尼康顯微鏡數(shù)碼影像色彩平衡
在光學(xué)顯微鏡采集準(zhǔn)確的色彩平衡的影像都可以甚至經(jīng)驗(yàn)豐富的顯微鏡，不管他們是否采用傳統(tǒng)的感光膠片乳劑或較新的固態(tài)數(shù)字相機(jī)系統(tǒng)的挑戰(zhàn)。電子圖像捕捉技術(shù)的運(yùn)用依賴于同一個(gè)熟悉的屬性的光一樣傳統(tǒng)的基于膠片的顯微攝影，但執(zhí)行白平衡調(diào)整色彩平衡的能力是電子圖像傳感器的**功能，是不是所有直觀地尋求調(diào)查從顯微鏡捕獲的數(shù)字圖像。
當(dāng)拍攝的數(shù)字圖像看房相比，通過(guò)顯微鏡目鏡觀察，或在計(jì)算機(jī)顯示器上實(shí)時(shí)觀看圖像，色彩變化往往是相當(dāng)***的，并試圖調(diào)和兩者之間的差異，可令人沮喪。 一個(gè)因素造成這種差異是，在成像過(guò)程中，發(fā)生在成像條件相當(dāng)?shù)淖∷奕说囊曈X(jué)系統(tǒng)對(duì)變化下意識(shí)的，并且通常沒(méi)有意識(shí)到，直到圖像被記錄和靜態(tài)版本進(jìn)行評(píng)估，通常在彩色再現(xiàn)的問(wèn)題不同的觀看環(huán)境。
示于圖1是一系列視場(chǎng)在不同的照明色溫度條件記錄在相同的顯微鏡的數(shù)字圖像。 試樣是在比較低的（二十分之一波長(zhǎng)的）偏差相位差觀察在微分干涉對(duì)比（DIC）的粘附印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞的單層培養(yǎng)物。 在目鏡中，細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的顏色中性灰色時(shí)諾馬斯基棱鏡被調(diào)整，以實(shí)現(xiàn)圖1所示的光程差，以及顏色轉(zhuǎn)換濾光器被添加到光路徑，以提高鹵鎢燈的色溫?zé)魪?200K到5500K左右（日光值）。
未經(jīng)色彩轉(zhuǎn)換過(guò)濾器，DIC樣品在圖1中出現(xiàn)的中性灰色，但表現(xiàn)出明顯的全局黃******調(diào)，白熾燈照明的特性，當(dāng)通過(guò)顯微鏡目鏡觀察。 如果數(shù)碼相機(jī)的白平衡功能沒(méi)有被激活，并且施加到電流鏡配置，在這些條件下拍攝的圖像也出現(xiàn)有一個(gè)整體黃色的（圖1（a））。 插入一個(gè)彩色轉(zhuǎn)換濾光器插入光通路呈現(xiàn)的圖像與目鏡輕微藍(lán)色調(diào)，和相應(yīng)未經(jīng)白平衡校正拍攝的數(shù)字圖像保持或放大該顏色偏移（圖1（c））。 應(yīng)用白平衡算法來(lái)無(wú)論是與鎢或日光平衡照明拍攝的圖像消除陰影，由于色溫度的影響，如圖1（b）所示。 注意，不同的顏色校正的值由算法來(lái)平衡圖像的色調(diào)的質(zhì)量，取決于照明的色溫。 鎢絲燈照明需要修正值增加藍(lán)色和減少紅色，而相反是真實(shí)的日光照明。
實(shí)現(xiàn)在與耦合到光學(xué)顯微鏡數(shù)碼照相機(jī)系統(tǒng)獲得的圖像適當(dāng)?shù)纳势胶馊Q于多種因素，首先是建立正確的照明條件和精確顯微鏡光學(xué)對(duì)準(zhǔn)，并*終在圖像捕獲階段。 在獲得所希望的圖像的白平衡調(diào)節(jié)中的作用是特別重要的，而這種控制功能可以用于任何捕獲的樣品的*忠實(shí)再現(xiàn)，或試樣的目的是糾正不必要的色偏通過(guò)生成一個(gè)故意修改的表示編制文物。
從概念上講，在白平衡粗調(diào)整是必需的，使圖像傳感器的響應(yīng)到適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)為一般照明的條件（類似于選擇一個(gè)類別的電影），而細(xì)微的修改是有點(diǎn)類似于在電影中使用的色彩補(bǔ)償濾鏡基于攝影。 照射源和檢測(cè)器響應(yīng)的匹配，即使，光通過(guò)顯微鏡通常被修改，有些不可預(yù)測(cè)的，通過(guò)在光路中的檢體和任何其它部件。 因此，得到的*終圖像可以從所希望的結(jié)果的色彩平衡而變化。 這是極為重要的要明白，不同的試樣，和一個(gè)試樣或許局部區(qū)域，施加于成象光的**效果。 因此，如果需要精確的色彩平衡，變量諸如白平衡調(diào)整，必須仔細(xì)控制。
