徠卡顯微鏡，超高分辨率顯微鏡提供了新的洞察核孔復(fù)合體組織
在核孔復(fù)合體（NPC）是一個大的蛋白質(zhì)復(fù)合物在核膜，占本門的真核基因構(gòu)成。這種復(fù)雜的包含數(shù)百蛋白質(zhì)的形成為注定要進(jìn)入或離開細(xì)胞核化合物的選擇性門。
正因為如此出色的功能的全國人大結(jié)構(gòu)的極大興趣。到目前為止，全國人大結(jié)構(gòu)分析已主要限于結(jié)晶研究或電子顯微鏡（EM）。單個組件的一些結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破譯了晶體。然而，組織的復(fù)雜內(nèi)部個別蛋白質(zhì)的仍然遙遙無期。其中的差距已經(jīng)被關(guān)閉通過使用*高分辨率顯微鏡。
一月Ellenberg和他的團(tuán)隊的科學(xué)家在EMBL在海德堡獲得新的見解全國人大結(jié)構(gòu)的幫助下基態(tài)損耗（GSD）顯微鏡。
什么是GSDIM方法為您的研究的優(yōu)勢是什么？
在我們的研究中，我們試圖了解大型多蛋白復(fù)合物，如核孔復(fù)合體（NPC），都是建立。因為它們的尺寸和復(fù)雜性，例如分子機(jī)器是*出了單個方法的范圍和素來結(jié)構(gòu)生物學(xué)的一個挑戰(zhàn)。原子分辨率的方法，例如X-射線晶體學(xué)或NMR需要純化樣品和不適合于非常大的程序集。雖然，電子顯微鏡允許的大復(fù)合體在其天然環(huán)境中的細(xì)胞的觀察，它往往是很困難的分配的電子密度以單個蛋白。在熒光顯微鏡中的蛋白質(zhì)的身份是已知的，*分辨率（SR）現(xiàn)在讓我們來可視化低于衍射極限的細(xì)節(jié)。當(dāng)SR被結(jié)合的顆粒平均，蛋白質(zhì)的位置可以被映射到亞納米精度的規(guī)模，使得光鏡適用于大型復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究。因此，SR顯微鏡可以連接不同類型的數(shù)據(jù)，并*終幫助生成的多蛋白裝配偽原子模型。此外，特別是GSDIM和其他本地化SR方法的一大優(yōu)點(diǎn)是，他們是相對簡單的使用，并定期讓蛋白質(zhì)在10?20 nm的間隔的分辨率。這對我們來說是重要的，因為我們可以獲取大數(shù)據(jù)集，并期待在一個相對有效的方式很多不同的標(biāo)記。
什么是新的見解它給你的問候核孔復(fù)合體的結(jié)構(gòu)？你去過哪些細(xì)節(jié)能夠可視化的*次？
Nucleoporins是建立核孔（見圖1）的蛋白質(zhì)。*次，SR顯微鏡使人們有可能解決的幾個這些蛋白質(zhì)的組織周圍的怪物。平均數(shù)千這些環(huán)允許我們測量相對于具有亞納米精度的孔的中心不同nucleoporins的位置。然后，我們可以比較系統(tǒng)地構(gòu)成了所謂Nup107-160亞復(fù)合，這是NPC*大的建筑塊和孔結(jié)構(gòu)支架的主要組成部分nucleoporins的徑向位置。
圖1 ：一個U2OS細(xì)胞標(biāo)記的抗nucleoporin Nup133和綴合的Alexa Fluor 647的第二抗體抗體的核的底面。沿著傳輸軸線觀察個體的NPC如環(huán)狀結(jié)構(gòu)可見。比例尺：3微米。
如何將我們的核孔復(fù)合體的認(rèn)識現(xiàn)在要修改？
在我們*近的研究中，我們提供了Nup107-160亞復(fù)合的成員的位置約束，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們能夠解決一個長期存在的爭議中的字段：這個亞復(fù)合的取向的問題相對于所述傳輸軸。這是理解如何全國人大的結(jié)構(gòu)支架的組織又邁進(jìn)了一步。我們希望在未來，我們將能夠映射毛孔的所有蛋白質(zhì)并提供這一重要運(yùn)輸機(jī)械的綜合結(jié)構(gòu)模型。
請描述你剛剛開發(fā)相結(jié)合的成千上萬的*分辨率顯微鏡圖像達(dá)到低于一納米精度的方法。
