尼康顯微鏡，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）顯微鏡與熒光蛋白的基本原理
在活細胞中，動態(tài)的蛋白質(zhì)之間的相互作用被認為是發(fā)揮了關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及廣泛的其他關(guān)鍵流程。 在過去，經(jīng)典的生物化學(xué)方法，闡明了這種相互作用的機制是司空見慣，但是弱的或短暫的相互作用，可能會發(fā)生細胞內(nèi)的天然環(huán)境是這些技術(shù)通常是透明的。 例如，合作一直懷疑蛋白本地化合作伙伴使用固定細胞免疫熒光顯微鏡檢查相互作用在原地 ，并已提交了大量的文獻報道基于這種技術(shù)的常用方法。 然而，由于在熒光顯微鏡的分辨率小于一個典型的蛋白的大小為幾百倍，共定位往往導(dǎo)致有疑問的結(jié)果。 一個很好的比喻就是熒光顯微鏡產(chǎn)量相當(dāng)于知識的信息，說有兩個學(xué)生大講堂。 它不提供所需的分辨率，以確定學(xué)生是否在同一教室或更好，但如果他們坐在相鄰辦公桌。
典型的熒光顯微技術(shù)，依靠由一個波長（激發(fā)），然后由后續(xù)的二次熒光發(fā)射波長較長的光的熒光基團的吸收。 由幾十到幾百納米的激發(fā)和發(fā)射波長往往是彼此分開的。 與特定的熒光基團標(biāo)記的細胞成分，如細胞核，線粒體，細胞骨架，高爾基體，膜，使它們定位于固定和生活制劑。 同時通過標(biāo)簽的一些亞細胞結(jié)構(gòu)分隔的激發(fā)和發(fā)射光譜，專業(yè)熒光濾光片組合的單個熒光基團，可以被用來在一個單一的細胞或組織切片檢查標(biāo)記的分子接近。 使用這種技術(shù)，比光學(xué)分辨率極限是緊密聯(lián)系起來的分子似乎是重合（，說共定位 ）。 這種明顯的空間接近，分子締合是可能的。 然而，在大多數(shù)情況下，生物分子之間的相互作用，以確定是否發(fā)生正常的衍射極限的熒光顯微鏡的分辨率是不夠的。
共定位測量，在*好的情況是暗示誤導(dǎo)在*壞的情況下，特別是考慮到，許多信號傳導(dǎo)通路，使用相同的細胞結(jié)構(gòu)，例如，網(wǎng)格蛋白包被的凹坑是利用許多受體復(fù)合物內(nèi)在化。 兩個分子或蛋白質(zhì)的知識，其實是相鄰的，并不僅僅是居住在同一街區(qū)，提供了更可靠的確定其潛在的相互作用。 歷史悠久的電子顯微鏡技術(shù)有足夠的分辨率，以滿足高精度定位，精確的標(biāo)示方法，只是缺乏必要產(chǎn)生可靠的結(jié)果。 此外，許多的合作定位技術(shù)一般應(yīng)用于使用固定的細胞內(nèi)，這就排除了非?？扇〉膭討B(tài)測量檢測活細胞達到。 多色的熒光蛋白的熒光成像容易地允許與活細胞的實驗，這是必要的瞬時相互作用的檢測，但該方法受到限制到約200納米的具有相對較差的空間分辨率。
申請的福斯特（或熒光）共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的顯微技術(shù)測定蛋白質(zhì)分子的空間接近的限制是可以克服的。 發(fā)生FRET之間的正確定位的熒光基團，只有當(dāng)它們分開的距離是8到10納米或更小。 因此，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是非常適合于定位在幾納米彼此的兩個分子之間所發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)查。 在過去的十年里，F(xiàn)RET方法已經(jīng)得到普及，由于在應(yīng)用中需要使用的特定蛋白質(zhì)和多肽融合綠色熒光蛋白（GFP）及其突變衍生物基因靶向的崛起。 兩個光譜上不同的熒光蛋白（稱為FP-FRET）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移已被廣泛地應(yīng)用于兩個明顯分開的實驗技術(shù)，如下面所討論。 圖1給出的是一個雅布隆斯基參與之間的供體發(fā)射和受體吸收FRET耦合激發(fā)態(tài)躍遷能量圖。 吸收和發(fā)射的轉(zhuǎn)換表示的直線的垂直箭頭（藍色，綠色和紅色），而波浪形的黃色箭頭指示的振動弛豫。 雅布隆斯基圖表明其正確位置，他們應(yīng)該出現(xiàn)從光子介導(dǎo)的電子躍遷的虛線繪制的耦合轉(zhuǎn)換。 在一個合適的接受體的存在下，供體熒光團激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移受體直接而發(fā)射一個光子（紫羅蘭色的圖1中箭頭所示）。 將所得的熒光敏化發(fā)射具有受體的發(fā)射光譜的特征相似。
廣泛實施的主要障礙之一FRET技術(shù)在活細胞中的調(diào)查一直缺乏合適的方法，用適當(dāng)熒光標(biāo)記特定的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。 *近開發(fā)的熒光蛋白，具有廣泛的光譜和日益復(fù)雜的蛋白嵌合體（融合以及生物傳感器）已經(jīng)導(dǎo)致了一些潛在的熒光蛋白對，是非常有用的FRET實驗。 FRET熒光蛋白的應(yīng)用涉及到兩個不同的蛋白質(zhì)，每個不同的熒光蛋白融合將選定的一成生物傳感器（一個單一的基因編碼的結(jié)構(gòu)）或間進行測量。 后一種方法已被用于圖像的各種蛋白質(zhì)的相互作用，包括受體的寡聚化和闡明轉(zhuǎn)錄因子的功能。 然而，進行FRET檢測的獨立蛋白嵌合體是困難得多，由于可變化學(xué)計量時，不可避免地發(fā)生在活細胞中表達獨立的熒光實體。 不管難度，這種性質(zhì)的實驗可以得到信息的結(jié)果，當(dāng)安裝了適當(dāng)?shù)目刂?，并以嚴格的精度進行調(diào)查。
熒光蛋白質(zhì)傳感器
熒光蛋白的生物傳感器已廣泛的實用匯報多樣化的胞內(nèi)過程。 通過創(chuàng)造性地融合對執(zhí)行關(guān)鍵功能，涉及各方面的生理信號的生物聚合物的熒光蛋白，研究的科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出了一系列新的分子探針，可用于光學(xué)活細胞成像的重要過程，如鈣波感應(yīng)，循環(huán)核苷酸信使作用，pH值的變化，膜電位的波動，磷酸化和細胞內(nèi)的蛋白酶行動。 另一種方法，但非常有用的，戰(zhàn)略生物傳感器建設(shè)涉及熒光蛋白骨架結(jié)構(gòu)本身的修改，要么肽分割成個別單位相結(jié)合， 在體內(nèi)產(chǎn)生熒光（一種技術(shù)被稱為雙分子熒光互補;BiFC ）或加入天然的氨基和羧基末端，并創(chuàng)建一個插入位點的分子內(nèi)傳感器肽。
*熒光蛋白質(zhì)的生物傳感器是一個鈣離子指 示劑卡 默萊昂 ，夾著蛋白鈣調(diào)素和鈣的鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肌球蛋白輕鏈激酶（M13域）之間的增強的藍色和綠色熒光蛋白（EBFP和EGFP）構(gòu)成。 在水平的不斷提高細胞內(nèi)鈣離子的存在下，M13域結(jié)合的鈣調(diào)蛋白的肽，以產(chǎn)生增加的熒光蛋白之間的FRET。 不幸的是，該傳感器由一個非常低的動態(tài)范圍（熒光增加了1.6倍）阻礙，很難想象，由于缺乏亮度和耐光性較差EBFP。 YFP的衍生物（稱為camgaroos）生成的鈣敏感的肽插入在開始的第七β時，使用相同的模板，將青色和黃色的變種ECFP和EYFP，得到較高的信號電平，和甚至更好的結(jié)果，得到的改進的版本鏈熒光蛋白骨干。 位于這種不尋常位置傳感器肽是相當(dāng)良好的耐受性方面保持高水平熒光。 然而，另一種策略利用**的桶結(jié)構(gòu)常見的熒光蛋白重新配置的蛋白質(zhì)的端部連接的天然N末端和 C末端，并創(chuàng)建一個新的起始密碼子的結(jié)構(gòu)的中央?yún)^(qū)域內(nèi)（通常在幾個位置之一了循環(huán)）。 稱為循環(huán)置換熒光蛋白，這些結(jié)構(gòu)修飾衍生物可以稠合鈣調(diào)蛋白和M13，產(chǎn)生極好的鈣的生物傳感器。
緊接著遺傳指標(biāo)，pH值，磷酸化，和蛋白酶活性鈣的生物傳感器。 一般有兩種方法可用于以適應(yīng)熒光蛋白的pH值的傳感器。 首先依賴于綠色熒光蛋白的熒光靈敏度（的pKa = 5.9）和EYFP（pKa值= 6.5）結(jié)合的其它蛋白質(zhì)的相對不敏感性，如ECFP（pKa值= 4.7）或紅色熒光蛋白 （的pKa = 4.5）的酸性環(huán)境。 與較不敏感的熒光蛋白EGFP或EYFP融合建立一個比例的探頭，可用于測量細胞內(nèi)的酸度。 第二種方法依賴于質(zhì)子改變原生（野生型）的GFP導(dǎo)致雙峰式頻譜公司的天然蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變。 A類的探針命名的pHluorins，來自wtGFP，具有激發(fā)峰值從470到410納米的pH值下降的轉(zhuǎn)變。 雙排放pH傳感器也得到了發(fā)展，在綠色和藍色光譜區(qū)域有峰。 雖然無法實時報告激酶活性，磷酸化的生物傳感器包括含有從一個特定的激酶和一個之間夾持兩個FRET能力的熒光蛋白的磷酸化肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸化基序的肽。 由激酶磷酸化的生物傳感器，磷酸肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸化的序列結(jié)合，從而調(diào)用或破壞FRET。 這個簡單的策略已經(jīng)被證明產(chǎn)生**和高度特異性的生物傳感器。 與許多其它生物傳感器的主要缺點是降低了動態(tài)范圍。
也許*廣泛使用的生物傳感器的設(shè)計，篩選新的或改進的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，對涉及到的蛋白酶裂解位吸附試驗（參見圖2）。 簡單的圖案由兩個聯(lián)系在一起的，其中包含一個共識的蛋白酶裂解位點的短肽熒光蛋白。 在一般情況下，該傳感器具有非常強的能量轉(zhuǎn)移裂解接頭序列后，完全取消。 由于該技術(shù)通常具有高動態(tài)范圍的水平，它可以被用于篩選新的青色和綠色熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體與黃色，橙色和紅色的受體。 *大的家族蛋白酶的生物傳感器，采用了敏感的裂解位點的半胱天冬酶家族的蛋白酶，使傳感器可誘導(dǎo)細胞凋亡過程中檢查。 在過去的數(shù)年中，大量的新穎的生物傳感器，同時使用敏化熒光蛋白和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對已有報道。盡管繼續(xù)FRET傳感器采用ECFP和EYFP衍生物的動態(tài)范圍的限制，這一策略已被廣泛采用，這可能是由于簡單的比例測量探頭建設(shè)，緩解。 新戰(zhàn)略將毫無疑問出現(xiàn)使用更*的服務(wù)，以增加這個非常有用的一類探頭的動態(tài)范圍等性能的熒光蛋白組合。
FRET基本原理
捐助熒光FRET涉及電子激發(fā)態(tài)中，這可能會激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到附近的受體熒光（或發(fā)色團）在非輻射的方式，通過遠程偶極 - 偶極相互作用的基本機制。 的理論支持的能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的治療激發(fā)熒光團的振蕩偶極子與第二偶極子具有相似的諧振頻率，可以進行能量交換的概念。 在這方面，共振能量轉(zhuǎn)移是類似于耦合振子的行為，如在相同的頻率或無線電天線的一對音叉振動。 與此相反，輻射能量轉(zhuǎn)移需要發(fā)射和重新吸收光子，并依賴于試樣的物理尺寸和光學(xué)性質(zhì)的，以及容器的幾何形狀的波陣面途徑。 共振能量轉(zhuǎn)移和輻射機制不同，可以產(chǎn)生顯著量的結(jié)構(gòu)信息有關(guān)的供體 - 受體對。