的色彩平衡圖像一般概念
在光學(xué)顯微鏡圖像的形成是根據(jù)光的基本特性，包括強(qiáng)度和產(chǎn)生的視覺(jué)感知的顏色，以及相關(guān)的色溫度值的光譜特性。 色溫的特性可以精確地定義為與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的參考光源，并且是可衡量的工具性，但是不可靠的預(yù)測(cè)如何每個(gè)樣品將在一個(gè)給定的成像情況進(jìn)行渲染。 此外，具有相同色溫的光源，可具有顯著不同的光譜組成和同樣的條件下觀察時(shí)，產(chǎn)生顯著不同的圖像。 除了這種情況的影響差異很大的反差增強(qiáng)輔助組件可以引入到顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。 明場(chǎng)，暗場(chǎng)，相襯，DIC，偏光，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度和熒光照明所有在場(chǎng)的不同表現(xiàn)色彩平衡校正，必須經(jīng)?？紤]在個(gè)人基礎(chǔ)上的樣品和光照條件加以解決。
呈現(xiàn)在圖2中不同的照明色溫和對(duì)比度增強(qiáng)方法的條件下拍攝的幾個(gè)數(shù)字圖像。 人類睪丸癌（精原細(xì)胞瘤）的鎢 - 鹵素照明的曙紅和蘇木精染色薄切片示于圖2（a）所示。 注意整體偏黃彌漫整個(gè)圖像時(shí)相比，正確的色彩平衡的圖像（圖7（b）所示），使染色部分折色。 這是發(fā)生在明場(chǎng)顯微術(shù)時(shí)，日光色轉(zhuǎn)換濾光器沒(méi)有被插入到光路徑中的常見(jiàn)錯(cuò)誤。 另外，藍(lán)色的日光過(guò)濾器，而無(wú)需校正的數(shù)字照相機(jī)的白平衡的光路可能會(huì)導(dǎo)致整體偏藍(lán)的色調(diào)為數(shù)字圖像，如圖2（b）所示。 在單層培養(yǎng)活HeLa細(xì)胞的這種形象揭示了當(dāng)相機(jī)不能正確色彩平衡所發(fā)生的偏藍(lán)。 應(yīng)用白平衡算法來(lái)捕獲軟件將渲染的圖像中在顯微鏡的目鏡中觀察到的灰度值。
與其它對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)獲得的圖像產(chǎn)生類似的問(wèn)題，當(dāng)顯微鏡照明的日光的色溫不均衡和照相機(jī)系統(tǒng)不具有的白平衡調(diào)整正確。 在圖2（c），2（d）和2（e）所示，用微分干涉對(duì)比（DIC），偏振光，霍夫曼調(diào)制對(duì)比捕獲的圖像，分別都已經(jīng)色彩平衡值移位到較暖（黃色）的色調(diào)。 在DIC圖像（圖2（c）），功能出現(xiàn)渾濁和正常的灰階色調(diào)以棕色和紅色的各種色調(diào)渲染。 同樣，重結(jié)晶尿素的偏振光圖像（圖2（d））也出現(xiàn)綠色，而放射的霍夫曼調(diào)制對(duì)比度的圖像（圖2（e））具有決定性的綠色背景（和亮點(diǎn)）。 熒光圖像（圖2（f）），通常不會(huì)從色彩平衡問(wèn)題受到影響，主要是因?yàn)樗鼈兪怯梢粋€(gè)小的波長(zhǎng)范圍內(nèi)占主導(dǎo)地位。
