徠卡顯微鏡，簡(jiǎn)介冷凍置換
冷凍取代是脫水的過(guò)程中，在溫度足夠低的執(zhí)行，以避免冰晶的形成和規(guī)避后常溫脫水觀(guān)察到有害的作用。 在冷凍取代的“凍結(jié)”的水是由一種有機(jī)溶劑，它通常還含有化學(xué)固定劑溶解。細(xì)胞成分（冷凍固定）和樹(shù)脂包埋的冷凍替代鏈接的即時(shí)物理固定。 一旦置換完成后，樣品被逐步回暖，并進(jìn)一步作為常規(guī)方法制備的樣品進(jìn)行處理。 成功的低溫定影接著FS表示微細(xì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)異保存相比，化學(xué)固定技術(shù)在有機(jī)溶劑中和水合層周?chē)纳锓肿拥淖兓拇蠓肿泳酆峡梢栽诜浅５偷臏囟认掳l(fā)生，即使，但它是合理的假設(shè)，F(xiàn)S在溫度低于特定閾值保留水化殼
該技術(shù)還提供了檢查厚（200-300納米的部分）的樣本由ET，使得相對(duì)大的細(xì)胞量可以在3D進(jìn)行研究的可能性。 這種方法是非常有益的不同細(xì)胞器和隨機(jī)發(fā)生的事件之間的復(fù)雜關(guān)系的理解。
圖 1：酵母（釀酒酵母）。 禮貌面包車(chē)Donselaar EG，Humbel獸王，烏得勒支大學(xué)，荷蘭;插槽JW，大學(xué)醫(yī)療中心，烏得勒支，荷蘭。
高壓電子顯微鏡凍結(jié)，凍結(jié)取代擬南芥根尖細(xì)胞
禮貌：德Rycke?
協(xié)議HPF - AFS的形態(tài)分析
擬南芥根（突變PIN1pro：PIN1-GFP; bex5-1）切下，浸漬于20％（重量/體積）BSA和在高壓冷凍機(jī)（Leica EM PACT）立即冷凍。
冷凍置換進(jìn)行中含1％雙蒸2 O，1％的OsO 4和0.5％戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS2：
-90℃下放置24小時(shí)，
每小時(shí)增加2℃，15小時(shí)，
-60℃下放置24小時(shí)，
每小時(shí)增加2℃，15小時(shí)，和
-30℃下放置24小時(shí)。
然后將樣品洗滌3次，在純丙酮在-30℃，0℃，并緩慢升溫至4℃，滲透逐步3天以上，在4℃中的Spurr的樹(shù)脂和嵌入在膠囊中。 在70℃下進(jìn)行16小時(shí)的聚合反應(yīng)。
超薄切片用超薄切片機(jī)（Leica EM UC6）在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20進(jìn)行40分鐘的醋酸雙氧鈾在20°C和檸檬酸鉛10分鐘 網(wǎng)格被看作用JEM 1010透射電子顯微鏡（ 日本電子 ，東京，日本）使用成像板技術(shù)從80千伏運(yùn)行Ditabis （德國(guó)Pforzheim）。
高壓免疫電鏡冷凍和冷凍取代的小鼠心臟
禮貌：德Rycke?
協(xié)議HPF - AFS小鼠心臟IEM
從野生型（WT）和αT-連環(huán)KO（KO）小鼠的小鼠心臟組織中切下，浸漬于20％（重量/體積）BSA和在高壓冷凍機(jī)（Leica EM PACT）立即冷凍。 冷凍置換進(jìn)行中含有2％雙蒸2 O和0.1％戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS：
-90℃下放置24小時(shí)，
每小時(shí)增加2℃，15小時(shí)，
-60℃下放置24小時(shí)，
每小時(shí)增加2℃，15小時(shí)，和
-30℃下放置24小時(shí)。
然后將樣品洗滌3次，在純丙酮在-30℃，0℃，并緩慢升溫至4℃，滲透逐步3天以上，在4℃在LR-White和嵌入在膠囊中。 用紫外燈超過(guò)6天，開(kāi)始于20°C和37°C。在結(jié)束徠卡EM AFS進(jìn)行聚合
超薄切片用超薄切片機(jī)（Leica EM UC6）在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20進(jìn)行40分鐘的醋酸雙氧鈾在20°C和檸檬酸鉛10分鐘
網(wǎng)格被看作用JEM 1010透射電子顯微鏡（ 日本電子 ，東京，日本）使用成像板技術(shù)從80千伏運(yùn)行Ditabis （德國(guó)Pforzheim）。
免疫標(biāo)記和標(biāo)簽進(jìn)行量化如前所述進(jìn)行
以下主要抗體用于免疫EM：
Cx43蛋白多克隆兔（1:50; Sigma）和
結(jié)蛋白多克隆兔（1:50; Abcam公司）。
