尼康顯微鏡的目鏡測(cè)微尺校準(zhǔn)方法
與化合物的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行線性測(cè)量一般包括約25毫米下降到0.2微米，這是由*大視場(chǎng)直徑和分辨率的顯微鏡極限主要取決于上下邊界的長度范圍。 這種互動(dòng)式教學(xué)探討各種目鏡光罩用鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)的校準(zhǔn)，并演示了如何分劃板可以被用來確定線性試樣尺寸。
本教程初始化與水平刻度目鏡分劃板，有八個(gè)主要部門的規(guī)則（ 標(biāo)準(zhǔn)刻度分劃板），出現(xiàn)在疊加在一個(gè)階段微米在隨機(jī)選擇的物鏡放 大倍數(shù)視口。 操作教程，使用X-移動(dòng)和Y移動(dòng)滑塊操縱目鏡分劃板背后的鏡臺(tái)測(cè)微裁決。 載物臺(tái)微米平移分辨率的控制是由滑塊換算調(diào)整單選按鈕，這使粗 （默認(rèn)）和測(cè)微尺的精細(xì)定位規(guī)則畢業(yè)就這些光罩的決定。 之后，測(cè)微尺已被放置在粗模滑塊的分劃板的后面，點(diǎn)擊精細(xì)單選按鈕，并精心搭配的測(cè)微尺規(guī)則之一（*好是編號(hào)為100微米的間隔線）與目鏡的遠(yuǎn)左手定則掩模版（編號(hào)上的預(yù)設(shè)掩模版“0”）。
一旦分劃板和鏡臺(tái)測(cè)微裁決已經(jīng)對(duì)齊，用鼠標(biāo)點(diǎn)擊的疊加規(guī)則在目鏡分劃板的左手法則（標(biāo)記為“0”的規(guī)則）來建立一個(gè)校準(zhǔn)基準(zhǔn)。 紅色線（基線）將出現(xiàn)在光標(biāo)單擊鼠標(biāo)按鈕時(shí)位置。 接下來，將光標(biāo)移動(dòng)到另一個(gè)位置到基線的右側(cè)位置在位置分劃板和載物臺(tái)微米規(guī)則再次**對(duì)齊。 再次單擊鼠標(biāo)左鍵，然后第二紅線（校準(zhǔn)線）將出現(xiàn)。 基線和校準(zhǔn)線之間的距離（以微米為單位）將在一個(gè)黃色的盒子題為測(cè)微尺長度顯示在視口的下部右側(cè)。 同時(shí)，計(jì)算出的值（也微米）主要分劃板的裁決之間（有權(quán)光罩分區(qū) ）會(huì)在一個(gè)黃色的盒子出現(xiàn)在視口的下部左側(cè)。 后者的值現(xiàn)在可以被用來測(cè)量樣品的尺寸。
后光罩已經(jīng)校準(zhǔn)，點(diǎn)擊標(biāo)本單選按鈕，位于視口的上部右側(cè)，并且標(biāo)本將出現(xiàn)在視口中（從選擇A試片下拉菜單中選擇）。 為了測(cè)量試樣的功能，對(duì)準(zhǔn)特征的邊緣上使用的X翻譯和y平移滑塊目鏡分劃板（標(biāo)記為“0”的規(guī)則）的左手法則。 接下來，單擊標(biāo)本特征的相對(duì)邊緣的鼠標(biāo)光標(biāo)進(jìn)行測(cè)量。 被測(cè)樣品的尺寸（以微米）將在一個(gè)黃色的盒子題為標(biāo)本測(cè)量出現(xiàn)在視口的下部右側(cè)。 一個(gè)新的標(biāo)本可以使用相同的校準(zhǔn)（和物鏡放大倍數(shù)）從選擇A試片下拉菜單中選擇一名候選人進(jìn)行測(cè)量。 為了提高分劃板的可見性，當(dāng)它疊加在一個(gè)標(biāo)本，選擇一個(gè)新的標(biāo)線顏色（紅色是默認(rèn)值）從光罩顏色下拉菜單（選擇有黑色，白色，紅色和黃色）。
另一個(gè)物鏡/目鏡分劃板校準(zhǔn)可以通過從物鏡放大倍數(shù)下拉菜單中選擇不同的放大倍數(shù)進(jìn)行。此外，一個(gè)新的掩模版可以從以下選擇一個(gè)光罩菜單中選擇。 無論這些行動(dòng)（選擇一個(gè)新的放大或新標(biāo)線）將重新初始化教程，使訪問者再掀校準(zhǔn)。
線性掩模版（標(biāo)準(zhǔn)比例，十字準(zhǔn)線，風(fēng)車）用于線性測(cè)量，而電網(wǎng)光罩（方格網(wǎng)格，計(jì)數(shù)網(wǎng)格，同心圓，和米勒平方）被用于顆粒計(jì)數(shù)。 后者光罩也可校正在上述用于線性測(cè)量的方式。 該測(cè)厚儀掩模版是用于比較的纖維和顆粒的相對(duì)尺寸是有用的。 這是刻線對(duì)準(zhǔn)規(guī)則集編號(hào)20與載物臺(tái)上的測(cè)微尺刻度校準(zhǔn)。
目鏡分劃板（確定的測(cè)微尺刻度的關(guān)系）對(duì)特定物鏡的校準(zhǔn)通常按照以下描述的建議過程（參見圖1）進(jìn)行。 注意，只對(duì)特定的物鏡/目鏡組合被測(cè)試，并且在顯微鏡的特定機(jī)械管長度的目鏡標(biāo)線片的那個(gè)校準(zhǔn)成立。 為了避免不必要地重復(fù)該過程，為每個(gè)組合的校準(zhǔn)信息應(yīng)記錄，并存儲(chǔ)在附近的顯微鏡工作站一個(gè)方便的位置。
后確保顯微鏡對(duì)準(zhǔn)并配置為科勒照明，插入適當(dāng)?shù)难谀０娴斤@微鏡目鏡和使玻璃分劃板盤的表面上的刻刻度顯示清晰地聚焦調(diào)整眼透鏡。 仔細(xì)檢查分劃板的方向，以確認(rèn)位置上方或下方的刻線數(shù)量也不予轉(zhuǎn)回。 這個(gè)任務(wù)可以通過按住目鏡在明亮的光源前，通過眼睛盯著鏡頭來完成。 *后，調(diào)整顯微鏡雙目瞳孔間距和以后測(cè)量記錄此值。 如果該顯微鏡配備有補(bǔ)償在兩個(gè)目鏡調(diào)整（如大多數(shù)現(xiàn)代顯微鏡的情況下），掩模版的校準(zhǔn)值將是正確的任何瞳孔間距。
放置鏡臺(tái)測(cè)微顯微鏡載物臺(tái)上，并把微米尺度成焦點(diǎn)采用顯微鏡粗微調(diào)焦控制旋鈕。檢測(cè)規(guī)模，將其轉(zhuǎn)換為視場(chǎng)的中心是通過采用低倍率的物鏡促進(jìn)先找到周圍的刻度圈，然后規(guī)模本身。 環(huán)包圍微米尺度是用肉眼可見的，因此應(yīng)該使用來定位微尺在顯微鏡光路中（*階段孔徑）的中心。 此外，幾個(gè)階段微米設(shè)計(jì)有刻從戒指到規(guī)模，這也有利于在使用高倍率的物鏡定位時(shí)規(guī)模的邊緣線。 旋轉(zhuǎn)的預(yù)期物鏡到位，并確保兩個(gè)秤（臺(tái)測(cè)微尺和目鏡分劃板）是在同時(shí)進(jìn)行重點(diǎn)視場(chǎng)可見。
翻譯階段，使用x - γ運(yùn)動(dòng)控制旋鈕或手柄，和/或旋轉(zhuǎn)目鏡（及其分劃板），以使兩個(gè)尺度成平行排列（圖1（a）和1（b））。 現(xiàn)代機(jī)械階段通常具有圍繞顯微鏡光軸的有限度的轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)。 在這種情況下，松開翼形螺釘（通常位于載物臺(tái)的前部，將試樣臺(tái)的下方）并旋轉(zhuǎn)階段，直到微米和目鏡標(biāo)線片是平行的。
直接定位在目鏡標(biāo)線片在微米（與階段控制）和對(duì)齊的分劃板上的左手定則與1的長，編號(hào)臺(tái)上微米（100微米）的分割線（圖1（b））。 根據(jù)不同的物鏡倍率和目鏡場(chǎng)直徑，距離150微米和4毫米（階段微米尺度的長度的兩倍）之間的范圍內(nèi)將是可見的目鏡。 在100至1000微米（10至100規(guī)則）在載物臺(tái)微米的距離，確定兩個(gè)點(diǎn)在哪個(gè)分劃板和微米尺度完全匹配（參見圖1）。 為了獲得*準(zhǔn)確的測(cè)量，利用兩個(gè)尺度上的*大可能范圍劃分的。 只有偶爾做掩模版和鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)的刻度重合在其整個(gè)長度在目鏡可見，但是這往往與制造用于特定目鏡標(biāo)線片的情況。 *后，確定目鏡規(guī)模參照載物臺(tái)微米的分歧明顯的長度。