變化的色彩平衡或彩色再現(xiàn)的現(xiàn)象是公由大多數(shù)人在日?；顒?dòng)中確認(rèn)，通常被接受為天然發(fā)生不需要任何干預(yù)。 例如，近黃昏日光的黃金質(zhì)量是非常熟悉的，因?yàn)槭穷伾?，而不是熒光燈的辦公室照明出現(xiàn)截然不同的燭光中的事實(shí)。 人類視覺(jué)系統(tǒng)的功能由眼睛的感官反應(yīng)與由大腦解釋的信號(hào)組合，以適應(yīng)變化的光的顏色和強(qiáng)度。 其結(jié)果，白色物體被解釋為白色廣泛變化的照明條件下進(jìn)行。 通常情況下，如果白色被認(rèn)為正確，其他顏色和色調(diào)落入地方為好。與此相反，圖像傳感器，傳統(tǒng)的膠片或現(xiàn)代數(shù)碼相機(jī)是否產(chǎn)生對(duì)照明的響應(yīng)被固定在曝光的時(shí)刻。 所產(chǎn)生的圖像的顏色質(zhì)量取決于設(shè)計(jì)成片彩色感光層，或固態(tài)傳感器的各個(gè)顏色感測(cè)元件（像素）的靈敏度的具體響應(yīng)。 與任一捕獲方法，該圖像的顏色平衡可通過(guò)引入彩色濾光片修改成的照明或成像光的路徑，但該數(shù)字方法具有使傳感器響應(yīng)的電子，精密調(diào)整的鮮明額外的優(yōu)勢(shì)。
數(shù)碼相機(jī)白平衡基礎(chǔ)
來(lái)記錄圖像，不論是傳統(tǒng)的照相膠片或數(shù)碼成像裝置，通常被設(shè)計(jì)或調(diào)節(jié)，使得它的基線響應(yīng)匹配照明的廣泛的一般類別的傳感器。 照相膠片，例如，*常用的有兩種主要類別，適合于在任一日光或與鎢的照明光源使用制造，并且精細(xì)的調(diào)整，以膜反應(yīng)為關(guān)鍵應(yīng)用是通過(guò)使用適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器進(jìn)行。 固態(tài)傳感器，這是典型的電荷耦合器件（CCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）光電二極管檢測(cè)器，能夠被調(diào)整的電子以匹配他們的響應(yīng)特性，以各種照明源。
CCD的單個(gè)光感測(cè)元件或CMOS檢測(cè)器是固有的單色，要么通過(guò)依次傳遞入射光通過(guò)紅色，綠色和藍(lán)色濾光器到整個(gè)傳感器（產(chǎn)生對(duì)每個(gè)顏色，它們隨后合并分離的圖像實(shí)現(xiàn)其色靈敏度），或通過(guò)被放置在一個(gè)鑲嵌圖案在陣列的每個(gè)像素的微型聚合物薄膜過(guò)濾器。 *常見(jiàn)的過(guò)濾器裝置是紅色，綠色和藍(lán)色的彩色濾光片的排列拼接陣列，重復(fù)整個(gè)傳感器陣列的GRGB圖案。 這樣的安排，稱為拜耳過(guò)濾模式（參見(jiàn)圖3（a）），集成了兩倍多的綠色元素，紅色或藍(lán)色。 額外的綠傳感器的像素允許成像設(shè)備更接近人類視覺(jué)系統(tǒng)，其特征峰在靈敏度在綠色光譜區(qū)的顏色反應(yīng)（約550納米的波長(zhǎng);圖3（b）），因此，方便了輸出具有目視可接受的色彩平衡的影像。 來(lái)自傳感器陣列的對(duì)應(yīng)像素（或單色圖像）的單獨(dú)的紅色，綠色和藍(lán)色信號(hào)幅度的調(diào)整是通過(guò)白平衡控制功能實(shí)現(xiàn)的，以允許所獲取的圖像的色彩平衡。 一些相機(jī)系統(tǒng)通過(guò)軟件來(lái)代替或附加于硬件控制執(zhí)行這些調(diào)整。
用于通用應(yīng)用的數(shù)碼相機(jī)所熟悉的許多顯微鏡和正越來(lái)越多地適于連接到顯微鏡作為一種經(jīng)濟(jì)的替代致力于研究級(jí)的成像系統(tǒng)，雖然他們的能力通常較為有限。 由于涉及在利用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行常規(guī)用途的技術(shù)可擴(kuò)展到理解的因素，例如在顯微鏡應(yīng)用白平衡調(diào)節(jié)，它*初考慮的非技術(shù)的情況是有用的。 支配白平衡調(diào)整的基本概念是相同的一般的拍照應(yīng)用和成像顯微鏡。