雖然SR顯微鏡使我們能夠想象周圍的人大中心nucleoporins的組織，這些圖像的原始分辨率將不足以直接看到相同的亞復(fù)合個別蛋白質(zhì)之間的微小差異。因此，我們開發(fā)了一種分析方法，其染色的特異性標(biāo)記個別的NPC的許多圖像在空間仔細(xì)對齊的孔的中心，或者在標(biāo)記的第二信道的參考蛋白質(zhì)的位置，然后被相加，以產(chǎn)生的平均圖像（見圖2）。由于我們使用數(shù)千結(jié)構(gòu)相同的圖像，該注冊過程是非常精確的。我們?nèi)缓竽軌蛲ㄟ^用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型擬合平均信號，以確定熒光標(biāo)記物的位置。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，這種平均過程的精確度取決于在一定程度上的原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。為了使我們的測量不同的蛋白質(zhì)和實驗之間*可媲美并移除劣質(zhì)染色潛力的文物，我們實現(xiàn)了一個自動化的流水線分析控制參數(shù)，如定位精度和密度。關(guān)于生產(chǎn)的統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)據(jù)，我們可以在從GSDIM方法和一種有效的漂移補(bǔ)償（為SuMo）階段的可靠性和魯棒性另外的好處。
圖。2：例平均過程的結(jié)果。（一）一個NPC的形象標(biāo)記對Nup96抗體（高斯濾波）。（二）NPC的平均圖像用針對Nup96抗體通過比對了8000圖像各個孔和求和產(chǎn)生。（三）圍繞人大中心對Nup96熒光標(biāo)記物，從平均圖像的輪廓確定的平均位置。比例尺：0.1微米。
總而言之，我們的方法是通用的，可以測定相對于對稱結(jié)構(gòu)或參考蛋白質(zhì)具有亞納米精度和準(zhǔn)確度的中心的熒光標(biāo)記物的位置。應(yīng)用該方法的核孔的幾個不同的蛋白質(zhì)，我們可以相對于所述結(jié)構(gòu)的中心分配它們的相對位置。這個信息使我們能夠確定在NPC腳手架單亞復(fù)合的方向（參見圖3）。
圖3 ：應(yīng)用平均化過程在Nup107-160亞復(fù)合（由不同顏色描繪）的幾個表位，它們的相對位置可以被確定。染色是通過使用GFP融合蛋白的納米抗體的標(biāo)簽來實現(xiàn)。位置信息被覆蓋與NPC的細(xì)胞質(zhì)環(huán)的電磁結(jié)構(gòu)。電子密度圖的禮貌澳Medalia教授。
什么是必須克服的制備*分辨率樣本的一般障礙？您使用了這項研究有哪些標(biāo)記？
雖然工作在這個項目上，我們意識到，獲得盡可能*好的熒光標(biāo)記是在一個SR實驗中*關(guān)鍵的步驟之一，*分辨率方法一般需求更高質(zhì)量的樣品比傳統(tǒng)的顯微鏡。雖然幾個方面的樣品制備，如低背景和良好結(jié)構(gòu)的保存，是很重要的，這兩個*重要的限制因素，在我們的例子中是標(biāo)記試劑的大小，并且可以實現(xiàn)標(biāo)簽的密度。*初我們用間接免疫熒光法用抗nucleoporin抗體，這使得內(nèi)源性蛋白在細(xì)胞特異性標(biāo)記。但是，使用的抗體的一個主要限制是它們的大小-它們可能從目標(biāo)表位達(dá)15nm的偏移熒光團(tuán)。此外，我們的平均方法需要高密度的標(biāo)簽樣本。這是*可以實現(xiàn)具有非常高親和力的抗體，我們只能夠獲得這樣的試劑，我們有興趣。我們通過表達(dá)nucleoporins如GFP融合蛋白和染色樣品與小熒光解決這兩個問題的nucleoporins的一個子集標(biāo)記的抗-GFP的納米抗體，這是一個常規(guī)的IgG只有十分之一的大小，從而減少潛在的*過一半的偏移。重要的是，因為這個標(biāo)簽是由基因編碼它使我們能夠在一個簡單的和可比的方式標(biāo)注幾個nucleoporins。為了達(dá)到*大的標(biāo)記密度，我們通過RNA干擾耗盡內(nèi)源性未標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
你看到了使用新的GSD 3D技術(shù)在您的研究領(lǐng)域是什么可能性？
像所有的大蛋白復(fù)合物，人大是一個三維結(jié)構(gòu)，以了解它是如何建成的*分子組裝的各個部分的高解析度3D視圖將是必要的。盡管我們近期的研究提供了新的見解NPC支架的組織，我們只能確定一個方向nucleoporins的位置 - 沿孔隙的半徑。在3D進(jìn)行這種測量將更加翔實。
此外，我們相信，*高分辨率顯微鏡將成為不只是核孔，還包括其他大型集會的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的重要工具。這種簡化我們的分析 - 然而，在NPC的情況下，我們的事實，對核的底部幾百毛孔都可見相同的方向幫助。這種擇優(yōu)取向未找到許多其他有趣的多蛋白裝配的，而這種復(fù)合物的*分辨率結(jié)構(gòu)的研究只可能具有3D成像。