徠卡顯微鏡，干式超薄切片與上高凝壓力
骨礦化的細(xì)胞培養(yǎng)模型：UMR106-01細(xì)胞更快地做到這一點(diǎn)，在時(shí)間上同步，并產(chǎn)生更多的礦物
我們已經(jīng)使用培養(yǎng)UMR106-01成骨細(xì)胞，調(diào)查骨礦化的過(guò)程。 UMR106-01細(xì)胞以及初級(jí)顱蓋骨細(xì)胞球形聚集胞外*分子蛋白質(zhì) - 類(lèi)脂復(fù)合體，稱(chēng)為生物礦化灶（BMF），其中的羥基磷灰石礦物所述*晶體沉積（Midura等，2004;。Wang等， 2004）。 這些文化模式之間的主要區(qū)別是與礦化發(fā)生時(shí)，從12-16天電鍍初級(jí)成骨細(xì)胞88 h代表UMR106-01細(xì)胞后不等的速度。
如果礦化是阻止磷源或通過(guò)添加絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF遺漏，BMF復(fù)合物形成，但沒(méi)有發(fā)生礦化。 有趣的是，*結(jié)構(gòu)的研究表明，對(duì)礦化BMF事先含有大量膜囊泡有限大小不等，從50納米到2微米的直徑。 然而，*礦物晶體未檢測(cè)到UMR106-01細(xì)胞鋪板后78小時(shí)和球形站點(diǎn)推定為小泡內(nèi)被本地化。
具體地，共焦拉曼光譜的分析顯示內(nèi)BMF礦化是在一個(gè)培養(yǎng)瓶（Wang等，2009）中的所有的BMF同時(shí)發(fā)生一個(gè)漸進(jìn)的，多步驟的過(guò)程。 重要的是，幾種蛋白質(zhì)譜的變化是檢測(cè)每個(gè)BMF內(nèi)前低結(jié)晶羥基磷灰石的沉積和礦化時(shí)被攔截，這些變化并沒(méi)有出現(xiàn)。 因此，在BMF礦化是一個(gè)時(shí)間上的同步過(guò)程。 然而，了解礦化的生化機(jī)制需要的鈣，磷離子處理前之BMF晶核的詳細(xì)升值。
鈣，磷以及目前的水溶解度的方法排除在生物礦化初始水泡事件的*微結(jié)構(gòu)分析？
以前的工作已提出，軟骨和/或骨礦化利用一個(gè)單一囊泡群體富集鈣和磷，或，2囊泡種群分別富含鈣或磷（圖1）（安德森，1967;博努奇，1967;阿瑟諾和Ottensmeyer，1984）。 為了弄清這個(gè)問(wèn)題，這些離子的溶解性就必須使用其他方法如高壓冷凍和冷凍置換，以避免損失標(biāo)本固定期間，嵌入和切片。 因?yàn)榇蠖鄶?shù)現(xiàn)有的研究還沒(méi)有一致的檢體處理過(guò)程中避免水，偽非水性處理的成骨細(xì)胞介導(dǎo)的礦化過(guò)程的真實(shí)影響是難以評(píng)估。
本研究的目的是使用同步UMR106-01培養(yǎng)模型，以緊接音響RST羥基磷灰石晶體的成核設(shè)計(jì)和驗(yàn)證一個(gè)偽非水處理方法，圖像內(nèi)的BMF鈣，磷離子的分布在其中（圖1） 。 我們認(rèn)為此方法也應(yīng)適用于在其他細(xì)胞如肌肉鈣離子的分布隨時(shí)間變化的調(diào)查。
圖。 1：外礦的單，雙泡模型。 上游面板，單基質(zhì)小泡模型。 鈣，磷離子通過(guò)的Ca +2-ATPase的抽， 鈉 ，磷共轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸酶作用于磷脂建議的行動(dòng)逐步集中基質(zhì)小泡的單一種群內(nèi)。 一旦鈣2和磷酸根離子到達(dá)一個(gè)閾值濃度（黃色），初始礦物晶體的成核發(fā)生導(dǎo)致囊泡和結(jié)晶，可以在周?chē)募?xì)胞外膠原基質(zhì)內(nèi)傳播額外晶體釋放的破損。 較低的面板，雙泡模型。 鈣，磷正逐步集中囊泡的生化顯示不同的功能分布，包括鈣離子泵ATP酶和Na+-磷酸共轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，分別為兩個(gè)不同的種群內(nèi)。 隨后，這些鈣，磷富集囊泡種群融合和核礦物晶體導(dǎo)致囊泡和結(jié)晶，可以在周?chē)募?xì)胞外膠原基質(zhì)內(nèi)傳播額外晶體釋放的破損。
鈣，磷是由高壓冷凍，冷凍或取代傳統(tǒng)的固定樣本丟失
使用高壓冷凍和冷凍置換不足以留住不穩(wěn)定鈣磷礦化成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中
鈣，磷可以從樣品要么在高壓冷凍和冷凍置換或傳統(tǒng)固定過(guò)程中丟失。 評(píng)估我們的偽非水方法的有效性，我們選擇了停止的文化在76小時(shí)，12小時(shí)添加β-磷酸甘油礦化刺激后，但在此之前2小時(shí)礦物內(nèi)BMF（Midura*晶體的外觀(guān)等，2004; Wang等，2009）。 某些文化中，隨機(jī)選擇用于常規(guī)固定（圖2）進(jìn)行處理而另一些則通過(guò)高壓冷凍機(jī)（Leica EM PACT）處理，冷凍干燥，取代（圖3）。 這些成對(duì)的文化比較支持幾個(gè)結(jié)論。 大面積的含有常規(guī)的固定后稍微均勻的顆粒有機(jī)基質(zhì)中。 這些區(qū)域似乎從它們的體積排除膜囊泡有限。 與此相反，高壓冷凍培養(yǎng)物含有大量的幾乎“白”胞外區(qū)，大約0.5-1微米的直徑，內(nèi)BMF（箭頭，圖3）。