常規(guī)的數(shù)字相機(jī)通常向用戶提供許多不同的白平衡設(shè)置是可選的為“預(yù)設(shè)”。 這些可對(duì)應(yīng)廣泛的照明類，如白天（晴天或陰天條件下），鎢絲燈，熒光燈，或其他各種照明場(chǎng)景。 很多相機(jī)都允許預(yù)設(shè)值進(jìn)行微調(diào)，以達(dá)到圖像更精確的色彩平衡。 一些攝像機(jī)具有附加功能通過(guò)參考一個(gè)白色卡片上，墻上，或者如果包括在圖像中應(yīng)表示為白色另一個(gè)目的是調(diào)整白平衡。 在實(shí)踐中，攝像機(jī)的位置，使白色物體充滿視場(chǎng)，以及白平衡調(diào)整是由開關(guān)設(shè)定或在操作菜單（取決于特定的相機(jī)）選擇啟動(dòng)后，該相機(jī)進(jìn)行適當(dāng)?shù)膫鞲衅鞯恼{(diào)整渲染目標(biāo)為白色。
參照定義的白色物體調(diào)整收購(gòu)圖像時(shí)使用的，并能提供高度精確的色彩平衡校正相同的光照條件下進(jìn)行的。 該過(guò)程必須然而，應(yīng)當(dāng)光照變化重復(fù)。 高級(jí)攝影師往往會(huì)選擇通過(guò)使用比那些匹配的照明，以達(dá)到理想的美學(xué)效果等白平衡設(shè)置來(lái)修改自己的形象。 例如，圖像可出現(xiàn)比它如果獲得了“正確的”白平衡色調(diào)較冷或較溫暖。 這樣的效果，當(dāng)然，考慮錯(cuò)誤，如果準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)演繹的用意，類似于鎢絲燈照明采用日光平衡片，反之亦然。
色彩平衡，這一般應(yīng)避免在關(guān)鍵應(yīng)用的流行的技術(shù)，通常是指在消費(fèi)相機(jī)的自動(dòng)白平衡調(diào)整。 此方法的目的是要施加到所述圖像場(chǎng)作為圖像獲取和功能通過(guò)評(píng)估的視圖的整體字段均存在相對(duì)于色調(diào)的光值，以及試圖進(jìn)行平均，或零輸出，任何整體顏色偏。 自動(dòng)平衡技術(shù)的缺點(diǎn)是存在于任何視場(chǎng)的顏色值表示一個(gè)“平均”分配的色調(diào)，這相結(jié)合，產(chǎn)生中性灰色或白色。實(shí)際上，如果總的像素響應(yīng)不相似的編程（預(yù)期）整體平均，白平衡調(diào)整相機(jī)發(fā)出不會(huì)產(chǎn)生準(zhǔn)確的色彩再現(xiàn)。
在顯微鏡下觀察到的典型標(biāo)本有很大的不同顏色分布，往往表現(xiàn)出單一的主色調(diào)（尤其是在熒光）。 這很可能是一個(gè)自動(dòng)白平衡調(diào)整的試樣表現(xiàn)出主要是紅組織染色將產(chǎn)生比施加到藍(lán)染色的制備相同的過(guò)程實(shí)質(zhì)上不同的色彩平衡進(jìn)行。 既不是可能導(dǎo)致一個(gè)準(zhǔn)確的樣品表示。 試圖通過(guò)相機(jī)電路以平衡檢測(cè)器的響應(yīng)輸出一個(gè)整體的平均顏色值將在不同的樣本產(chǎn)生非常不同的結(jié)果，特別是如果一個(gè)給定的視場(chǎng)具有很強(qiáng)的或主導(dǎo)的色彩。 還有，當(dāng)然，為產(chǎn)生具有自動(dòng)白平衡（*有可能的那些的白色或灰色的區(qū)域很大比例）可以接受的結(jié)果的標(biāo)本的例子，但該技術(shù)缺乏必要使其常規(guī)有用的重現(xiàn)性。
在顯微鏡白平衡調(diào)整
在考慮用于優(yōu)化白平衡討論了不同的方法，這是明顯的，有些技術(shù)不適合自己以光學(xué)顯微鏡的約束和要求。 對(duì)于特定類型的照明，利用預(yù)先設(shè)定的值，假定光源的特性是固定的，有顏色的溫度和其他光譜質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)值。 當(dāng)鎢鹵燈被采用，它是在顯微鏡通常的做法是改變燈電壓來(lái)控制光的強(qiáng)度或減少熱量的產(chǎn)生。 這樣產(chǎn)生的照明色溫度，這會(huì)導(dǎo)致不正確的色彩平衡，如果鎢型照明的標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)設(shè)值被用于在數(shù)碼相機(jī)上的變化。 色彩還原變化的另一種原因從發(fā)生在彩色輸出作為其使用壽命期間燈具時(shí)代的變化。
