尼康顯微鏡Lambda堆棧的基本概念
類似的概念來(lái)使用的激光掃描共聚焦或解卷 積顯微術(shù)高數(shù)值孔徑物鏡較厚的標(biāo)本中獲得的光學(xué)部分 （ 或 z棧）中，lambda堆棧的三維數(shù)據(jù)集，它由使用相同的試樣場(chǎng)的圖像采集在不同的波長(zhǎng)帶，每一個(gè)橫跨有限的光譜區(qū)域范圍從2到20納米的獲取。 相反，在各種形式的光學(xué)顯微鏡的典型成像方案涉及在檢測(cè)器的整個(gè)波長(zhǎng)響應(yīng)頻帶獲取單個(gè)圖像（或一個(gè)連續(xù)組中的延時(shí)實(shí)驗(yàn)圖像）。 本教程探討一個(gè)lambda棧的頻譜分量。
教程初始化與在上左角隨著三重標(biāo)記的標(biāo)本表達(dá)靶向至細(xì)胞核，線粒體和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的探針的偽彩色圖像3熒光蛋白譜（ECFP，EGFP，EYFP和）的曲線圖元。 一疊拉姆達(dá)部分出現(xiàn)在左下方的角落。 為了操作的教程，使用LAMBDA堆棧深度滑塊從拉姆達(dá)棧，這是直接到堆棧的右側(cè)顯示在一個(gè)窗口檢查單個(gè)圖像。 另外，使用AUTO按鍵，通過(guò)堆棧自動(dòng)播放。 為不同的部分呈現(xiàn)，未混合和偽彩色版本被同時(shí)顯示在檢體圖像窗口和光譜上的箭頭指示的帶通區(qū)域的位置。
為了更好地理解在lambda棧的概念（通常也被稱為在文獻(xiàn)中作為圖像立方體或光譜立方體），在橫向維度圖像的單個(gè)像素的位置（具有坐標(biāo) x I，Y i）的沿波長(zhǎng)被檢查（Zλ）軸。 如圖1（a）中的像素的強(qiáng)度和/或顏色我分別改變?yōu)?a title='熒光' target='_blank' class='seolabel'>熒光發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度和波長(zhǎng)，一個(gè)函數(shù)，當(dāng)從拉姆達(dá)堆的一端到另一監(jiān)視。 通過(guò)繪制像素強(qiáng)度與波長(zhǎng)的線性圖（參見圖1（b）），特定的熒光團(tuán)在空間上位于像素的發(fā)光光譜曲線，我可以很容易地確定。 但應(yīng)注意的是，使用這種技術(shù)獲得的發(fā)射光譜的精確度和分辨率是聚集在不同的波長(zhǎng)帶，在各波長(zhǎng)帶中的納米的光譜寬度（較短的帶寬產(chǎn)生較高分辨率）的λ堆棧的圖像的數(shù)量的函數(shù)，所研究的樣品的物理質(zhì)量和檢測(cè)器的光子的靈敏度（量子效率）。
在使用具有重疊譜3熒光蛋白活細(xì)胞獲得的激光掃描共聚焦顯微鏡的lambda棧的一個(gè)真實(shí)世界的例子示于圖2。 在本實(shí)驗(yàn)中使用的熒光蛋白標(biāo)記物增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP從水母;發(fā)射*大值在507納米），增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP從水母;發(fā)射*大值在527納米），并Kusabira橙色（MKO的單體版本，發(fā)射*大值在561納米），從天然存在的珊瑚蛋白開發(fā)了一種高性能的探針。 在這種情況下，個(gè)別的lambda堆棧的圖像進(jìn)行掃描，在10納米的波段范圍為480至640納米（圖2（a）），以產(chǎn)生總共16個(gè)譜段的熒光蛋白的混合物。（本文來(lái)源：尼康顯微鏡Lambda堆棧的基本概念）
在lambda堆棧的*圖像顯示在480到490納米的發(fā)射范圍的樣品的光譜特征，而所述第二圖像包含從490到500納米的發(fā)射數(shù)據(jù)（請(qǐng)參閱圖2（b））。 注意，幾乎所有的前兩個(gè)拉姆達(dá)部分的熒光發(fā)射的來(lái)自EGFP的短波長(zhǎng)尾巴單獨(dú)只用從EYFP長(zhǎng)波長(zhǎng)段（490至500納米）的非常小的貢獻(xiàn)。 在接下來(lái)的兩節(jié)拉姆達(dá)（500?510納米和510到520納米），從EYFP的貢獻(xiàn)穩(wěn)步增加從EGFP達(dá)到一個(gè)平臺(tái)發(fā)射。 在520和550納米之間的λ3的部分，在EGFP信號(hào)逐漸減小，從EYFP發(fā)射的貢獻(xiàn)達(dá)到*大值在約530納米。 同樣，從MKO發(fā)射貢獻(xiàn)變成在帶540和550納米之間更顯著。 因此，在550到560納米波段，從熒光蛋白的相對(duì)貢獻(xiàn)是約10，25，和65％分別為EGFP，EYFP，和MKO。
排放貢獻(xiàn)來(lái)自EGFP和EYFP在*后的波段（560?640納米）成為削弱來(lái)自人民圣戰(zhàn)者組織占主導(dǎo)地位的排放。 在審查中，波段在拉姆達(dá)棧是由*短和*長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)光蛋白，EGFP和人民圣戰(zhàn)者組織，分別占主導(dǎo)地位的特征排放貢獻(xiàn)（480到500納米之間590到640納米之間）的極端。 在lambda棧（500至590納米）的中心的波長(zhǎng)帶包含代表來(lái)自三個(gè)熒光蛋白的一些貢獻(xiàn)的熒光發(fā)射。 如下面將要討論的那樣，該混合發(fā)射信號(hào)的整個(gè)拉姆達(dá)堆棧的波長(zhǎng)帶的分布可以從每個(gè)探針使用的參考發(fā)射光譜圖清楚地分離出單個(gè)的熒光蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)是線性非混合。