奧林巴斯顯微鏡，反卷積顯微鏡的算法

 在過去的十年里，各種簡單和復雜的算法已經(jīng)發(fā)展到協(xié)助顯微鏡在從數(shù)字圖像去除模糊。 *普遍使用的算法的卷積在光學顯微鏡可分為兩大類： 去模糊和圖像復原 。 去模糊算法基本上二維的，因為它們適用于操作面，由面內的每個二維三維圖像棧的平面。 與此相反，因為它們在一個三維圖像堆棧同時操作上的每一個像素的圖像恢復算法被適當?shù)胤Q為“三維”。

在繼續(xù)之前，有幾個專業(yè)術語必須被定義。 的對象指的是光在視顯微鏡的字段由熒光發(fā)射結構的三維圖案。RAW圖像是指從顯微鏡獲得的未處理的數(shù)字圖像或圖像棧。 的圖像中感興趣的特定區(qū)域被稱為特征 。

去模糊算法

雖然通常被稱為近鄰 ， 多鄰居 ， 無鄰居 ，和反銳化掩模常用算法基本上是二維的，它們被歸類為這個討論， 去模糊算法的目的。 作為一類，這些算法適用于操作面，由面內的每個二維三維圖像棧的平面。 例如，*近鄰算法運行在z平面通過模糊相鄰平面（Z + 1和z - 1，用數(shù)字模糊濾波器），然后從z平面中減去模糊的平面。 多鄰居的技術擴展這個概念飛機的用戶可選擇的數(shù)字。 一種三維堆疊是通過應用該算法的每一個平面的協(xié)議棧進行處理。 在這種方式中，模糊的估算值是從每個平面中移除。 圖1給出了從光學部分的三維堆疊中選擇一個單一的焦平面，前處理（圖1（a）），以及去卷積通過*近鄰算法（圖1（b））之后。 從非洲爪蟾的制備細胞染色微管購入的數(shù)據(jù)。

去模糊算法是計算經(jīng)濟，因為它們涉及對單個圖像平面表現(xiàn)相對簡單的計算。 但是，有幾個主要的缺點這些方法。 首先，從幾架飛機噪聲相加。 第二，去模糊算法去除模糊的信號，從而降低整體信號電平。 三，功能特點的點擴散函數(shù)特別z平面重疊可在飛機，他們并不真正屬于進行銳化（實際上，特征明顯位置可能會改變）。 去模糊單個二維圖像時，因為它們常常包含來自將被削尖，好像他們是在焦平面上的其它結構的衍射環(huán)或輕這一問題尤為嚴重。 綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，去模糊算法提高對比度，但他們這樣做在降低信號噪聲比為代價，也可能引入的圖像中的結構構件。

二維去模糊算法可能是在一個快速去模糊操作是必要的，或當電腦的電源是有限的情況下非常有用。 這些例程在具有熒光結構離散分布，特別是在z軸標本效果*好。 然而，簡單的去模糊算法誘導像素的相對強度偽跡的變化，應謹慎（或*好，一點都適用），以目的地為形態(tài)的測量，定量熒光強度測量，并且強度比計算的圖像被應用。

圖像復原算法

在反卷積顯微圖像復原算法的主要功能是處理模糊的三維問題。 而不是減去模糊的，他們試圖重新分配模糊的光，以適當?shù)膶刮恢谩?/span> 這是通過反轉所固有的成像系統(tǒng)中的卷積運算進行的。 如果成像系統(tǒng)被建模為與點擴展函數(shù)的對象的卷積，然后將原始圖像的去卷積應該恢復的對象。 然而，該對象不能被完全因為固有的成像系統(tǒng)的基本限制和圖像形成模型的恢復。 可以做的*好的是估計給定的這些限制的對象。 恢復算法估計的對象，以下，該對象的一個好的估計是1，當與點擴展函數(shù)的卷積，產生原始圖像的邏輯。

此制劑的優(yōu)點在于，在大矩陣（如三維圖像棧）的卷積操作，可以計算非常簡單地使用傅立葉變換的數(shù)學技術。 如果圖像與點擴散函數(shù)被變換成傅立葉空間中 ，該圖像由點擴展函數(shù)的卷積可以簡單地乘以它們的傅立葉變換來計算。 然后將得到的傅立葉圖像能重新轉化成真實的三維坐標。

逆濾波算法

待開發(fā)的*個圖像去卷積算法被稱為逆濾波器 。 這種過濾器，隨著他們的堂兄弟的正規(guī)化逆濾波器 ，已自20世紀60年代受聘于電子信號處理，并首次應用到圖像上世紀70年代末。 在大多數(shù)圖像處理軟件程序，這些算法去了各種各樣的名字，包括維納去卷積 ， 正則化*小二乘法 ， 線性*小二乘 ，和吉洪諾夫-米勒正規(guī)化 。