周邊溶劑殼熒光團共振能量轉(zhuǎn)移是不敏感的，因而產(chǎn)生*的溶劑相關(guān)的事件，如熒光猝滅，激發(fā)態(tài)反應(yīng)，溶劑松弛，或各向異性的測量揭示的分子信息。 參與共振能量轉(zhuǎn)移的熒光團的主要溶劑的影響是供體和受體的光譜特性的影響。 在更長的距離比短距離的溶劑效應(yīng)和介電性質(zhì)的成分（溶劑和主機大分子）的位置所涉及的熒光團之間的無輻射能量轉(zhuǎn)移發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移的功效上具有非常小的影響，這主要取決于供體和受體熒光基團之間的距離。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象還沒有介導(dǎo)的光子發(fā)射，并且，甚至不要求受體生色團是熒光。 然而，在大多數(shù)應(yīng)用中，供體和受體熒光能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生通過供體熒光淬滅的熒光壽命的減少，也伴隨著受體的熒光發(fā)射的增加體現(xiàn)。 特奧多爾·福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的理論*初是開發(fā)，以紀念他的貢獻，*近被他的名字命名。 福斯特理論表明，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（E）的兩個分子之間的距離（用r表示）的倒數(shù)第六功率變化：
EFRET = 1/[1 + (r/R0)6]
其中，R（0）為特征的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率為50％，這可以計算出任何對這個變量也被稱為福斯特半徑，并在下面更詳細地討論）的熒光分子（距離。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的理論熒光基團對（增強型青色和黃色熒光蛋白）以圖形方式顯示在圖3（a）。 由于逆第六電源依賴于兩分子之間的相關(guān)（r）的距離，該曲線具有一個非常急劇下降。 距離小于R（0），熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率接近*大，而距離大于R（0），效率迅速趨近于零。 有用的范圍，用于測量FRET的紅色與0.5和1.5×R（0）的限制，在圖3（a）中的陰影區(qū)域所示。 FRET技術(shù)可以有效地使用這些距離接近R(0)作為分子的統(tǒng)治者 ，而事實上FRET已被改編為結(jié)構(gòu)生物學(xué)等用途的通過精密光譜方法。 然而，對于大多數(shù)應(yīng)用中在細胞生物學(xué)中，可用的信號 - 噪聲比限制FRET實驗更二進制讀出。 作用時，一個測量往往會只能夠區(qū)分FRET高和低-FRET，或簡單地之間的FRET的存在和缺乏。
正如前面所討論的，R(0)，可以容易地計算出任何對熒光分子。 R（0）的值在水性溶液（或緩沖）由一個相當(dāng)簡單的方程與完善的輸入?yún)?shù)：
R0 = [2.8 x 1017 × Κ2 × QD × ΕA × J(λ)]1/6 nanometers
Κ(2)或卡伯平方的兩個熒光團之間的偶極子（參見圖3（b）就用于計算取向因子的角度概要）表示的取向因子，Q(D) 是供體的量子產(chǎn)率，Ε(A)是*大的受體在每厘米相互摩爾消光系數(shù)，和J(λ)是光譜的重疊積分（參見圖4）,F(D)(λ)之間的歸一化供體熒光，激發(fā)光譜和受體，E(A)(λ) ，根據(jù)公式：
J(λ) = FD(λ) × ΕA(λ) × λ4dλ
雖然可能會出現(xiàn)復(fù)雜的數(shù)學(xué)，大多數(shù)參數(shù)是常數(shù)，在文獻中很容易被發(fā)現(xiàn)。 的兩個*重要的方面，通常需要進一步的解釋Κ（2）和J（λ），重疊積分。 取向角變量（Κ（2））只是表示該FRET耦合取決于兩個熒光團之間的角度大致相同的方式的無線天線的位置可能會影響其接收。 如果供體和受體的相互平行地排列，F(xiàn)RET的效率會更高比，如果他們是面向垂直。 這種程度的對應(yīng)定義Κ（2）。 雖然Κ（2）可以在0和4之間會發(fā)生變化，它通常是假定為2/3，這是集成了所有可能的角度的平均值。 對于幾乎任何現(xiàn)實的情況κ（2）接近2/3，而且通常研究者可以做調(diào)整這個值無關(guān)（雖然有些生硬地把他們的目標(biāo)蛋白質(zhì)的利益附加熒光蛋白質(zhì)，這可能導(dǎo)致戲劇性效果）。 重疊積分，J（λ）時 ，是兩光譜之間的重疊區(qū)域，如在圖4中示出。的其他參數(shù)，可能會影響FRET的供體和受體的消光系數(shù)的量子產(chǎn)率。 因此，為了*大限度地提高FRET信號，研究者必須選擇量子產(chǎn)率*高的供體，*高吸收的受體，熒光基團，具有顯著的重疊，在它們的光譜公司。 這一理論被反復(fù)通過實驗驗證，有沒有其他機制，以*大限度地提高非對齊的熒光探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
應(yīng)當(dāng)指出，上面所討論的每一個參數(shù)的影響僅由第六電源福斯特半徑計算。 因此，增加一倍的供體的量子產(chǎn)率只有12.5％的R（0）的變化結(jié)果。 因為幾乎所有熒光FRET成像實驗具有很高的量子產(chǎn)率（大于0.5）和消光系數(shù)（大于50,000），可能福斯特半徑值的范圍是有限的4至6納米，和大多數(shù)FRET對的平均值R（0）?5納米。 由于FRET效率強烈地依賴于分離以及FRET對的熒光基團的相對方向的距離，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可以用來檢測蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的變化，這兩種蛋白之間的親和力或變動的變動他們的結(jié)合的構(gòu)象。 這是值得重復(fù)的是，對于大多數(shù)FRET成像在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用，實驗一般區(qū)分只有兩種狀態(tài)之間（FRET沒有FRET）和附加信息是必要的助手解釋所觀察到的，在分子FRET變化。
FRET測量影響因素
在實踐中，廣泛的問題可以復(fù)雜和/或妥協(xié)FRET測量，*終導(dǎo)致含糊或無意義的結(jié)果。 其中的主要問題是成像時，供體和受體熒光基團，可能會表現(xiàn)出明顯不同的亮度級別。 雖然從理論上說，這種差異不應(yīng)該是一個問題，但是在實踐中，因為大多數(shù)儀器可以測量只有有限的動態(tài)范圍，雙熒光成像可能會導(dǎo)致飽和（對于較亮的熒光基團），而另一個通道主要是由系統(tǒng)的一個通道噪音調(diào)光熒光。 因此，只要有可能，*好使用一個供體和受體，可比亮度。