與那些*佳的日光（約5500K）色溫區(qū)域平衡的光源也存在類似的問(wèn)題。 不僅是“日光”變量的色溫，但很少有人工光源準(zhǔn)確地模擬日光的光譜特性。 這些困難可能，在理論上，可以至少部分地通過(guò)允許自動(dòng)電路來(lái)校正次要照明波動(dòng)克服，但是其他的問(wèn)題往往使這種方法不可取。與像場(chǎng)的自動(dòng)評(píng)估的，局部的試樣的變化可以在彩色平衡產(chǎn)生重大誤差。 在一般情況下，對(duì)于大多數(shù)顯微鏡應(yīng)用，*好的辦法是限制白平衡評(píng)價(jià)一個(gè)精心選擇的圖像區(qū)域或其他合適的物鏡。
當(dāng)數(shù)字捕獲設(shè)備是利用圖像的顏色樣本在光學(xué)顯微鏡，獲得正確的色彩平衡，以提供樣品的真實(shí)再現(xiàn)通常是首要物鏡。 從這個(gè)戰(zhàn)略意圖的偏差通常只取得了糾正與產(chǎn)生不良偏色的樣品制備問(wèn)題。 *科學(xué)級(jí)數(shù)碼相機(jī)，包括那些專門為顯微鏡設(shè)計(jì)，依靠參考調(diào)整白平衡，以選定的顏色值。 在透射照明，適當(dāng)?shù)膮^(qū)域（通常為白色或中性灰色的）被選為從試樣字段或單獨(dú)的照明場(chǎng)中進(jìn)行調(diào)整，以從光路取出的試樣。 為了在利用反射光顯微鏡進(jìn)行白平衡調(diào)整，白色或中性灰色卡（或紙部分）可以被定位于代替試樣的顯微鏡載物臺(tái)上。 白平衡設(shè)置是通過(guò)測(cè)量從白卡的表面反射的光隨后獲得。
大多數(shù)設(shè)計(jì)為顯微鏡通過(guò)駐留在主機(jī)計(jì)算機(jī)上的軟件控制和數(shù)碼相機(jī)通常被配置為與多個(gè)顯微鏡的功能進(jìn)行交互。 為尼康DXM 1200數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)的軟件接口，例如，具有代表性的現(xiàn)有相對(duì)于在該白平衡調(diào)整的實(shí)現(xiàn)方式的商業(yè)產(chǎn)品。 當(dāng)白平衡調(diào)整窗口是用戶界面中的啟動(dòng)時(shí)，選項(xiàng)供由攝像機(jī)系統(tǒng)中選擇的視場(chǎng)區(qū)域的白平衡的評(píng)價(jià)。 在顯示屏上的實(shí)時(shí)圖像，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估一個(gè)合適的白色或中性灰色地帶，作為圖像傳感器的參考點(diǎn)。 如果顯示在監(jiān)視器具有色偏不同于在顯微鏡的目鏡中觀察到的色彩平衡的圖像，照相機(jī)系統(tǒng)必須進(jìn)行白平衡，以使該試樣的準(zhǔn)確的圖像進(jìn)行調(diào)整。 理想情況下，所顯示的偏色將由當(dāng)正常試樣區(qū)域被選擇為白平衡調(diào)整攝像機(jī)的彩色平衡電路被刪除。
可以被用來(lái)設(shè)置數(shù)碼相機(jī)白平衡算法標(biāo)本領(lǐng)域幾個(gè)典型的例子示于圖4。 該標(biāo)本是成纖維細(xì)胞的生活文化影像與微分干涉對(duì)比（圖4（a）），淀粉顆粒馬鈴薯組織在四染色薄款在光照下（圖4（b）），與人類紅細(xì)胞相位對(duì)比（圖4（c））。 每幅圖像上，適合在使用區(qū)域選擇技術(shù)白平衡調(diào)節(jié)的區(qū)域中的紅色概述，而黃色箭頭表示上選擇一個(gè)像素時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生滿意的白平衡校準(zhǔn)圖像的特定點(diǎn)。