通過拍攝圖像的傅立葉變換，并通過傅立葉分割的逆濾波器函數(shù)變換的點擴散函數(shù)的。 因為在傅立葉空間中劃分是反卷積在實際空間中的等價物，這是為了扭轉產生的模糊圖像的卷積的*簡單的方法。 的計算是快速的，約快如上面所討論的二維去模糊的方法。 然而，這種方法的實用性是由噪聲放大的限制。 在傅立葉空間劃分，在傅立葉噪音小的變化變換通過除法運算放大。 其結果是，模糊消除受到損害作為對在噪聲增益的折衷。 此外，被稱為振鈴神器可以推出。

噪聲放大和振蕩可以通過使左右，導致了該圖像的對象的結構的一些假設被減小。 例如，如果對象被認為是相對平滑的，嘈雜的解決方案具有粗糙的邊緣可以被消除。 這種方法被稱為正規(guī)化 。 正則逆濾波器可以被描述為適用某一種約束就可能估計，給出關于對象的一些假設的統(tǒng)計估算：在這種情況下，平滑度。 在光滑的約束使得算法來選擇一個合理的估計出大量可能出現(xiàn)，因為噪音變異可能估計。

正則可以在一個步驟中施加于逆濾波，或者可以重復地被應用。 其結果通常是平滑（剝離了更高的傅立葉頻率）。 多的圖像中被移除的“粗糙度”的發(fā)生在傅立葉頻率遠遠*出了分辨率極限，因此，該方法不消除記錄的顯微鏡的結構。 然而，因為有詳細的損失的電位，反向濾波器的軟件實現(xiàn)通常包括一個可調節(jié)的參數(shù)，使得控制平滑和噪聲放大之間的折衷的用戶。

約束迭代算法

為了提高逆濾波器的性能，各種附加的三維算法可以應用于圖像恢復的任務。 這些方法被統(tǒng)稱為約束的迭代算法 ，并工作在連續(xù)循環(huán)（因此，術語“迭代”）。 此外，這些算法通常也適用于可能的解決方案，這不僅有利于減少噪聲和其他失真，而且還增加了電源恢復模糊信號的限制。

一個典型的約束迭代算法操作如下。 首先，對象的初始估計被執(zhí)行，它通常是將原始圖像本身。 估計，然后用點擴散函數(shù)的卷積，和由此產生的“模糊預測”與原來的原始圖像進行比較。 這種比較是用來計算，代表有類似的模糊估計是原始圖像的誤差標準。 通常被稱為品質因數(shù) ，該誤差準則，然后用于改變的估計值以這樣一種方式，該誤差減小。 一種新的迭代然后發(fā)生：新的估計是卷積的點擴散函數(shù)，一個新的誤差準則計算，依此類推。 *佳估計將是一個*小化的誤差標準。 作為算法的進行，每次誤差準則被確定為不被*小化時，新的估算，再次模糊，誤差準則重新計算。 重復整個過程，直到誤差準則*小化或達到定義的閾值。 *終恢復的圖象可以是在*后一次迭代的對象的估計。

在圖2中所給出的數(shù)據(jù)從含有70光學切片的三維圖像堆棧被采納，并通過單一XLK2細胞記錄，以0.2微米的間隙。 一個寬視場成像系統(tǒng)，搭載了高數(shù)值孔徑（1.40）油浸物鏡，被用來采集圖像。 左側圖像（圖2（a）所示，標記的原始數(shù)據(jù) ）是從三維堆疊采取任何數(shù)據(jù)處理的應用程序之前，單個焦平面中。 通過去模糊*近鄰點算法產生的圖像中顯示的結果標記為*近鄰 （圖2（b））。 第三圖像（圖2（c）中， 老式 ）示出恢復由一個商業(yè)銷售約束的迭代解卷積軟件產品的結果。 既去模糊和恢復提高對比度，但在信號與噪聲的比率是顯著較低的去模糊的圖像比在恢復圖像。 在圖2（c）中的標尺表示2微米的長度，并且將箭頭（圖2（a））表示的線圖在圖4中呈現(xiàn)的位置。

大部分的算法目前應用于光學圖像的反卷積從顯微鏡納入約束允許的估計范圍。 通常使用的約束被平滑化或正則化，如上面所討論的。 隨著迭代過程中，算法將趨于放大噪音，因此大多數(shù)實現(xiàn)抑制這種與平滑或正則過濾器。