在較高功率的觀(guān)點(diǎn)，這是顯而易見(jiàn)的，盡管低對(duì)比度這些“白”的區(qū)域不具有一個(gè)基本的細(xì)節(jié)表示一個(gè)范圍不規(guī)則形狀的球狀體在約50至800納米的直徑（未示出）。 然而，這些“白色”區(qū)域的存在提出了關(guān)于無(wú)機(jī)或有機(jī)物質(zhì)的損失迫切關(guān)注。 特別是，當(dāng)與從成對(duì)的，以往固定培養(yǎng)物（圖2）相似的BMF區(qū)域相比，我們推測(cè)，“白”點(diǎn)表示它被優(yōu)先地由高壓冷凍保留，但其中在進(jìn)一步處理，其后丟失材料。
圖。 2：BMF的常規(guī)化學(xué)固定和濕切片后礦化成骨細(xì)胞培養(yǎng)外觀(guān)。 UMR106-01細(xì)胞中的β-甘油磷酸的存在下培養(yǎng)12小時(shí)。 箭頭限定的胞外BMF的富集稍微均勻的顆粒有機(jī)基質(zhì)的輪廓。
圖。 3：高壓冷凍，冷凍干燥，取代的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物含有的BMF具有半透明的斑點(diǎn)（箭頭所示），這些不良的對(duì)比細(xì)胞外基質(zhì)的區(qū)域。 當(dāng)與進(jìn)行干燥切片類(lèi)似的樣品相比，透光性斑點(diǎn)出現(xiàn)黑（參見(jiàn)圖4）。
鈣，磷潴留在干燥的切片高壓凍結(jié)，凍結(jié)取代的培養(yǎng)提高
并排側(cè)比較顯示干切片與高壓冷凍和冷凍置換組合須于成骨礦化文化觀(guān)察富含鈣外囊泡人口和磷
值得注意的是，隨后的電子光譜的鈣，磷成像是不可能在任一常規(guī)固定，也不該被切開(kāi)的水無(wú)論標(biāo)本是否后染色或不凍結(jié)取代的樣品（結(jié)果未顯示）。 因此，我們?nèi)〈汕衅糜诟邏簝鼋Y(jié)，凍結(jié)取代文化濕切片。 鈣，磷潴留在干燥的切片高壓凍結(jié)，凍結(jié)取代的培養(yǎng)提高。 很顯然，干切片的取代導(dǎo)致生物礦化灶內(nèi)的顯著增加在保持鈣和磷[比較圖3（濕切片）和4（干切片）。
從而出現(xiàn)如圖3的“白”點(diǎn)后，濕切片焦點(diǎn)0.5-1微米直徑的區(qū)域，現(xiàn)在的零能量損失圖像變暗（圖4A）。 這UMR106-01文化礦化可重復(fù)的，時(shí)間上同步的方式其實(shí)有利于這些直接比較不同文化之間（Wang等，2009）。此外，電子光譜成像表明，暗區(qū)出現(xiàn)富含鈣，磷（比較圖4A，B和C）。 *后，如圖所示，在圖4D中，鈣（紅色）和磷（綠）信號(hào)的疊加圖像在很大程度上相互重疊的76 II培養(yǎng)物如由黃色的存在。 因?yàn)槠渌难芯勘砻鳎?6 II UMR106-01文化不包含檢測(cè)礦物晶體（霍夫曼等人，2007; Wang等，2009），鈣，磷在這里觀(guān)察到的豐富內(nèi)容可以代表無(wú)定形磷酸鈣（Driessens等人，1978）和/或磷的活性有機(jī)形式，例如多磷酸鹽（Omelon等人，2009）。
圖4：偽非水性處理后，礦化BMF富集鈣和磷。 細(xì)胞在相同生長(zhǎng)到那些在圖2和圖3。 答：零能量損失的形象描繪黑暗的出現(xiàn)囊泡。 B：電子光譜鈣信號(hào)的成像。 C：電子光譜磷成像。 D：在A-C的意見(jiàn)疊加圖像。
重要的是，對(duì)鈣，磷的礦化富集觀(guān)察重點(diǎn)內(nèi)容的功能作用是通過(guò)非礦化控制文化分析的支持。 當(dāng)類(lèi)似的高壓冷凍，冷凍置換，并干燥切片方法被應(yīng)用到非礦化UMR106-01培養(yǎng)，很少暗（鈣和/或磷富集）囊泡或顆粒進(jìn)行檢測(cè)（未示出）。 *后，一個(gè)附加的優(yōu)點(diǎn)為使用的擺動(dòng)刀是它切片過(guò)程中降低壓縮和減壓的所得部分起皺。
總結(jié)
總之，我們的結(jié)果表明，高壓冷凍和偽非水性處理是必需的，以檢測(cè)早期鈣，磷富集礦化成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞外位點(diǎn)。 使用干切片的證明是鈣，磷的保存的關(guān)鍵一步。 此外，電子光譜成像表明胞外生物礦化灶內(nèi)深染的囊泡之前的結(jié)晶礦物的檢測(cè)（Wang等，2009）富含鈣和磷。 現(xiàn)在，我們計(jì)劃使用這種方法來(lái)確定是否成骨細(xì)胞在體外和體內(nèi)利用單或雙泡成礦機(jī)理（戈?duì)査够频龋?004;。Midura等，2009）。