另一個因素，可以限制檢測FRET的供體 - 受體的化學(xué)計量，是在10:1和1:10之間的范圍之外。 這個因素可能是一個嚴重的限制FRET測量蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，其中一個合作伙伴可能是多余濃度。 主要問題是不接受FRET熒光標(biāo)記的背景FRET小級別的測量。 由于這樣的事實，實在沒有什么可以做，以改善這種情況，主機蛋白質(zhì)相互作用可能落入這一類的實驗是根本不適合考試FRET技術(shù)。 對于如上所述，只有一個單一的供體和受體的構(gòu)造的熒光蛋白質(zhì)的生物傳感器，化學(xué)計量比是固定的，保證為1:1，因此，此問題不會出現(xiàn)的信號電平保持恒定，無論濃度的生物傳感器。
在場的流血通過（也稱為串?dāng)_和交叉 ）和頻譜重疊熒光團之間的交叉激勵也很重要的問題，可以阻礙FRET調(diào)查（參見圖5）。 在某些情況下，受體可以直接與選擇的波長區(qū)域中的光激發(fā)，以激發(fā)供體（圖5（a））。 此外，從供體的熒光泄漏到受體熒光的檢測通道，尤其是當(dāng)供體和受體的發(fā)射光譜公司表現(xiàn)出顯著的重疊（圖5（b））。 因為這兩個來源的串?dāng)_產(chǎn)生的有機熒光的光物理必定是目前任何FRET對，他們必須解決的時候FRET測量。 選擇是很好的分離光譜的熒光團，是一個很好的機制，以減少串?dāng)_。 然而，在大多數(shù)情況下的光譜分離的增加也減少了重疊積分（J（λ）），這在實踐中通常被轉(zhuǎn)化為能力下降，檢測到FRET信號。
*后，兩個熒光基團，如果沒有正確對齊的信號可以被減少（例如，具有Κ（2）的值近似為零），或當(dāng)它們存在根本就沒有定位在福斯特半徑（大于6納米水平的FRET ）。 作為一個例子，如果兩個標(biāo)記的蛋白質(zhì)相互作用，但位于配合物的相對側(cè)上的熒光標(biāo)記，則有可能無法檢測到FRET信號，即使感興趣的蛋白質(zhì)綁定。 在一般實踐中，這種類型的假陰性是相當(dāng)普遍的，特別是與熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移貿(mào)易伙伴。 通常情況下，一些標(biāo)記策略之前，需要有足夠和可靠的FRET信號被檢測到。 然而，上述問題可以得到緩解（或部分）的矢量結(jié)構(gòu)或進行合成標(biāo)記實驗之前使用的熒光對明智的選擇。
如圖5所示的重疊中的激發(fā)和發(fā)射光譜ECFP和mVenus的，目前*優(yōu)選的熒光蛋白對FRET調(diào)查。 激發(fā)（圖5（a））和發(fā)射光譜（圖5（b）），這兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相當(dāng)大的重疊。 直接激發(fā)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體（mVenus;紅色曲線）可以是顯著的波長取決于用于激發(fā)的供體（ECFP;青色曲線或mCerulean的藍色曲線），由于較高的消光系數(shù)黃色蛋白相比，青色蛋白。 這種重疊是特別成問題的ECFP的作為給體使用時，可以部分抵消了具有高消光系數(shù)，如mCerulean使用CFP的變種。 請注意，在圖5（a）中的勵磁曲線按比例繪制的，以反映黃色和青色蛋白之間的消光系數(shù)的差異。 激發(fā)波長為458納米，產(chǎn)生一個更高的水平的mVenus激發(fā)串?dāng)_比激發(fā)波長為405納米或440納米。 ECFP廣泛的熒光發(fā)射光譜（圖5（b）條）顯示出相當(dāng)大的強度重疊，整個區(qū)域發(fā)射mVenus。
FRET技術(shù)在細胞生物學(xué)應(yīng)用
調(diào)查采用熒光蛋白的生物傳感器，或試圖匹配的化學(xué)計量融合熒光探針分離相互作用的目標(biāo)，應(yīng)使用盡可能多的不同F(xiàn)RET分析技術(shù)可行的建立對于一個給定的實驗方法。 這種努力是必要的，因為每個熒光蛋白FRET對具有不同的病理，其使用的復(fù)雜性，需要清楚地了解應(yīng)用光學(xué)顯微鏡參數(shù)測量相對較小的信號差異在大多數(shù)FRET檢測。 一旦系統(tǒng)和可能的結(jié)果是確定無疑的，則*簡單的辦法可以用于正在進行的程序。 列表中的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到圖像FRET是相當(dāng)廣泛的。 在一般情況下，所有現(xiàn)有的測量策略可應(yīng)用于FRET熒光蛋白實驗，但基于現(xiàn)實的考量，一般的方法已被證明特別有用：
敏排放 -雙通道成像使用一種算法，糾正串?dāng)_激發(fā)和發(fā)射
受體漂白 -也被稱為施主去猝滅受體光漂白時，這種技術(shù)措施增加了供體發(fā)射
熒光壽命成像顯微鏡（FLIM） -熒光蛋白（或其他熒光）體壽命測量的變化
光譜成像 -令人興奮的一個或兩個波長，測量供體和受體的完整光譜剖面
熒光偏振成像 -測量偏振平行和垂直于激發(fā)高信號噪聲
每個FRET以上列出的方法都有長處和短處。 例如，在一方面中，兩個通道成像法是*簡單，但需要*復(fù)雜的控件集。 另一方面，F(xiàn)LIM的可以得到明確的測量FRET效率，但是昂貴的，尚未廣泛地提供給大多數(shù)細胞生物學(xué)實驗室儀器儀表來測量納秒壽命。
敏發(fā)射
通常也被稱為二色比與對照成像 ，敏化發(fā)射可能是*簡單的成像方法，熒光共振能量轉(zhuǎn)移。的供體熒光團的激發(fā)的特定波長（在寬視場或共聚焦顯微鏡），收集的信號被通過使用選擇供體熒光和受體熒光的發(fā)射濾光片。 的兩個熒光團的激發(fā)波長和熒光之間的串?dāng)_（不現(xiàn)實）不存在，那么敏化發(fā)射將是一個**的方法。 然而，熒光蛋白之間的串?dāng)_是一個重大的問題，通常需要廣泛的控制實驗建立的FRET的存在或不存在。 因此，它是很難獲得定量準(zhǔn)確FRET使用這種方法的數(shù)據(jù)。 敏化發(fā)射是相對簡單的配置上的寬視場熒光顯微鏡下，可以在許多實驗室中，但必要的對照實驗，需要相當(dāng)大的圖像處理減去串?dāng)_分量，這顯著增加噪音水平測量中的不確定性。