另一種常見的限制是非負性 ，這意味著，在估計該迭代過程中變?yōu)樨摰娜魏蜗袼刂当蛔詣釉O置為零。 像素值經(jīng)常可以變成負的算法中進行傅立葉變換或減法運算的結果。 非負約束是現(xiàn)實的，因為對象不能有負面的熒光。 它本質上是可能的估計值約束，考慮到我們的對象的結構的知識。 其它類型的約束，包括邊界約束的像素飽和，對噪聲統(tǒng)計的約束，和其他統(tǒng)計的約束。

經(jīng)典算法約束迭代反卷積

約束迭代反卷積算法，在顯微鏡拍攝的圖像中*個應用程序是基于對楊松-范Cittert（JVC）的算法，首先開發(fā)用于光譜應用程序的過程。 阿加德后來在一個具有里程碑意義的一系列調查修改這個算法的數(shù)字顯微鏡圖像分析。 商業(yè)公司如Vaytek，智能成像創(chuàng)新，應用精密，卡爾蔡司，和位面目前市場阿加德的改進算法的各種實現(xiàn)。 此外，幾個研究小組已經(jīng)開發(fā)已經(jīng)銷售的Vaytek和Scanalytics一個正規(guī)化的*小二乘方*小化方法。 這些算法利用一個加法或乘法誤差準則來更新估計在每一次迭代。

統(tǒng)計迭代算法

迭代算法的另一個家庭使用從統(tǒng)計理論。 可能性 ，概率的反向變化，采用*大似然估計（MLE），并期望*大化（EM）借來概率誤差準則由SVI，位平面，即興，卡爾實施市售算法蔡司和Autoquant。 *大似然估計是在科學的許多分支應用的普及統(tǒng)計工具。 一個相關的統(tǒng)計度量，*大熵（ME -不要與期望值*大化，EM混淆）已經(jīng)在圖像去卷積實施由卡爾蔡司。

統(tǒng)計算法比傳統(tǒng)方法更密集計算，可以采取顯著更長的時間才能達成解決方案。 然而，他們可能圖像還原到稍高程度的分辨率的比經(jīng)典的算法。 這些算法也有它們強加給預期的噪聲統(tǒng)計（實際上，泊松或高斯分布）的限制的優(yōu)點。 因此，統(tǒng)計算法比單純的正則更為微妙的噪音政策，以及它們可能產生的噪聲圖像效果更佳。 然而，適當?shù)脑肼暯y(tǒng)計的選擇可能依賴于成像條件，以及一些商業(yè)軟件包比其他人在這方面更加靈活。

盲解卷積算法

盲解是一個相對較新的技術，大大簡化了反褶積的應用對于非專業(yè)，但該方法尚未廣泛使用在商業(yè)領域。 該算法通過改變*大似然估計過程，這樣不僅上述目的，但也點擴散函數(shù)估計開發(fā)。 使用這種方法時，對象的初始估計是由與估計，然后與從所述成像系統(tǒng)的光學參數(shù)計算得到的理論點擴散函數(shù)的卷積。 所得到的模糊估算是與原始圖像相比，進行校正計算，并且該修正被利用來產生一個新的估計，如上所述。 此相同的校正也適用于點擴散函數(shù)，生成一個新的點擴散函數(shù)的估計。 在進一步的迭代，點擴散函數(shù)估計和預測對象一起更新。

盲解工作得很好，不僅對高品質的圖像，還對噪聲的圖像或來自球面像差的痛苦。 該算法與理論點擴散函數(shù)的開始，但它適應于特定的數(shù)據(jù)被卷積。 在這方面，它免去了用戶從實驗獲得了高品質的經(jīng)驗點擴散函數(shù)的艱難過程。 此外，由于算法調整的點擴散函數(shù)的數(shù)據(jù)時，它可以部分地校正球面像差。 然而，這種計算校正應該是*后的手段，因為它是更為可取的圖像采集過程中盡量減少球面像差。

采用三種不同的處理算法，以相同的數(shù)據(jù)集的結果示于圖3。 原來的三維數(shù)據(jù)是用廣角熒光顯微鏡（1.25 NA油浸物鏡）0.4微米的z軸的步驟獲得了果蠅胚胎腿192的光學部分。 該圖像表示從所述三維堆疊中選擇一個單一的光學部分。 原始（原始）圖像示于圖3（a）所示。 去模糊的一個近鄰算法，結果將顯示在圖3（b），與灰霾去除95％的設置處理參數(shù)。 去卷積之后的同一圖像切片示出由逆（維納）濾波器（圖3（c）），并通過迭代盲解卷積（圖3（d）），摻入一種自適應的點擴散函數(shù)的方法。

共聚焦和多圖像解卷積

如可預期的，但也可以用來恢復用共焦或多光子光學顯微鏡獲得的圖像。 共聚焦顯微鏡和反褶積技術的結合提高了*出一般可達到與單獨的技術解析。 然而，解卷積共聚焦圖像的主要好處是沒有那么多的重新分配，作為出焦光，從而導致降低噪聲平均。 多光子圖像的去卷積也被成功地用于去除圖像失真和提高對比度。 在所有這些情況下，必須小心將適當?shù)狞c擴散函數(shù)，尤其是當共焦針孔孔徑是可調節(jié)的。

解卷積算法的實現(xiàn)

處理速度和質量顯著影響，如何在給定去卷積算法由軟件來實現(xiàn)。 該算法可以的方式，減少迭代次數(shù)，加快融合，以產生穩(wěn)定的估計行使。 例如，未優(yōu)化楊松-范Cittert算法通常在50和100之間的迭代需要收斂到一個*佳的估計。 由預濾波的原始圖像，以抑制噪聲并與所述*2次迭代的附加誤差校正標準，算法收斂在僅5至10次迭代。 此外，平滑濾波器，通常引入每5次迭代，以減少噪聲的放大。

當使用一個經(jīng)驗點擴散函數(shù)，使用噪點極少的高品質的點擴散函數(shù)是至關重要的。 無反褶積包目前在市場上使用直接從顯微鏡記錄“原始”的點擴散函數(shù)。 相反，該包包含前處理例程，降低噪聲并執(zhí)行徑向對稱性通過計算點擴散函數(shù)的傅里葉變換。 許多軟件包也執(zhí)行軸對稱的點擴散函數(shù)，因此假設不存在球面像差。 這些步驟降低噪聲和畸變，并使得在修復體的質量有很大的差異。

去卷積算法的實現(xiàn)的另一個重要方面是將原始圖像的預處理，通過例程，如背景減除，平場校正，漂白校正，和燈的抖動校正。 這些操作可以提高信號噪聲比和消除某些類型的文物。 大多數(shù)商用軟件包包括這樣的操作，用戶手冊應征詢其實施的具體方面的詳細說明。

其他卷積算法實現(xiàn)問題的關注數(shù)據(jù)表示。 圖像可以被劃分為子卷或表示為整個數(shù)據(jù)塊。 個別的像素值可以被表示為整數(shù)或浮點數(shù)。 傅里葉變換可以表示為浮點數(shù)或復數(shù)。 在一般情況下，更忠實的數(shù)據(jù)表示，去卷積的圖像需要更多的計算機存儲器和處理器時間。 因此，存在計算速度和恢復的質量之間的折衷。

結論

迭代恢復算法從兩個去模糊算法和共聚焦顯微鏡，因為它們不刪除失焦的模糊，而是試圖將其重新分配到正確的圖像平面不同。 以這種方式，出焦信號被利用，而不是被丟棄。 恢復后，熒光結構內的像素強度增加，但是每個圖像堆棧的總相加強度保持不變，如在以前的模糊區(qū)域的強度減弱。 模糊在對象的周圍的細節(jié)發(fā)生向回移動到焦點，從而導致從背景的對象和更分化的更詳細的定義。 更好的對比度和更高的信號 - 噪聲比，也通常在同一時間完成。

這些性能示于圖2中，在那里它被證實恢復提高了圖像的對比度，并隨后使更高分辨率的對象，而不發(fā)生在去模糊方法引入噪聲。 或許更重要的是用于圖像分析和定量，在原始圖像中的熒光信號的總和是相同的，在去卷積圖像。 當正確實施，圖像復原方法保持總信號強度卻提高了調整的信號位置（圖4）的對比。 因此，恢復圖像的定量分析是可能的，并且，由于改進的對比度，經(jīng)常期望的。

圖形化的情節(jié)在圖4中給出表示（線的位置在圖2中箭頭所示方向（一））沿橫線穿過圖2中所示的單元的像素的亮度值。 原始數(shù)據(jù)由綠線，由藍線的去模糊的圖像數(shù)據(jù)，并通過紅線的恢復圖像數(shù)據(jù)表示。 在數(shù)據(jù)是顯而易見的，去模糊引起顯著損失像素強度在整個圖像，而恢復結果中強度的試件的細節(jié)的區(qū)域的增益。 圖像強度的類似損失所看到的去模糊方法發(fā)生任何二維濾波器的應用。

當與廣角鏡配合使用，迭代重建技術是光效。 這個方面是*有價值的光限定的應用，如高清晰度熒光成像，其中對象通常是小的，并且包含少量的熒光基團，或在活細胞熒光成像，其中曝光時間是由活細胞的極端敏感性，光毒性的限制。