所選擇的作為白平衡參考區(qū)域應(yīng)盡可能大，且無(wú)試樣漬的著色效果，流鼻血到安裝介質(zhì)。 在許多系統(tǒng)中的白平衡調(diào)整軟件能夠把一個(gè)單點(diǎn)（像素）的圖像中，或者可以由選取框用鼠標(biāo)光標(biāo)指定更大的區(qū)域選擇。 更好的結(jié)果是通過(guò)選擇盡可能大的區(qū)域獲得的。 在結(jié)果中更廣泛的變化可能發(fā)生，如果被選擇用于調(diào)整單個(gè)點(diǎn)，因?yàn)椴▌?dòng)的紅色，綠色和藍(lán)色的像素強(qiáng)度局部組合可以向白色的整體視覺(jué)效果。 通過(guò)選擇一個(gè)較大的面積，平均獲得在傳感器陣列中的一個(gè)更大數(shù)量的像素，以實(shí)現(xiàn)可接受的色彩平衡的改進(jìn)的可能性。 以下參照區(qū)域的選擇，白平衡調(diào)整被啟動(dòng)，并且相機(jī)系統(tǒng)利用任一種算法或查找表（LUT）來(lái)設(shè)置適當(dāng)?shù)碾娮又担ɡ鐐鞲衅髟鲆鏋槊總€(gè)分量的顏色）產(chǎn)生一個(gè)中性或白色的顏色值。
如前面所討論的，數(shù)字圖像的顏色平衡是通過(guò)由CCD或CMOS圖像傳感器收集的波長(zhǎng)的光譜的嚴(yán)重影響，無(wú)論該傳感器是否被容納在一個(gè)照相機(jī)，望遠(yuǎn)鏡，激光工作臺(tái)，或顯微鏡。 在采用這些固態(tài)器件彩色數(shù)碼相機(jī)，一系列的平衡調(diào)整，通常是必要的，以便產(chǎn)生符合上述照明光源的顏色溫度可接受的彩色影像。 成功地實(shí)現(xiàn)正確的色彩平衡若干準(zhǔn)則應(yīng)考慮：
CCD圖像傳感器對(duì)紅外光敏感的，并且是*可靠的性能對(duì)可見(jiàn)光成像只能過(guò)濾掉波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外線來(lái)實(shí)現(xiàn)。 一些系統(tǒng)可裝有紅外線阻擋元件在照相機(jī)內(nèi)，但如果這被確定為不是這樣的話，適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾應(yīng)該被添加到排除這些波長(zhǎng)在到達(dá)圖像傳感器之前。
對(duì)于其中的白平衡調(diào)整被檢體圖像，空白樣品載玻片，或反射光的參考（例如，白色表面）上進(jìn)行任何配置顯微鏡，顯微鏡應(yīng)具有光學(xué)系統(tǒng)對(duì)準(zhǔn)的正確科勒照明和準(zhǔn)確地聚焦在樣品平面中。 確保這些條件*大程度地減少?gòu)纳钏斐傻囊晥?chǎng)照度不均勻或顏色異常的問(wèn)題。
通常，圖像傳感器的性能是*佳的色溫較高的區(qū)域，這就要求鎢 - 鹵素發(fā)光器可以在所建議的電壓調(diào)節(jié)范圍的上端操作為數(shù)字成像。 任何必要的減少照度應(yīng)始終與中性密度過(guò)濾器，而不是通過(guò)降低電壓來(lái)照射燈進(jìn)行。 同樣，適當(dāng)?shù)纳势胶馐?容易實(shí)現(xiàn)與數(shù)碼相機(jī)，如果一般用于攝影的日光平衡彩色膠片的色彩平衡濾波器插入照明光路。 尼康稱此濾波器作為南商 （中性色彩平衡），雖然其他廠商有不同的名稱具有相同用途的過(guò)濾器。
白平衡的中性灰區(qū)域中的樣本現(xiàn)場(chǎng)調(diào)整可能會(huì)產(chǎn)生更精確的結(jié)果比如果一個(gè)非常亮的區(qū)域被選為白色參考。 是完全的區(qū)域“泛白”，或*出傳感器的動(dòng)態(tài)范圍，可以由一個(gè)或多個(gè)組件（RGB）的顏色出現(xiàn)白色的圖像中作為過(guò)飽和度的結(jié)果。 獲得的色彩平衡電路對(duì)這樣一個(gè)區(qū)域進(jìn)行補(bǔ)償可能產(chǎn)生不準(zhǔn)確或不重復(fù)的結(jié)果。 灰色區(qū)域（具有中性密度）是由紅色，綠色和藍(lán)色像素傳感器（或單獨(dú)的RGB彩色圖像）約等于信號(hào)電平產(chǎn)生。 作為一個(gè)結(jié)果，基于中性區(qū)域精確的色彩平衡更容易實(shí)現(xiàn)。