糾正的辦法已經(jīng)制定各種致敏發(fā)射FRET成像。 的基本概念涉及多個樣品，含有：供體，只受體，和推定的FRET的供體和受體的樣品使用不同的過濾器組合。 從這些樣本的排放值允許研究者量來確定預(yù)期串?dāng)_的激發(fā)和發(fā)射通道和減去它FRET測量。 在理論上，這種方法效果很好，但不幸的是，圖像處理的要求增加噪音水平在所有的圖像。 因此，如果FRET信號分鐘，那么它可能是難以測量的FRET使用這種方法。
盡管存在上述困難，F(xiàn)RET信號是由于大的能力，同時獲得兩個圖像進行快速動態(tài)實驗，致敏發(fā)射測量可以是有用的。 研究FRET的動態(tài)范圍大，以1:1的比例是固定的供體和受體的化學(xué)計量的熒光蛋白的生物傳感器時，敏化發(fā)射是一個特別有吸引力的技術(shù)。 一個很好的例子是的蛋白酶生物傳感器，如圖2所示。 這種嵌合體已設(shè)計有很高的FRET效率下降基本上為零時酶解肽連接。 其結(jié)果是一個大和容易測量的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，演示了在一個給定的時間和區(qū)域的特定的蛋白酶活性，在活細胞內(nèi)的變化。
受體漂白
雖然只限于一個單一的測量，受體漂白（或捐助去猝滅）是一個簡單的技術(shù)，往往效果極佳。基本概念利用捐助者的熒光淬滅FRET期間，因為一些捐助熒光能量輸送到受體的事實。 受體熒光光漂白的不可逆消除淬火效果，并增加了供體的熒光水平。 FRET熒光團之間發(fā)生，捐助熒光受體被刪除時，必須增加。 在一般情況下，重要的是要確保該受體光漂白不會降低供體熒光，至其初始值的大約10％的光漂白受體。 容易滿足這些約束同時用激光掃描共聚焦顯微鏡，但也可以實現(xiàn)與寬視場或旋轉(zhuǎn)盤顯微鏡配備一個專門的照明系統(tǒng)的。
受體漂白技術(shù)的優(yōu)點是非常簡單的，定量的，只用一個單一的樣本進行。 減去漂白后其強度受體在受體的存在下從供體強度，然后漂白后的供體強度的歸一化該值，可以計算出的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。 的主要缺點是，受體光漂白是破壞性的，可以只使用一次，限制了它的應(yīng)用程序，這些實驗中不涉及與動態(tài)測量每個單元格。 此外，光漂白是一個相對緩慢的過程，通常需要幾分鐘或更長時間。 然而，它幾乎總是值得執(zhí)行受體漂白測量的實驗結(jié)束時，無論取的方法被用于測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
圖6中的例子致敏排放和受體漂白FRET實驗用活細胞成像。 圖6（a）示出一個人宮頸癌癌上皮細胞（HeLa細胞線）表達一個卡默萊昂生物傳感器包括具有介于其間的鈣敏感的肽，含有鈣調(diào)素和M13域（如上所述）熔合在一起的mCerulean mVenus的。 之前，除了鈣誘導(dǎo)劑（離子霉素），激發(fā)細胞與440納米照明產(chǎn)生青色熒光指示缺乏青色和黃色熒光蛋白（圖圖6（a））之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。 添加伊屋諾霉素，縮時后記錄兩色比成像（致敏發(fā)射）穿過細胞質(zhì)中的鈣波的生物傳感器響應(yīng)增加的電平之間的熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（圖6（b）和圖6（c） FRET pseudocolored黃色，紅色）。 的非洲綠猴腎細胞（COS-7行），如圖圖6（d） - （f）項標(biāo)記的合成花青染料Cy3標(biāo)記（圖6（2），綠色）和Cy5（圖6（五）;紅），霍亂毒素B亞單位結(jié)合，并定位在質(zhì)膜。 于膜中，接近的兩種染料的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生一個高的水平。 漂白Cy5的細胞的選定區(qū)域（白色方塊圖第6（e））中，增加了供體去猝滅（在圖6（f）條的綠色熒光增加）時，在相應(yīng)的區(qū)域可視熒光供體通道。
熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM）
壽命測量是**為止*嚴格的方法，用于確定熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此外，它們也不易出現(xiàn)到串?dāng)_工件由于這樣的事實，只有供體熒光監(jiān)測。 所有熒光分子具有一個指數(shù)衰減，在納秒時間刻度上的熒光，并消減率是敏感的熒光猝滅的環(huán)境變量。 因此，F(xiàn)LIM的基本概念有點關(guān)系受體光漂白。 該供體的熒光被淬滅的熒光共振能量轉(zhuǎn)移相互作用，淬火的量可以通過測量存在FRET的供體熒光衰減時間的減少來確定。 以這種方式，F(xiàn)LIM的FRET效率提供了一個確定的值。 其中合并FLIM-FRET的測量的優(yōu)點是不敏感受體激發(fā)工件定向，以及事實上可以被耦合到熒光供體的受體本身不是熒光。 這兩方面都有助于擴大一些有用的熒光蛋白FRET對調(diào)查。
FLIM有諸多限制，防止它主要的方式FRET成像。 主要是復(fù)雜的，在納秒壽命區(qū)的測量和檢測儀器是昂貴的取得和保持。 此外，這種類型的精密的設(shè)備沒有得到廣泛的使用。 此外，F(xiàn)LIM通常是在較慢的成像方法，可能需要幾分鐘的時間，獲取每一個形象，這限制了它在許多實用FRET實驗。 解除這些限制可能會在未來更加人性化和更快的交鑰匙商業(yè)系統(tǒng)的開發(fā)廠家。 另一個顯著的缺點是，在活細胞中的熒光蛋白的壽命往往顯示多指數(shù)衰減，需要更全面的數(shù)據(jù)分析進行定量FRET檢測。 此外，本地化的環(huán)境因素，如自體熒光，或改變pH值，也可以測得的熒光壽命縮短，導(dǎo)致工件。 因此，必須采取極為謹慎的解釋活細胞FLIM-FRET數(shù)據(jù)。
光譜成像
光譜成像技術(shù)是致敏發(fā)射變化FRET檢測方法，但被收集后，而不是采集數(shù)據(jù)，通過兩個獨立的通道，整個發(fā)射光譜同時含有供體和受體熒光激發(fā)捐助。 錄制整個頻譜是一個典型的用于光譜實驗的方法，但是是一個相對較新的工具調(diào)色板除了在廣角和共聚焦顯微鏡。 的概念中心的前提下，使收集的整個熒光光譜重疊光譜分離不只是使用的發(fā)射峰，但不同的形狀的譜尾。 在收集從供體和受體熒光團的頻譜，它是可能的，以確定供體和受體熒光的相對水平。