為正在使用的物鏡的測(cè)微尺的值可以通過將階段微米的選擇區(qū)域的已知長度的目鏡刻度的分割數(shù)對(duì)應(yīng)的計(jì)算。 其結(jié)果將產(chǎn)生每刻度上的分劃板刻度為物鏡的距離，一個(gè)量通常被稱為校準(zhǔn)常數(shù) 。 疊加在一臺(tái)測(cè)微尺在圖1的標(biāo)線片（b）示出標(biāo)記20的左手法則（標(biāo)記為0）上的分劃板與鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)師的對(duì)準(zhǔn)。 這兩個(gè)規(guī)則的重疊是由紅線清晰顯示。 發(fā)生重疊的下一個(gè)區(qū)域，在載物臺(tái)上的測(cè)微尺標(biāo)有30的規(guī)則與目鏡分劃板的7.5馬克一致。 因此，該階段微米的100微米的區(qū)域等于7.5分劃板的分裂。目鏡標(biāo)線片的各劃分，因此，對(duì)應(yīng)于13.3微米，對(duì)于特定的物鏡/目鏡組合被校準(zhǔn)。適當(dāng)?shù)姆謩澃逍?zhǔn)計(jì)算顯著數(shù)字的數(shù)量應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)的審查。 因?yàn)樵诠鈱W(xué)顯微鏡的*小可分辨距離約為0.2微米（在*佳情況下），低于該值的線性測(cè)量，不能精確地確定。
進(jìn)行精確測(cè)量時(shí)使用配備有變焦光學(xué)系統(tǒng)的顯微鏡，有必要使用一個(gè)階段微米，以顯微鏡各變焦設(shè)定。 雖然許多顯微鏡變焦環(huán)和控制旋鈕都畢業(yè)于名義物鏡放大倍數(shù)，這幾乎是不可能的變焦控制返回完全相同的位置，一個(gè)必要條件精確測(cè)量。
后在目鏡標(biāo)線片已校準(zhǔn)的階段測(cè)微尺，試樣的線性尺寸均可測(cè)量。 所有測(cè)量，*高放大倍數(shù)的物鏡應(yīng)選擇使感興趣的整個(gè)標(biāo)本的功能下降光罩規(guī)模的跨度之內(nèi)。 東方的光罩尺寸與試樣地區(qū)備受矚物鏡輪廓相吻合。 接著，將試樣轉(zhuǎn)移至左邊緣帶編號(hào)的行中的目鏡標(biāo)線片重合，并且計(jì)數(shù)由物鏡區(qū)域跨越尺度分割數(shù)。 仔細(xì)估算師的任何部分。 為了提高精度，開展對(duì)大型樣品多次測(cè)量。 當(dāng)圓形或橢圓形的樣品被測(cè)量（如血細(xì)胞，酵母，細(xì)菌等），記錄至少20名來自不同域的尺寸。 正在研究在圖1（c）的試樣是人類的頭皮頭發(fā)軸，它是在直徑約93微米（測(cè)量與校準(zhǔn)的標(biāo)線片，如上面所討論的）。
剛才所描述的校準(zhǔn)過程必須，當(dāng)然，可以重復(fù)每個(gè)物鏡要被用于線性測(cè)量。 應(yīng)當(dāng)指出的是放大倍數(shù)由幾百分之刻有相同的放大倍數(shù)（例如，10倍）相似物鏡（即使來自同一制造商）而變化，所以每一個(gè)物鏡應(yīng)該被獨(dú)立地計(jì)算。 如果顯微鏡是經(jīng)常與許多不同的物鏡時(shí)，它可能會(huì)更方便繪制校準(zhǔn)曲線以圖形形式的每一個(gè)物鏡。 這提供了一種簡(jiǎn)單的機(jī)制來快速確定而與顯微鏡的工作，而無需對(duì)所有的用于進(jìn)行測(cè)量的物鏡施加微米的值時(shí)，重復(fù)運(yùn)算的特征尺寸。
上述的校準(zhǔn)程序提供的一個(gè)因素，其有效期為一個(gè)特定的光學(xué)組合，而不需要實(shí)際的物鏡放大倍率，通常不同于壓印在物鏡鏡筒的額定功率的知識(shí)。 在利用包含修正衣領(lǐng)，以適應(yīng)變化的蓋玻片厚度的物鏡，是要記住重要的是與衣領(lǐng)的不同設(shè)置的放大率的變化。 因此，確定這樣一個(gè)物鏡的校準(zhǔn)系數(shù)只適用于用于校準(zhǔn)校正衣領(lǐng)設(shè)置。 物鏡具有可調(diào)整的套環(huán)，適用范圍廣的蓋玻片的厚度提供校正，但也表現(xiàn)出倍率變化到高達(dá)15％，在整個(gè)調(diào)整范圍。