馬達耦合到所述聚焦機構的階段和正確的波動。 另一種技術采用的試樣保持器和連接到該物鏡，以提供用于支撐試樣夾持器的壓電元件的誤差信號的套環(huán)之間的距離依賴性的電容的優(yōu)點。 第三，更復雜的方法依賴于將一個全息光柵在物鏡瞳孔保持標本的焦點。 專門的光柵產(chǎn)生由獨立的傳感器檢測，以產(chǎn)生聚焦校正信號的兩個散焦的一階圖像。 *后，一個前體到現(xiàn)代的硬件解決方案的結合在背反射被引導到一個小的棱鏡置于光學火車和監(jiān)視用雙光電二極管陣列，離軸氦 - 氖激光束的焦點依賴性變化。 在焦點自******移被檢測為一個非零差分信號，然后被用于驅(qū)動一個簡單的馬達連接到所述細焦點的機制。 雖然這些硬件焦點補償方案是成功的程度不同，沒有看到在商業(yè)顯微鏡系統(tǒng)的責任。

作為一個通用的方法來提高顯微鏡焦點的穩(wěn)定性，各廠商紛紛花費相當大的精力來產(chǎn)生的工程改進，降低了重心偏移到*低限度。 例如，幾個嵌入式機械系統(tǒng)（重點組件，百葉窗，電動平臺，炮塔旋轉(zhuǎn)）進行了改進和問題的重型物鏡得到解決。 儀器的幀正在制作與專門的合金能夠抵抗熱膨脹，而輔助部件，如鼻甲正在與耐熱的聚合物制成。 這樣的改進已經(jīng)加上*的線性編碼器，它是電動的組件，可以重新定位階段或物鏡轉(zhuǎn)換器的精確位置用比50納米的精度。 盡管這些改進已導致高級顯微鏡，可以一個或2微米內(nèi)保持聚焦更長的時間內(nèi)，它們?nèi)匀灰恢睙o法克服的事實，加熱樣品室（和其相關聯(lián)的蓋玻片）受到熱膨脹和收縮，通往回到原來的焦點漂移的問題。

為了解決固有的幾乎所有蓋玻片為基礎的成像腔熱漂移的文物，在顯微鏡和售后市場的制造商*近推出了新的硬件解決方案，通過采用幾種稍有不同，但仍密切相關的方法來彌補焦點漂移。 要注意的重要一點是，與浸沒物鏡，大多數(shù)這些裝置的操作基于這樣的假設下觀察和蓋玻片的水性表面的試樣之間的關系是固定的（因此，該細胞或組織薄不自由浮動在培養(yǎng)液中）。 相反，細胞或組織（如黑腹果蠅卵室）或者是自然附著在玻璃或附加到通過薄的層粘連蛋白，纖連蛋白，多聚賴氨酸，或糖蛋白的蓋玻片。 所有市售系統(tǒng)的定位的上外部蓋玻片表面，通過測量由弱近紅外線激光或發(fā)光二極管（LED發(fā)出的反射光的形狀的線圖案的位置（玻璃和組織培養(yǎng)基或緩沖液之間的界面）;如示于圖7）。 相反，對于干物鏡，光從下部蓋玻片表面（與空氣接觸）的反射被用來確定樣品是否在焦點上。

該圖在圖7中的圖表呈現(xiàn)的重點漂移補償系統(tǒng)如何能夠利用光的反射的優(yōu)勢從蓋玻片來衡量的相對焦點位置。 的試樣中的感興趣區(qū)域是用于由操作者來設定初始從蓋玻片上表面，其中確定焦平面，并作為基礎補償（圖7（a））的偏移量。 當焦點發(fā)生漂移（在此，作為蓋玻片更接近物鏡的軸向運動的結果，圖7（b）），激光二極管或反射從蓋玻片的檢測強度為重新定位物鏡和恢復所需的信息的偏移補償。 因此，電動軸向聚焦單元接收反饋的補償制度，以糾正在蓋玻片檢測到的漂移，然后恢復偏移預定義的軸向值，樣品（圖7（c）和7（D提供清晰聚焦） ）。 注意，試樣本身不參與焦點校正，而通過反射在玻璃 - 水界面產(chǎn)生的干涉圖案控制這些設備。

總之，解決焦點漂移的問題也許是發(fā)生在*近的歷史是活細胞成像的*顯著進步。此工件必須總是設計為延時成像和更為明顯使用高數(shù)值孔徑物鏡，其中聚焦的窄深度可以很容易地與絲毫振動移位或改變溫度時的實驗系統(tǒng)的結構中加以解決。焦點漂移也是一個關鍵因素（還有一個相當大的挑戰(zhàn)）在每個時間間隔成像單個樣本中的橫向和軸向位置的復雜序列時消除。在大多數(shù)情況下，新的焦點漂移補償可以從顯微鏡制造系統(tǒng)能夠以不同的速度的情況下提供優(yōu)異的校正，雖然。不管復雜的儀器水平，然而，進行延時實驗與活細胞時，必須密切關注支付給上述漂移因素，包括熱環(huán)境，標本成像室，振動，浸入式媒體，穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性。一旦所有的基本細節(jié)已經(jīng)解決，謹慎的調(diào)查人員應給予獎勵以優(yōu)異的成績。