光譜成像技術(shù)需要專門的設(shè)備，但*的系統(tǒng)都是現(xiàn)成的許多商業(yè)共聚焦顯微鏡，可以添加到常規(guī)熒光顯微鏡以溫和的代價。 由于受體的直接激發(fā)，或在共聚焦顯微鏡中使用的激發(fā)波長的串?dāng)_水平進行了定量分析，允許FRET的量的準(zhǔn)確測定。 這種方法的主要缺點是減少與獲得完整的頻譜，而不是通過兩個通道與一個過濾器為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中收集相關(guān)的信號對噪聲比。 然而，隨著越來越多的商業(yè)系統(tǒng)中，正在開發(fā)和安裝的應(yīng)用光譜成像在熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測增加。 在不久的將來，它是光譜成像很可能會成為執(zhí)行的主要方法之一FRET成像實驗。
圖7所示的（a）中的變化捐助終身衰減（mCerulean熒光蛋白）組成的10氨基酸接頭融合在一起的mCerulean mVenus熒光蛋白偽FRET生物傳感器。 藍色衰減曲線觀察細胞表達mCerulean單獨的一生，而紅色衰減曲線呈現(xiàn)mCerulean的的一生時獲得細胞表達的級聯(lián)蛋白。 注意蛋白參與共振能量轉(zhuǎn)移時的在壽命mCerulean減少。 曲線之間的區(qū)域表示通過FRET從mCerulean（供體）mVenus（受體）在FRET配對轉(zhuǎn)移的能量。 從450到650的納米mCerulean mVenus活細胞在405納米的激發(fā)時，在相同的偽生物傳感器的發(fā)射曲線由圖7（b）中紅色曲線描繪。 轉(zhuǎn)移的能量從mCerulean到的主要發(fā)射峰（的mVenus*大發(fā)射529納米），具有非常低的值（約25％），在475納米，峰值發(fā)射波長為mCerulean mVenus結(jié)果。 用514納米的激光漂白后mVenus的和重復(fù)的光譜掃描，發(fā)射配置文件轉(zhuǎn)移到更低的波長和非常相似的頻譜mCerulean沒有一個FRET伙伴。 在475和529納米的光譜強度的差異有關(guān)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率之間的耦合的蛋白質(zhì)。
極化各向異性成像
熒光偏振測量提供**的優(yōu)勢為高對比度歧視熒光蛋白FRET。 這個概念是基于這樣的事實，與偏振光的激發(fā)的熒光分子的吸收載體平行排列的激發(fā)光的偏振矢量選擇人口。 激發(fā)后，立即將保持偏振平行的熒光發(fā)射的，可以考慮，使激發(fā)的熒光偏振各向異性。 各向異性會消失，如果分子旋轉(zhuǎn)在納秒熒光壽命。 然而，由于熒光蛋白大，并慢慢旋轉(zhuǎn)，其熒光不會去極化在測量時間內(nèi)場進行任何重要程度。 如果發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移之間的兩種熒光的蛋白質(zhì)，是稍有錯位，那么偏振的熒光發(fā)射，會出現(xiàn)在不同的角度（從激勵矢量），它模擬了一個旋轉(zhuǎn)的熒光蛋白。
這種方法的主要優(yōu)勢是易于測量熒光偏振平行和垂直于具有高信號對噪聲的激勵矢量。 由于極化各向異性數(shù)據(jù)可以迅速獲得與*小圖像處理要求，該技術(shù)非常適合應(yīng)用在高內(nèi)涵篩選。 受體的直接激發(fā)，必須避免，但是，因為它可以減少供體信號和減少的信號噪聲比的測量。 此外，雖然這項技術(shù)是*的FRET的存在和不存在區(qū)別，它是強與弱之間的FRET區(qū)分不是一個好方法。 *后，偏振可以降低在高數(shù)值孔徑物鏡，所以偏光FRET實驗應(yīng)限于具有的數(shù)值孔徑為1.0或更小的目標(biāo)成像。
如圖8所示是使用熒光蛋白作為模型系統(tǒng)的偏振各向異性的圖解說明。 當(dāng)被激發(fā)的熒光蛋白（圖8（a））的隨機取向的人口與直線偏振光（青色波），只有那些分子，其吸收偶極向量取向平行于偏振方位角優(yōu)先興奮。 排放的方向正確的熒光蛋白質(zhì)，可以觀察到作為信號使用的分析儀的激發(fā)光的偏振矢量（綠色波）也平行。 由此產(chǎn)生的各向異性，這是取向度的一個指標(biāo)，可以通過垂直和水平方向的分析儀，通過測量和比較的發(fā)光強度決定。 的各向異性的信號電平將降低，如果熒光蛋白的旋轉(zhuǎn)在時間刻度中的實驗（圖8（b））或轉(zhuǎn)移，則其激發(fā)能量，由于FRET具有不同方向的相鄰的蛋白質(zhì)（圖圖8（c））。 如上所述，由于這樣的事實，可以發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移速度遠遠*過大熒光蛋白分子的分子旋轉(zhuǎn)，去極化由于FRET可以很容易地區(qū)別開來的各向異性，在旋轉(zhuǎn)過程中發(fā)生的損失。
FRET使用熒光蛋白的注意事項
在活細胞中用于檢查的選擇合適的探針FRET是有限的。 合成熒光，理想的共振能量轉(zhuǎn)移的調(diào)查，在固定的細胞，是難以管理，并在活細胞中的物鏡。 同樣，量子點可以利用標(biāo)簽?zāi)ぴM行檢查一個電池的外部的現(xiàn)象，但是，它們也無法滲透膜，因而很少使用如細胞核，線粒體，內(nèi)質(zhì)在細胞內(nèi)隔室網(wǎng)。 目前熒光蛋白基因編碼代表高分辨率成像FRET技術(shù)在活細胞中，證明了文學(xué)的體積每年的基礎(chǔ)上，在這個載物臺上發(fā)表的*佳。 但是，許多與合成的熒光基團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移和量子點的測量中遇到的典型的工件時，適用于熒光蛋白是特別嚴重的。30-40納米合成材料的發(fā)射光譜帶寬相反，例如，熒光蛋白的范圍從約60納米到100納米，往往導(dǎo)致重大重疊時，試圖分開供體和受體熒光。 熒光蛋白的廣泛的光譜也限制在FRET成像實驗中的其他類型的探針，可以一起使用的數(shù)量。 此外，熒光蛋白表現(xiàn)出很大的差異的亮度水平。 例如，一個*流行的捐助蛋白質(zhì)，ECFP，亮度比普通的黃色受體的合作伙伴，EYFP少五倍。
熒光蛋白生色周圍是220 +氨基酸多肽纏繞成一個三維圓柱結(jié)構(gòu)約2.4 4.2納米尺寸（稱為β-桶或β-CAN），組成廣泛的氫鍵多肽β-折疊片包圍和保護的中心含有的發(fā)色基團的α-螺旋結(jié)構(gòu)（見圖9）。 ***管的端部封端的半螺旋的肽區(qū)域，用于阻擋離子和小分子的條目。 如此緊密地包裝內(nèi)部的蛋白質(zhì)是氨基酸側(cè)鏈和水分子，氧，離子或其他侵入管理的小分子，穿過桶的兩端擴散的余地不大。 這些有利的結(jié)構(gòu)參數(shù)，這是部分負責(zé)的彈性的熒光蛋白的耐光性和優(yōu)異的性能，也有助于減少在熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。 大尺寸的桶，有效地屏蔽相鄰的熒光蛋白發(fā)色團與肽殘基（一個限制的接近距離為2至3毫微米，表示由圖9中的紅線），導(dǎo)致減少的*大熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率約為40理論值的％。 無論如何，F(xiàn)RET成像使用熒光蛋白活細胞的許多好處遠遠大于成本。
復(fù)合光譜帶寬重疊大小的問題，與發(fā)生熒光蛋白的高度是他們的傾向，低聚。 幾乎所有的熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)至少日期顯示的四級結(jié)構(gòu)中，例如通過弱的傾向，本機Aequorea victoria的綠色熒光蛋白及其衍生物的二聚化，在高濃度固定時，在有限的程度。 這種趨勢也驗證了原生的黃色，橙色和紅色熒光蛋白在珊瑚和?？ㄟ^嚴格的四聚動機。 乙烯齊聚在細胞生物學(xué)中的許多應(yīng)用中，可以是一個顯著的問題，特別是在熒光蛋白融合到主機的蛋白質(zhì)，是在一個特定的亞細胞定位的目標(biāo)的情況下。 一旦表達，誘導(dǎo)的熒光蛋白的嵌合體部形成二聚體和更高階低聚物可以產(chǎn)生不正常的本地化，擾亂正常功能，干擾信號級聯(lián)反應(yīng)，或限制的融合產(chǎn)物聚集在一個特定的細胞器或細胞質(zhì)中。 熒光蛋白融合本身參與天然的低聚物形成的貿(mào)易伙伴時，這種效果是特別顯著。 只有微弱的二聚體（實際上大多數(shù)水母維多利亞變種）與蛋白質(zhì)形成的Fusion產(chǎn)品可能不會出現(xiàn)聚集或不當(dāng)定位，提供本地化的濃度仍然很低。 然而，弱二聚體的熒光蛋白定位到特定的細胞區(qū)室，如質(zhì)膜，本地化的蛋白質(zhì)濃度，在某些情況下，成為高到足以使二聚化。 這可以是一個特定的問題時，進行分子間FRET實驗，可以產(chǎn)生復(fù)雜的數(shù)據(jù)集，通過二聚化偽影，有時損害。 另一方面，可以是天然存在的弱水母蛋白的二聚化，在某些情況下，用來增加FRET在生物傳感器中的信號，否則將具有有限的動態(tài)范圍。
毒性是一個問題的發(fā)生是由于合成熒光基團濃度過高和過度表達或較差聚集本地化熒光蛋白。此外，健康長壽的*佳標(biāo)記的哺乳動物細胞，在顯微鏡成像室也可以受到由眾多其它有害因素。 其中*重要的是，被熒光標(biāo)記的細胞反復(fù)暴露到從激光器和高強度的電弧放電燈的照明光引起的損傷（光毒性）。 在它們的激發(fā)態(tài)，熒光分子傾向于與分子氧反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，可以破壞亞細胞成分和危及整個電池。 熒光蛋白，由于這樣的事實，他們的熒光基團的保護的多肽包絡(luò)線內(nèi)被深埋，一般都不會對細胞的光毒性。 在設(shè)計FRET實驗，熒光蛋白的組合，顯示出可能的*長的激發(fā)波長的選擇應(yīng)以盡量減少對細胞的破壞，由短波長的照明，特別是在長期的成像實驗。 因此，而不是創(chuàng)造融合的產(chǎn)品和生物傳感器與藍色或青色熒光蛋白（興奮紫外線和藍光照明，分別），黃色，橙色和紅色區(qū)域的頻譜發(fā)射的變種，會更理想。
研究者應(yīng)照顧到采用新的熒光蛋白生物傳感器和細胞系時，進行必要的控制實驗，以確保細胞毒性和光毒性文物不掩蓋FRET結(jié)果或其他重要的生物現(xiàn)象。 在某些情況下，親脂性試劑誘導(dǎo)熒光蛋白的毒性，在成像過程中瞬時轉(zhuǎn)染后的細胞系，可能會混淆的有害影響。 低聚珊瑚的熒光蛋白（如上所述）有更大的傾向形成聚集體（結(jié)合較差的亞細胞定位）比單體的水母蛋白，但不正確折疊的融合產(chǎn)品可能發(fā)生的任何變種。 *近，一種熒光蛋白能夠產(chǎn)生活性氧（ROS）照明時綠燈已被報告為特定的蛋白質(zhì)失活生色團輔助光失活（CALI）的有效藥物。適當(dāng)名為KillerRed的 ，這個基因編碼的光敏劑是能殺死細菌和真核細胞后，在顯微鏡的照明。 EGFP光毒性的以前的研究表明，即使通過發(fā)色團是能產(chǎn)生單線態(tài)氧的熒光蛋白作為光敏劑的效率相對較低。 然而，長時間的照明表達EGFP的細胞及其變種可以導(dǎo)致生理改變和*終細胞死亡，光毒性的潛在的長期成像實驗中一個明確的信號。
熒光蛋白在活細胞實驗中，他們相比合成熒光漂白率減少由于擴展成像非常有利的。 雖然是在耐光性方面的熒光蛋白之間的互不相關(guān)的變異程度高，大多數(shù)變體是有用的短期成像（從1到25個捕獲），而一些更耐光的蛋白質(zhì)，可以采用在時間推移序列24小時或更長的時間跨度期間（聚集數(shù)百至數(shù)千張圖片）。 任何特定的蛋白質(zhì)的長期穩(wěn)定性，但是，必須為每一個照明場景（寬視場，激光共聚焦，多光子，掃描場，等等）進行調(diào)查，因為在光穩(wěn)定性的差異通常可觀察到由電弧產(chǎn)生照明時，具有相同的蛋白放電燈相對于激光系統(tǒng)。 因此，在耐光性方面，熒光蛋白的選擇取決于許多參數(shù)，包括照明條件下，表達系統(tǒng)，成像設(shè)置的有效性。
FRET潛在的熒光蛋白合作伙伴
在過去的幾年中，已開發(fā)出多種新的熒光蛋白變種和改進功能，涵蓋了200納米范圍內(nèi)（約450納米至650納米）的排放概況，從而填補了許多空白提供潛在有用FRET合作伙伴每一種顏色類。 發(fā)展在藍色（440納米到470納米）和青色（470納米到500納米）的蛋白質(zhì)譜地區(qū)的*新進展已經(jīng)取得了一些新的探測器，可能是用于成像和FRET調(diào)查。 三蛋白質(zhì)工程的研究小組報道了改進的藍色水母熒光蛋白的變種，具有顯著更高的亮度和光比EBFP。 名叫石青，SBFP2（堅決增強藍色FP），EBFP2（見表1），這些蛋白質(zhì)提供長期成功的活細胞成像中的藍色光譜區(qū)域的*個真正的希望，都具有重大組合的適用性與EGFP和衍生工具FRET生物傳感器。 *聰明和*耐光的新的藍色記者，EBFP2個，表現(xiàn)出典型的融合和GFP類似的行為，已被證明是一個很好的綠色光譜類蛋白在FRET捐助。 所有的藍色熒光蛋白可以很容易地在熒光顯微鏡下，使用標(biāo)準(zhǔn)DAPI過濾集或?qū)Ｓ蠦FP集可從廠家售后成像。