多個(gè)變量影響的顯微鏡獲得的圖像的色彩平衡，以及它們的相互關(guān)系的理解是在實(shí)現(xiàn)可接受的結(jié)果很重要。 通過(guò)成像軟件界面進(jìn)行曝光設(shè)定，由圖像傳感器電路的增益調(diào)整進(jìn)行。 因?yàn)榘灼胶獾恼{(diào)整是通過(guò)RGB傳感器的選擇性增益補(bǔ)償也生效，曝光量應(yīng)設(shè)置為一個(gè)近似正確的價(jià)值開始白平衡調(diào)整之前。 如果曝光時(shí)間被改變，或其他更改增益和偏移都需要經(jīng)過(guò)白平衡矯正已定，*好是重復(fù)的白色平衡調(diào)整步驟，因?yàn)樗羞@些因素彼此互動(dòng)。 同樣地，向顯微鏡，影響光的屬性，如隔膜的調(diào)整，更換過(guò)濾器，以及切換目標(biāo)組分的變化，可改變白平衡和要求，以便再次進(jìn)行校正，以獲得*精確的圖像。
如果一個(gè)特定的應(yīng)用程序需要作出關(guān)鍵的顏色判斷或1樣品和另一個(gè)選定的一組（其中，標(biāo)本已按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備）內(nèi)進(jìn)行比較，它不重復(fù)的白平衡調(diào)整每個(gè)樣品是重要的。 在這種情況下，*好的方法是執(zhí)行對(duì)單獨(dú)的照明初始白平衡校準(zhǔn)（在這里的空白顯微鏡載玻片），然后獲得一個(gè)樣本的圖像，使任何必要的曝光調(diào)整。 再次替換空白幻燈片的標(biāo)本后，白平衡日常應(yīng)反復(fù)在照明領(lǐng)域，而不進(jìn)行任何更改曝光或顯微鏡配置。 被比較的標(biāo)本應(yīng)接著在白平衡，曝光，等等相同的設(shè)置進(jìn)行成像。 如果暴露的變化是必需的，他們應(yīng)該保持在*低限度，以避免影響色彩平衡。 重述在這種類型的應(yīng)用（其中彩色再現(xiàn)正在其中試樣用于測(cè)試或診斷目的比較）的關(guān)鍵概念，白平衡調(diào)整應(yīng)該在單獨(dú)而不是為每個(gè)試樣校正的光源來(lái)進(jìn)行。 因此，比較有可能對(duì)于每個(gè)樣本賦予顯微鏡照明光源的色彩效果。
在調(diào)整的數(shù)字化采集系統(tǒng)的白平衡光學(xué)顯微鏡目前更多的挑戰(zhàn)所采用的某些照明和對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)。 偏振光，暗場(chǎng)和熒光方法通常存在寬視場(chǎng)其中標(biāo)本呈現(xiàn)在深度飽和的色彩在深色背景，以白色很少或沒(méi)有的地方。 有些攝像機(jī)系統(tǒng)提供了一種機(jī)制來(lái)設(shè)置暗平衡或黑平衡這種類型的成像情況，其中沒(méi)有合適的白色或中性灰色區(qū)域是可用的。 這種方法就建立了傳感器響應(yīng)一個(gè)基準(zhǔn)確定，并且可以提供滿意的色彩平衡。
對(duì)于暗背景樣本的圖像的替代方法是用試樣上除去照明場(chǎng)進(jìn)行白平衡調(diào)整。 對(duì)于高度飽和的，深色的標(biāo)本，但是，適當(dāng)?shù)钠毓獬上窨赡苄枰獦O其明亮的照明或相對(duì)較高的相機(jī)增益設(shè)置。 這可能會(huì)限制白平衡調(diào)節(jié)的準(zhǔn)確性，如果這是在不存在試樣上的明亮的照明場(chǎng)進(jìn)行。 為了讓白平衡電路，以評(píng)估該照明在類似于與試樣現(xiàn)有（和在近似正確的曝光設(shè)置）的亮度級(jí)，中性密度濾光器可以在白平衡調(diào)節(jié)被插入到光路中，并且然后與試樣實(shí)際成像取代。 一些實(shí)驗(yàn)是必需的，以便選擇近似于試樣的傳輸特性文件的中性密度濾光器。
白平衡操作
