徠卡顯微鏡布氏錐蟲的冷凍置換
生物標(biāo)本的*微結(jié)構(gòu)研究化學(xué)固定是一個相對緩慢和選擇的過程，因此工件的一個共同的來源。 凍結(jié)，另一方面，是身體修復(fù)的生物標(biāo)本的全部和無延遲的好方法;冰晶大到足以取代細(xì)胞物質(zhì)和破壞結(jié)構(gòu)的形成，會是這樣，但是，一個主要的問題。 因此，生物樣本必須被冷凍或在阻止水分子的重排成為晶體，并導(dǎo)致amorphously固化（玻璃化）水的速度或以這樣的方式所形成的晶體是小到足以符合的分辨率觀察法。 對于非常薄的樣品，這可以相對容易地實現(xiàn)通過浸入到合適的冷卻劑。 但是，熱的差的傳導(dǎo)從試樣的芯的外圍上施加樣本，可以通過這種方法在環(huán)境條件下被凍結(jié)，即使有一個無限的冷卻速度在表面的尺寸限制。
以抵消破壞性的冰晶，即使在像大細(xì)胞或組織的片較厚樣品的形成，高壓可以使用：這降低水的凝固點，從而減少了需要進(jìn)行劃線，以充分保持標(biāo)本或者在臨界溫度范圍玻璃化（理想情況下）或高壓冰晶形成于約10納米更小。 此外，在高壓（?200兆帕/ 2,000 bar）的不同晶型的冰為準(zhǔn)這似乎是破壞性較小。 這一原則在高壓下被用于冷凍（HPF），因為停泊和里勒介紹了它在1968年。 如今，商用儀器使用的壓縮機和氣動這一復(fù)雜的系統(tǒng)，以產(chǎn)生高的，這是冷卻試樣之前立即施加的壓力。
2009年，一月Leunissen和洪易提出了不同的冷凍技術(shù)采用同樣的原則，以防止冰晶的形成：而不是使用外部產(chǎn)生的壓力，他們使用的壓力建立起來的樣品由內(nèi)冰晶形成的一個部分一個密封的金屬管，以防止結(jié)晶在相同體積的另一部分。 示出“自增壓快速冷凍”和凍結(jié)取代的古細(xì)菌，酵母細(xì)胞，和秀麗隱桿線蟲，它們可以證明，這種方法可以作為一種替代HPF對于可以在用于冷凍的小銅管被容納標(biāo)本。
圖1（左圖）和圖2（右）：SPF冷凍Typanosoma布氏后冷凍置換，包埋，*薄切片后和染色概述圖像。 注意質(zhì)膜的優(yōu)異的保存和細(xì)胞質(zhì)中。脂滴被看作是細(xì)胞內(nèi)的電子致密的球體。 周圍的細(xì)胞，鞭毛的橫截面可以觀察到（→）。
這些*初的實驗中使用手動浸入的制冷劑，與相關(guān)的有限的控制權(quán)凍結(jié)參數(shù)。 管內(nèi)保存完好的標(biāo)本出現(xiàn)并排損壞的。 為了提高可重復(fù)性和產(chǎn)量，徠卡顯微系統(tǒng)公司開發(fā)了EM SPF與Leunissen，儀器自動化自我加壓快速冷凍，這成為市售在2011年的合作。 相比原來的做法，這種儀器是利用U形管，而不是直的人凍結(jié)，以提供功能不同的區(qū)域，分開保存完好，損壞標(biāo)本：在一個區(qū)域的冰形成，供應(yīng)增壓，而在第二區(qū)的試樣仍處于液態(tài)的環(huán)境和在高壓下提供適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)保護(hù)了基礎(chǔ)。
下面的報表顯示實現(xiàn)了與EM SPF-凍結(jié)和布氏錐蟲的寄生蟲致病的非洲昏睡病的隨后的冷凍替代的結(jié)果。 構(gòu)成該技術(shù)是一個挑戰(zhàn)，這個有機體稱為是出了名的難以維護(hù)以及為少數(shù)族裔被選定作為一個模型系統(tǒng)。 雖然這里介紹的協(xié)議可以提供一個起始點，不同樣本將需要額外的實驗以確定用于裝載樣品放入試管中，冷凍培養(yǎng)基的組成，并在用于浸漬速度和深度的儀器設(shè)定*佳條件。
圖3：顯示布氏錐蟲的鞭毛基部有絲分裂的開始高倍看法。 皮質(zhì)微管（c）和軸絲微管（a）中明顯的切線部分。
材料和方法
布氏錐蟲培養(yǎng)在懸浮液中以300g離心5分鐘。 除去上清液后，將100μl的沉淀再懸浮于1體積在DDH 2 O的20％BSA的 將懸浮液注入用20微升的移液管與切尖，直到它被完全填充，置換所有氣泡15.8毫米U型管。 該填充管，然后轉(zhuǎn)移至2毫升塑料管和離心弧下來與擺動出轉(zhuǎn)子（！）3分鐘在300克 在Leica EM SPF冷凍用的浸漬速度25毫米/秒，沒有浸沒延遲，浸沒深度6.7毫米執(zhí)行。（本文來源：徠卡顯微鏡布氏錐蟲的冷凍置換）
冷凍后，將管切成LN 2下2毫米段。 這些片段被轉(zhuǎn)移到冷凍替代媒體在-140℃下，含1％的OsO 4和0.1％醋酸鈾在無水丙酮。冷凍置換，進(jìn)行中的Leica EM AFS2用溫度程序如下：
-140°C
升溫至-90℃，增量為25°C /小時
-90℃下50小時
升溫至-54℃，增量為2℃/ h的
-54℃下8小時
升溫至-24℃，增量為5℃/ h的
-24℃下15小時
升溫至0℃，增量為48°C /小時
0℃下進(jìn)行2.5小時
樣品在0℃下洗滌3次，每次10分鐘，用無水丙酮 對樣品進(jìn)行滲透在瓊脂100樹脂（中等硬度），2:1，1:1，1:2，純樹脂用丙酮*過4天的過程中混合。 樹脂的聚合在60℃下24小時。
樣品修整用玻璃刀切片和70納米用金剛石刀。 在此之前，在80 kV的透射電子顯微鏡，切片進(jìn)行后染色用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛。