徠卡顯微鏡，GSDIM顯微鏡的原理
*高分辨率顯微鏡，如受激發(fā)射損耗（STED）和類似基態(tài)耗盡單分子基礎(chǔ)的技術(shù)其次是個(gè)別分子報(bào)表（GSDIM / dSTORM），PALM或STORM顯微鏡依賴于相同的原則，打破了衍射極限：不需要熒光信號(hào)在圖像采集過程中關(guān)閉。 因此，GSDIM顯微鏡采用熒光團(tuán)的亞穩(wěn)暗態(tài)的單分子的時(shí)空分離。 為了提高進(jìn)入黑暗狀態(tài)的概率，特別嵌入介質(zhì)在GSDIM顯微鏡的基礎(chǔ)性作用。 他們的優(yōu)化和替代標(biāo)簽和嵌入方法的發(fā)展將讓我們有機(jī)會(huì)進(jìn)一步利用這一激動(dòng)人心的*分辨方法的巨大潛力。 在這里，我們測(cè)試了安裝介質(zhì)的Vectashield?雙染色標(biāo)本進(jìn)行三維GSDIM適用性，這是此前證明了由Olivier等STORM顯微鏡
GSDIM顯微鏡的原理
的關(guān)鍵在于克服?200nm的衍射極限與GSDIM顯微鏡是打開和關(guān)閉的熒光基團(tuán)，因此其時(shí)間間隔的連續(xù)閉。 在這種情況下，熒光團(tuán)的電子積聚在亞，非熒光暗態(tài)（三重態(tài)和其他）應(yīng)用程序由一個(gè)高功率激光束的。從暗狀態(tài)，分子返回隨機(jī)到基態(tài)，進(jìn)入這是由顯微鏡檢測(cè)熒光的周期 - 即所謂的“閃爍”。 這些熒光事件被捕獲，然后隨著時(shí)間的推移。 為了獲得高分辨率的圖像，受衍射限制的事件是通過施加一個(gè)合適的算法讀出。 *后，*終的高分辨率圖像是通過繪制數(shù)千記錄事件（圖1）的測(cè)量位置的再現(xiàn)。
1A
1B
圖1：（A）在GSDIM成像過程數(shù)以百計(jì)的單幀圖像，他們每個(gè)人不同的顯示閃爍的事件，被捕獲隨著時(shí)間的推移，產(chǎn)生一個(gè)高解析度GSDIM形象。 該GSDIM單分子本地化過程（二）簡(jiǎn)化插圖。 為了打破衍射極限，每個(gè)閃爍事件的質(zhì)心具有通過施加一個(gè)合適的算法，以位于具有納米精度。一個(gè)明顯的衍射受限情況下，以一個(gè)高斯函數(shù);詳細(xì)地說，統(tǒng)計(jì)算法擬合的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（紅色圓錐PSF）確定單個(gè)分子的質(zhì)心坐標(biāo)。 中的一個(gè)，并且在同一分子中的n個(gè)閃爍事件的捕獲后，計(jì)算出的坐標(biāo)（插圖）作圖以重構(gòu)*分辨率GSDIM圖像投影（彩色編碼圓錐）。 越質(zhì)心重合，它們將出現(xiàn)在GSDIM圖像投影和更好他們會(huì)反映單個(gè)熒光團(tuán)的實(shí)際位置的更亮。
熒光團(tuán)之間的相互作用和包埋劑：影響定位精度的因素
與GSDIM技術(shù)的橫向分辨率降低到20納米，可以實(shí)現(xiàn)。在實(shí)踐中，*終的分辨率取決于單個(gè)熒光團(tuán)，它是依次由熒光團(tuán)的性質(zhì)和包埋介質(zhì)確定的定位精度。 下面的等式[3]表明，定位的精度依賴于由一個(gè)單獨(dú)的熒光發(fā)射收集的光子數(shù)量：
ΔR表示顯微鏡/物鏡的衍射極限，正由一個(gè)單獨(dú)的本地化熒光團(tuán)和ΔR發(fā)出的光子的數(shù)目短信的**熒光團(tuán)的定位精度。
*后，獲得*佳的定位精度的目的是直接關(guān)系到一個(gè)）*大化每熒光團(tuán)/事件發(fā)射的光子的數(shù)目和b）*大限度地提高熒光周期的*小光漂白的數(shù)量（=）的努力。 這些特性是由熒光團(tuán)的性質(zhì)的相互作用，影響暗狀態(tài)，因而閃爍性能的周圍嵌入介質(zhì)基本上影響。
在3D GSDIM更高的要求