情況經(jīng)常遇到在可接受的白平衡不能圖像拍攝過(guò)程中按照一般的協(xié)議來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 在這些情況下，非標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有時(shí)可以采用能有效地“欺騙”攝像機(jī)的白平衡功能，以產(chǎn)生特定顏色的平衡，這可能會(huì)或可能不會(huì)被認(rèn)為是正確的，但達(dá)到了預(yù)期的效果。 如果連這個(gè)策略不能提供可接受的色彩還原，或者如果現(xiàn)有的圖像，與差的色彩平衡，采集后圖像處理與數(shù)字圖像編輯軟件（如Adobe Photoshop）初始取得可以提供一定程度的修正。
為了應(yīng)用上述技術(shù)，各種濾色器通常用于透射光的配置是有用的。 設(shè)計(jì)用于彩色照相印濾波器組是適合于此目的。 該套包含一系列在各原色的密度，并且可以被組合以產(chǎn)生任何所需的色調(diào)。 為反射光顯微鏡，適于反射色的引用是必需的非白色平衡。 這是沒(méi)有必要的目標(biāo)符合任何顏色標(biāo)準(zhǔn)，和實(shí)驗(yàn)通常是必需的，以產(chǎn)生所需的結(jié)果。 任何有色反射面可以使用，但*好是有一個(gè)可用的寬范圍的色調(diào)和飽和度的變化。 服務(wù)到家中心或油漆店油漆色樣卡是理想的目的，因?yàn)樗鼈兪窃趲缀趺恳粋€(gè)可以想象的顏色變化提供。 在某些情況下，試樣本身的選定區(qū)域可以被用來(lái)設(shè)置斷色的白平衡校準(zhǔn)。
無(wú)論是利用過(guò)濾器在反射光透射光或反射物鏡（如油漆樣卡），操作相機(jī)的白平衡功能的概念是相同的：在非白色的白平衡校準(zhǔn)會(huì)導(dǎo)致相機(jī)的電路，以消除物鏡顏色，并使其作為一個(gè)較為中性的灰******調(diào)。在大多數(shù)情況下，只有一個(gè)微妙的變化是需要的，并且試驗(yàn)將確定目標(biāo)的色調(diào)和飽和度，將產(chǎn)生整個(gè)圖像的平衡，使必要的改變。平衡在一個(gè)淡藍(lán)色的顏色會(huì)導(dǎo)致整體變暖的影響，或轉(zhuǎn)向紅色。相反，采用淡紅色作為參考會(huì)產(chǎn)生偏藍(lán)轉(zhuǎn)向涼爽的色彩平衡。其他顏色校正遵循相同的一般邏輯。在任何給定的顏色進(jìn)行白平衡將傾向于導(dǎo)致相機(jī)的電路，以移位的色彩平衡朝向互補(bǔ)色。需要強(qiáng)調(diào)的是，這些非傳統(tǒng)的彩色平衡技術(shù)對(duì)于實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)果時(shí)，通常的方法都失敗了（用于與特定的樣品制備，光源，或成像裝置的原因）的潛在機(jī)制是重要的。在這種情況下，它仍然可能通過(guò)抵消相機(jī)的響應(yīng)標(biāo)本調(diào)色板獲得可接受的圖像。
總之，缺乏顯微鏡照明光源和膠片乳劑或圖像傳感器校準(zhǔn)之間的正常色溫的平衡是*常見(jiàn)的原因，在顯微攝影和數(shù)字成像意想不到的顏色變化。如果光源的顏色溫度太低的膜或傳感器特性，導(dǎo)致顯微照片和數(shù)字圖像將有一個(gè)整體的黃色或偏紅，并會(huì)出現(xiàn)暖。另一方面，當(dāng)光源的顏色溫度過(guò)高時(shí)，產(chǎn)生的圖像將具有一個(gè)藍(lán)色的演員，并會(huì)出現(xiàn)冷卻。錯(cuò)配的程度，將決定這些顏色的變化程度，以導(dǎo)致極端的顏色變化很大的差異。相同的效應(yīng)發(fā)生與固態(tài)的數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)。由于有問(wèn)題的，因?yàn)檫@些顏色的變化可能看起來(lái)，他們總是容易被正確使用的轉(zhuǎn)換和光均衡器的校正，或用數(shù)碼相機(jī)的白平衡電路的正確校準(zhǔn)。