在Li等人的文章還有其他的圖像顯示，為鞭策'的樹(shù)脂和HM20（與徠卡HPM010）處理（與徠卡EM PACT與leica EM AFS），但是這是沒(méi)有問(wèn)題的，我們的協(xié)議在這里說(shuō)明一下的是為顯示圖像。
圖3：Cx43蛋白銀擴(kuò)增從αT-catenin的KO小鼠心臟的閏盤(pán)（ICD）的代表縫隙連接單免疫標(biāo)記。
圖4：Cx43蛋白銀擴(kuò)增從野生型小鼠心臟的閏盤(pán)（ICD）的代表縫隙連接單免疫標(biāo)記。
圖 5：結(jié)蛋白在從αT-catenin的KO小鼠心臟一橋粒單免疫標(biāo)記。
圖6：結(jié)蛋白在從αT-catenin的KO小鼠心臟一橋粒單免疫標(biāo)記。
Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體
禮貌：Kaech一
協(xié)議
Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體的培養(yǎng)在碳包覆6毫米藍(lán)寶石光盤(pán)。 細(xì)胞呈高壓使用6毫米CLEM中板與下面的設(shè)置凍結(jié)在徠卡EM HPM100：藍(lán)寶石光盤(pán)細(xì)胞，墊片200微米，裸藍(lán)寶石圓盤(pán)，2墊片200微米。 乙醇被用作同步液在室溫下冷卻之前的壓力傳遞。 冷凍后，將藍(lán)寶石圓片從中間板的無(wú)水丙酮除去在-90℃，并立即轉(zhuǎn)移到含有2％的OsO 4的無(wú)水丙酮2ml的Eppendorf管中，預(yù)冷至-90℃的徠卡EM AFS2凍結(jié) - 替換單元。
樣品被取代
在-90°C 8 H，
在-60℃下8小時(shí)，
在-30℃下8小時(shí)，并
在0℃下1小時(shí)
與周期性溫度變化30℃/ h的梯度。 然后將樣品洗滌兩次，用無(wú)水丙酮在4℃下，浸漬于33％的Epon /愛(ài)牢達(dá)在無(wú)水丙酮中，在4℃過(guò)夜，然后66％的Epon /愛(ài)牢達(dá)在無(wú)水丙酮中，在4℃下進(jìn)行6小時(shí)，最后在100％的Epon /愛(ài)牢達(dá)在室溫下攪拌2聚合之前小時(shí)60℃下在1.5ml的Eppendorf管中至少24小時(shí)。 切片進(jìn)行染色后，用醋酸鈾和檸檬酸鉛。
注意：使用乙醇作為在高壓冷凍同步流體是沒(méi)有必要的藍(lán)寶石圓盤(pán)細(xì)胞培養(yǎng)單層。 一個(gè)簡(jiǎn)化的夾層結(jié)構(gòu)可用于通過(guò)將藍(lán)寶石圓盤(pán)中的CLEM中間板與細(xì)胞面朝上覆蓋有鋁試樣載體浸漬在1 - 十六碳烯與100μm的空腔面向所述細(xì)胞以提供類(lèi)似的結(jié)果。
圖。 7：Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體，概述的薄截面。 N，核，怒族，核仁;在，包容。 比例尺為5μm。
圖。 8：高倍列入細(xì)胞在圖1所示。 C，肺炎衣原體細(xì)胞，G，糖原顆粒;去，高爾基體，M，線(xiàn)粒體;山，微管，R，核糖體，V，囊泡。 比例尺為500nm。
圖。 9：Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 概述。 N，核，怒族，核仁，NP，Nucleopores，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為2μm。
圖。 10：Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 更高的放大倍率在圖3中選擇區(qū)域。 A，肌動(dòng)蛋白細(xì)絲; MB，Mulitvesicular體;萬(wàn)噸，微管，N，核，NP，Nucleopores，R，核糖體，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為1μm。
圖。 11：Hep-2細(xì)胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 更高的放大倍率在圖4中選擇區(qū)域。 CP，網(wǎng)格蛋白包被坑，山，微管，R，核糖體，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為200nm。
更多應(yīng)用程序映像
禮貌：面包車(chē)Donselaar EG，Humbel獸王，烏得勒支大學(xué)，荷蘭;插槽JW，大學(xué)醫(yī)療中心，烏得勒支，荷蘭
圖。 12-14：鼠標(biāo)軟骨
圖。 15：肝HepG2細(xì)胞
圖。 16：酵母