徠卡顯微鏡的新型光學結算方法允許整個組織的深層成像
圖像整體無腦切片？ 無需重建研究神經(jīng)回路？ 在不破壞細胞結構進行分子分型？ 了解大腦分子的分辨率和全球范圍內(nèi)一直面臨著挑戰(zhàn)。
小說CLARITY方法，由Deisseroth實驗室，斯坦福大學，美國開發(fā)，推動深部組織的成像大步前進的障礙。通過使老鼠大腦光學透明，同時保留了原生的分子結構，它現(xiàn)在很容易可以調(diào)查亞細胞結構，神經(jīng)網(wǎng)絡和生物分子甚至整個完整的器官的配合物。
圖1：三維澄清的小鼠大腦的渲染（Chung等人2013）。
腦成像方法至今
**為止，大腦的映射可能只在有限的方式。 由于光散射的組織，常規(guī)的深部組織成像由多光子顯微鏡被限制為約1mm的組織深度。 調(diào)查位于市中心大腦結構和蜂窩網(wǎng)絡時，樣品必須切片，研究了小卷。 單個神經(jīng)元的預測，需要遵循跨多個切片樣本。這是精心設計的。 新的工具正在不斷開發(fā)：自動切片方法減少繁瑣的工作，盡量減少組織損傷，以及新穎的軟件便于分析和重建。 然而，重建可能不總是可能的或足夠的神經(jīng)元回路的詳細分析。 使用有機溶劑的新的光學信息交換方法降低光散射和圖象更深的組織。 但這些方法離開脂質(zhì)雙層完好無損，那么他們?nèi)匀怀洚敂U散屏障。 光與大分子的整裝染色方法的普及率仍然有限。
如何實現(xiàn)大腦清晰
CLARITY（ 縮寫為清除脂質(zhì)交換丙烯酰胺雜交剛性成像/免疫染色/原位雜交，組織相容水凝膠 ）是簡單，因為它是輝煌的。 完整的組織被轉(zhuǎn)化為水凝膠組織的混合體。 類似于石化或僵化，組織的物理結構保持完好，并能防止崩解。 光散射脂質(zhì)被去除，而蛋白質(zhì)和核酸被保留，因為它們被共價連接到所述水凝膠的網(wǎng)格。
在*步驟中，所述組織是注入的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺，甲醛和一個熱敏啟動器，在4℃（圖2）。 甲醛交聯(lián)的組織并共價連接的單體的水凝膠的蛋白質(zhì)和核酸。 脂類和生物分子缺乏官能團不結合，因此，可以被刪除。 只有8％的蛋白質(zhì)是通過此方法失去了（相對于25?40％與傳統(tǒng)的定影和增溶）。 聚合是通過升高溫度至37℃。觸發(fā) 組織現(xiàn)在是一個水凝膠混合。 網(wǎng)格支持組織結構及其納米孔允許大分子進入。（本文來源：徠卡顯微鏡的新型光學結算方法允許整個組織的深層成像）
脂雙層是由電泳組織清算系統(tǒng)（ETC）除去。 在一個特制的電泳室，樣品被放置在一個離子型去污劑（4％SDS，十二烷基硫酸鈉）和一個施加電場。 高電荷離子的SDS膠束去除脂類積極。 ETC具有上述標準的有機溶兩大優(yōu)勢：
它不解渴熒光像許多有機溶劑。
去除脂類的快。 洗滌劑的被動擴散將需要長達幾個月徹底去除脂肪。
通過安裝澄清大腦中像甘油或FocusClear一個折射率指定的解決方案?的完整的大腦變得完全透明，并準備進行成像（圖2B）。
圖2：凈度方法的描述：步驟1：組織是在4℃下注入丙烯酰胺/雙丙烯酰胺，甲醛和一個熱敏啟動器 步驟2：甲醛交聯(lián)的組織并共價連接的單體的水凝膠的蛋白質(zhì)和核酸。 脂雙層是由電泳組織清算系統(tǒng)（ETC）除去。
整個成像的大腦
所有傳統(tǒng)的激光掃描顯微鏡技術是適合成像的凈度處理的組織，因為每個激發(fā)和發(fā)射波長可以穿透深入到組織中。
成像深度主要受限于物鏡的工作距離。 3.6毫米的客觀需要兩個大腦掃描：*背側半，然后腹側。 遠距離的物鏡，使圖像在一氣呵成的整體器官。 在神經(jīng)科學學會2013年會上，徠卡呈現(xiàn)*新的目標發(fā)展：一個特殊的CLARITY目標與機動修正衣領設計為全器官成像的*大成像深度，并與將在2014年成為可用的*高分辨率。
成像技術 | 一般原則 | 優(yōu)點 | 限制 |
單光子共聚焦顯微鏡 | 通過共焦激光共聚焦針孔去除失焦的光實現(xiàn) |
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雙光子顯微鏡 | 通過激勵的大約兩倍的波長的兩個光子 - 和一半的能量 - 必要單光子激發(fā)。 無針孔必需的。 |
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表1：適用于CLARITY成像技術。
新的可能性的世界
是什么讓CLARITY如此令人興奮的是，你可以調(diào)查任何你想要在一個單一的大腦。 蛋白質(zhì)復合物，基因表達分析，神經(jīng)回路 - 你不必來決定你想看到什么。 看著這一切，一前一后。
納米多孔水凝膠網(wǎng)狀透氣是大分子，并允許探頭的快速擴散。 抗體染色容易，即使是在多輪。 混合的穩(wěn)定框架允許抗體被淘汰用SDS。 相反，使用有機溶劑的常規(guī)方法洗脫，隨后染色的熒光是不滅的。 即使在連續(xù)3輪染色和去染色，沒有損失圖像質(zhì)量（圖3和視頻）。
因此能夠遵循通過大腦軸突突起長距離。 顯示配對前和突觸后蛋白的共定位甚至允許單個突觸的調(diào)查。 并采用經(jīng)典的熒光顯微鏡后，該組織仍然適用電子顯微鏡觀察細胞結構更加緊密。
該方法不限于新鮮的腦組織。 它也成功地用于長期固定的人尸檢腦組織或斑馬魚胚胎，開啟了新的可能性，研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或胚胎發(fā)育。
凈度給出了其結構和分子信息，并添加到大規(guī)模的完整的生物系統(tǒng)的理解。 總之，清晰度***的基礎研究。
圖3：小鼠海馬顯示EYFP表達神經(jīng)元（綠色），小清蛋白陽性神經(jīng)元（紅色）和GFAP（藍色）（Chung等人2013年）的三維視圖。