在三維GSDIM系統(tǒng)的柱面透鏡被引入到顯微鏡的光路中。 所得到的光學(xué)散光導(dǎo)致那些閃爍事件不屬于在焦平面的橢圓。 這是上面的焦平面事件的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）是豎直細(xì)長的，而那些事件所下的焦點(diǎn)的PSF是水平伸長。 該軟件終于把每一個(gè)閃爍的事件具有鮮明的z坐標(biāo)。 顯而易見的是，這種方法需要一個(gè)良好校準(zhǔn)的采集每個(gè)閃爍事件和高定位精度。 因此，令人印象深刻的三維數(shù)據(jù)可以與一個(gè)優(yōu)化的嵌入方法（圖2）來獲得。
2A：微管廣角
微管廣角概述
微管廣角
2A：微管GSD
2B：線粒體廣角
線粒體廣角概述
線粒體廣角
2B：線粒體GSD
圖2：微管和線粒體的三維GSDIM高分辨率圖像
COS-7細(xì)胞（A）和假彩色編碼的MDCK細(xì)胞（B）的線粒體指示z位置0-800納米的微管。 細(xì)胞染色對(duì)αTubulin或ATP5B，都與AlexaFluor?647，并嵌入的Vectashield?/甘油三。為了進(jìn)行比較，寬視場(chǎng)圖像中所描繪的相應(yīng)三維*分辨率圖像的上方。 比例尺為10μm。
優(yōu)點(diǎn)和局限性 - 在GSDIM顯微鏡嵌入介質(zhì)
在GSDIM顯微鏡*重要的一步是讓幾乎所有的熒光團(tuán)進(jìn)入長期黑暗的狀態(tài)，這是依賴于特殊的嵌入介質(zhì)。 一些目前已知的介質(zhì)，如葡萄糖氧化酶混合或聚乙烯醇（PVA），降低的傾向在試樣分子氧的量。 氧作為一個(gè)三線態(tài)猝滅劑，從而減少了在三線態(tài)的熒光團(tuán)的量。 這是GSDIM*適得其反，因?yàn)槿貞B(tài)的一個(gè)重要途徑黑暗狀態(tài)。 因此，在三重態(tài)熒光人口減少間接導(dǎo)致的定位精度和*終解決一個(gè)損失，因?yàn)楦嗟臒晒馓幱凇伴_”的狀態(tài)與*分辨率圖像采集過程中的干擾。
相對(duì)于其他高解析度技術(shù)，GSDIM顯微鏡的一大優(yōu)勢(shì)是其受聘于普通光學(xué)顯微鏡方法標(biāo)準(zhǔn)的熒光基團(tuán)和常規(guī)染色方法的用法。熒光和包埋劑的只有結(jié)合導(dǎo)致的局限性。 然而，目前使用的GSDIM介質(zhì)已經(jīng)允許的范圍非常廣泛不同的熒光團(tuán)，甚至熒光蛋白的應(yīng)用。然而，他們都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)（圖3） 。 例如*常使用的介質(zhì)半胱胺或β-巰基乙醇胺（MEA）是適用于大量不同的熒光基團(tuán)，但不幸的介質(zhì)，必須用新鮮的和它的效率下降之后顯著6小時(shí)用量，從而導(dǎo)致減小的閃爍性能。 因此，尋找其他嵌入介質(zhì)和合適的熒光團(tuán)是要充分挖掘這一*高分辨率顯微鏡方法的巨大潛力的重要一步。
圖 3：在GSDIM顯微鏡不同的嵌入方法及其優(yōu)缺點(diǎn)概述。
Vectashield? -一種另類的3D GSDIM鏡包埋劑
在這種情況下奧利弗等人 能夠識(shí)別安裝介質(zhì)的Vectashield?（Vectorlabs?）作為dSTORM顯微鏡足夠嵌入介質(zhì)。在這里，我們測(cè)試了，如果這個(gè)新的嵌入方法可以為3D GSDIM顯微鏡采用和搜索優(yōu)勢(shì)相比，目前使用的介質(zhì)。 此外，我們進(jìn)行了系統(tǒng)的屏幕在使用的Vectashield?結(jié)合工作的其他熒光團(tuán)。
值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，熒光團(tuán)對(duì)AlexaFluor?647和AlexaFluor?555（Life Technologies公司?）顯示，該包埋劑優(yōu)異的性能與*高的定位精度在3D GSDIM優(yōu)良的閃爍性能。 這與奧利弗等人的研究結(jié)果一致。與AlexaFluor?647和AlexaFluor?555，我們能夠產(chǎn)生令人印象深刻的3D GSDIM數(shù)據(jù)（圖5）。 同的Vectashield?，AlexaFluor?647和AlexaFluor組合相比，目前使用的熒光團(tuán)配對(duì)像AlexaFluor?647和AlexaFluor?488在MEA或葡萄糖氧化酶混合?555甚至表現(xiàn)出***的性能閃爍。 這可以通過使用的Vectashield?或MEA分別為（圖4）進(jìn)行，并強(qiáng)調(diào)這種包埋劑的巨大潛力事件列表兩個(gè)閃爍的圖像的對(duì)比進(jìn)行可視化。
事實(shí)上，熒光一雙閃爍的性質(zhì)是不是這種媒介的*大優(yōu)勢(shì)：擁有的Vectashield處理標(biāo)本?/甘油三可在4℃存放數(shù)月沒有任何損失其優(yōu)良的閃爍性能（圖6）。
像它的相對(duì)強(qiáng)的自體熒光和由此產(chǎn)生的背景，尤其是在532 nm激光范圍的缺點(diǎn)，可以通過混合的Vectashield被削弱?與含緩沖甘油和50mM的Tris pH值8以1:10的比率。 以405nm的波長，它是用于增加熒光團(tuán)的熒光的周期數(shù)所謂backpumping激光，通常不是必需的，因?yàn)槠渚哂袃?yōu)異的的Vectashield?閃爍特性的任一AlexaFluor?647或AlexaFluor?555。 這也可以防止背景形成。
在我們進(jìn)一步的研究，以確定其他合適的熒光團(tuán)，我們發(fā)現(xiàn)，有趣的是，熒光蛋白EYFP可接受的閃爍性能堪比中葡萄糖氧化酶混合物的性能。
不幸的是，我們沒能找到其他的熒光團(tuán)，尤其是在488納米范圍內(nèi)，其中AlexaFluor?488和阿托?488沒有表現(xiàn)出預(yù)期的閃爍性能沒有。 至于仍然未經(jīng)測(cè)試的考生和越來越多的熒光基團(tuán)被特別設(shè)計(jì)用于*高分辨率顯微鏡的巨大數(shù)量，熒光團(tuán)的數(shù)量有限的缺點(diǎn)，肯定會(huì)被削弱的未來。 作為MEA的情況下，與的Vectashield?組合閃爍熒光團(tuán)的名單是肯定隨時(shí)間而不斷檢測(cè)生長。
激光 | 染料/熒光基團(tuán) | 閃爍 |
|---|---|---|
488納米 | AlexaFluor?488 | - |
阿托?488 | - | |
532納米 | AlexaFluor?532 | - |
AlexaFluor?546 | - | |
AlexaFluor?555 | + | |
AlexaFluor?568 | - | |
阿托?532 | - | |
羅丹明6G | - | |
EYFP | + | |
647 nm處 | AlexaFluor?647 | + |
標(biāo)簽1：驗(yàn)證熒光團(tuán)（也比較奧利維爾等人，列出的熒光團(tuán)是在COS-7細(xì)胞中嵌入的Vectashield?/甘油-三（1:10）通過ATP5B和αTubulin的免疫染色測(cè)試。 與Leica SR GSD 3D系統(tǒng)的閃爍行為進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
答：MEA
B：Vectashield?/甘油三
圖 4：MEA和的Vectashield?/甘油-三包埋標(biāo)本的單幀圖像比較。 AlexaFluor的事件列表中的單幀圖像?488染色ATB5B標(biāo)本在100毫米MEA在PBS pH值7.4（A）和AlexaFluor?555染色ATB5B標(biāo)本在1:10的Vectashield?/甘油三（B）。 相對(duì)于（A），AlexaFluor?中的Vectashield 555?/甘油三（B）具有大量的明亮，層次分明，互不重疊的閃爍事件。 這是一個(gè)先決條件，較高的定位精度。
5A：GSD（右）/廣角（左）對(duì)比
5B：GSD（左）/廣角（右）的比較
圖5：3D GSDIM高分辨率圖像 - 線粒體和微管的雙重染色。 COS-7細(xì)胞進(jìn)行染色對(duì)αTubulin和ATP5B與AlexaFluor?647和AlexaFluor?555分別。 標(biāo)本嵌入的Vectashield?/甘油三。 GSDIM的比較和卷積廣角3D堆棧。 微管（αTubulin）以紅色顯示為綠色和線粒體（ATP5B）。
6A
微管
線粒體
6B
微管
線粒體
圖6：三維高分辨率圖像比較：新鮮（A）與兩個(gè)月大（B）標(biāo)本。 在綠色微管和分別為紅色或假彩色編碼線粒體（A）3D GSDIM圖像，說明z位置。 如在圖5中，試樣中嵌入的Vectashield /甘油-TRIS。 （B）在圖5和圖6A中所用的試樣，在4℃保存2個(gè)月，然后再次成像，仍然嵌入的Vectashield?/甘油-TRIS。
染色方法
COS-7細(xì)胞培養(yǎng)一天，在精度蓋玻片（Marienfeld的-高級(jí)?），然后固定用冰冷的甲醇中。 用PBS含1％奶粉的1小時(shí)的塊后，將細(xì)胞溫育在1:100在PBS中的比率是針對(duì)ATP5B（圣克魯斯?）和α-微管蛋白（Sigma公司?）初級(jí)抗體2小時(shí)/奶粉。 標(biāo)注與AlexaFluor?647或AlexaFluor?555分別與*抗體，第二抗體在PBS中稀釋度為1:200孵育1小時(shí)。 除非奶粉塊中的每個(gè)步驟是伴隨著由四個(gè)洗滌步驟用PBS。
嵌入過程
如描繪在圖7中，細(xì)胞包埋在的Vectashield?/甘油-TRIS-緩沖液（的Vectashield?和甘油-Tris-緩沖液中以1:10的比例;甘油以50mM的Tris pH值8），如下所示：75-100μL培養(yǎng)基被放置在凹部滑動(dòng)的空腔。 然后將蓋玻片放置在低氣壓滑動(dòng)朝向介質(zhì)和抑郁癥的細(xì)胞。 在此步驟中，以避免任何氣泡是很重要的。 過量的介質(zhì)必須由濾紙去除，以確保雙組分硅氧烷Twinsil?是能夠正確地干燥。 Twinsil的黃色和藍(lán)色分量?為1:1混合，然后施加到蓋玻片的邊緣。 10分鐘后，聚硅氧烷硬化和試樣準(zhǔn)備好GSDIM成像。
圖 7：嵌入程序
展望
由單個(gè)熒光事件的區(qū)域或時(shí)間間隔打破了衍射障礙已經(jīng)徹底改變了光鏡。 在未來，不會(huì)有由于衍射極限更高的分辨率的限制，但顯微鏡與不斷減少的限制分辨率的發(fā)展揭示了新的挑戰(zhàn)，比如GSDIM顯微鏡的情況下，標(biāo)簽或嵌入介質(zhì)。 正如前面提到的，在所有的*分辨率方法的關(guān)鍵步驟是獲得熒光在黑暗的一面，這是基礎(chǔ)，良好的定位精度。 在GSDIM顯微鏡，這個(gè)過程主要是由包埋劑的存在所影響。 這里，嵌入介質(zhì)和熒光團(tuán)的性質(zhì)之間的相互作用是成功的高分辨率成像的決定性因素。
如今，我們擁有**的熒光團(tuán)配對(duì)像AlexaFluor?647和AlexaFluor?488在MEA或AlexaFluor?647和AlexaFluor中的Vectashield?555?/甘油-三，允許收購令人印象深刻的3D*分辨率圖像的兩種顏色。 在不久的將來我們與包埋劑的Vectashield?結(jié)合高效的熒光基團(tuán)的劇目是一定要通過不斷試驗(yàn)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)展。 再加上像STED顯微鏡等高分辨率技術(shù)，這會(huì)給我們細(xì)胞生命和它的生化調(diào)控的一個(gè)**的觀點(diǎn)。