青色的光譜區(qū)域中的熒光蛋白已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于FRET捐贈者當(dāng)搭配黃色發(fā)光蛋白，主要由變體的原始多管水母 ECFP直到藍綠色的單體記者，被稱為mTFP1引進。青色熒光蛋白具有更高的亮度和酸穩(wěn)定性水母重點計劃相比，更為耐光。高的發(fā)光量子產(chǎn)率共mTFP1（見表1）提供了一個很好的替代，以青色衍生物mECFP和mCerulean的，黃色或橙色熒光蛋白結(jié)合時，作為FRET捐贈。其他調(diào)查已經(jīng)產(chǎn)生有用的蛋白質(zhì)在青色譜類。改進的青色熒光蛋白，*近被引入其中，CyPet和增強青色變種稱為天藍顯示*有希望的候選人融合標(biāo)簽，F(xiàn)RET生物傳感器，多色成像。西魯林是至少2倍的亮度*過ECFP，并已被證明是顯著增加對比度，以及信號-to-noise比當(dāng)它與黃色發(fā)射熒光的蛋白質(zhì)，如金星（見下文），在FRET調(diào)查。CFP名為CyPet的變種（的縮寫：CY é能源科技噸轉(zhuǎn)撥熒光P rotein ）來自通過一個**的戰(zhàn)略，利用FRET配對青色和黃色熒光激活細胞分選（FACS）來優(yōu)化。CyPet的一半左右光亮如蔚藍明亮EGFP和三分之二，但表現(xiàn)相對較差，在37攝氏度左右。然而，CyPet有藍移窄的熒光發(fā)射峰比CFP，這大大增加了其潛在的多色成像。
ECFP的單體的變種到有益的折疊突變的引入導(dǎo)致在生產(chǎn)新的變種，具有增強的亮度，折疊高效，溶解性，熒光共振能量轉(zhuǎn)移的性能。稱為*的重點計劃（SCFPs），新的記者是顯著的亮度比親本蛋白在細菌中表達時，在哺乳動物細胞中的幾乎2倍的更亮。這些高性能探頭應(yīng)該是有用的例行融合標(biāo)簽，并創(chuàng)造新的CFP-YFP FRET生物傳感器具有高動態(tài)范圍。另一種新的單體青色記者，TagCFP，是來自一個從水母水母macrodactyla的 GFP類似的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的具體的細節(jié)是無法在文學(xué)，但它是市售哺乳動物克隆載體和融合Evrogen的。TagCFP據(jù)報道，明亮的ECFP和西魯林相比，但類似的耐酸性。另一個青色發(fā)光蛋白，Midoriishi青色（簡稱MiCy）*初被設(shè)計為在新的捐助FRET單體Kusabira橙（人民圣戰(zhàn)者組織見表1）結(jié)合產(chǎn)生的生物傳感器具有高光譜重疊（福斯特的距離為5.3） 。這種蛋白質(zhì)具有吸收和發(fā)射波長*長的配置文件（分別為472和495納米）報告青色光譜區(qū)域中的任何探頭。由MiCy展出的高摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，使亮度相同的蛋白質(zhì)就是藍。
FRET對屬性的選擇熒光蛋白
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表1
目前*好的選擇活細胞成像FRET記者在綠色類（500納米到525納米），其中有EGFP父性質(zhì)類似于GFP衍生翡翠 。 翡翠包含EGFP F64L和S65T突變的特色，但該變種還具有四個額外的點突變，提高折疊，在攝氏37度的表達，和亮度。 *近，一個新的綠色光譜區(qū)域已經(jīng)創(chuàng)造*折疊GFP，這是更明亮，更耐酸比EGFP或翡翠，也有類似的耐光性。 因此，*折疊變應(yīng)與哺乳動物蛋白的融合是一個出色的候選人，并建設(shè)FRET生物傳感器，尤其是那些展示折疊的問題，標(biāo)準(zhǔn)的綠色熒光蛋白衍生物。 另一個明亮的熒光報道，這可能是一個很好的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的候選，被稱為AZAMI綠色，并已被隔離從石珊瑚Galaxeidae的 ，在哺乳動物細胞系中的表達過程中表現(xiàn)出快速成熟。 此外，還有兩個明亮，單體獲得的GFP記者通過現(xiàn)場指導(dǎo)和隨機突變庫篩選青色蛋白結(jié)合已有報道。 來自的Clavularia珊瑚屬，mWasabi是一個潛在的替代綠色發(fā)光FRET藍色熒光蛋白由于微不足道的吸光度在400納米的合作伙伴和更低的藍色變種往往興奮。 新綠記者市售（等位基因Biotechnology公司）和兩色成像連同長的斯托克斯位移（Stokes shift）的蛋白質(zhì)（如T-藍寶石 ），以及與目標(biāo)蛋白的融合本地化標(biāo)簽應(yīng)該是特別有用的。 的衍生物TagCFP，名為TagGFP，是一個充滿生機和單體綠色的變種，具有吸收*大發(fā)射482納米和505納米。 ，這是TagGFP只是稍微比EGFP亮，可作為克隆載體和融合從Evrogen標(biāo)簽，但一直沒有得到徹底的特點文獻報道。
黃色熒光蛋白（525納米到555納米）是*多才多藝的基因編碼的探頭，并應(yīng)提供考生作為供體和受體雙方FRET配對。 該變種水晶和金星被稱為是目前*有用的蛋白質(zhì)在這個光譜類（見表1），但也不是市售的。 Invitrogen公司提供的另一個變種，命名誕生后黃玉 ，是已經(jīng)融合標(biāo)簽定位，細胞內(nèi)信號的服務(wù)，和FRET調(diào)查。 的Evrogen“標(biāo)簽”商用系列的本地化記者蛋白，TagYFP的新成員是一個單體水母（ 大型多管水母 ）衍生物比EYFP略低的明亮，但為了更耐光的幅度。 其合作伙伴相似，TagYFP（發(fā)光峰值在524納米）的特點在文獻中，但可以購買哺乳動物克隆載體或融合標(biāo)簽。
在相同的熒光激活細胞分選的調(diào)查導(dǎo)致的代CyPet的（上面討論的），進化優(yōu)化的互補FRET受體，稱為YPET，也被得到。 命名后，其熟練FRET（Y F P電子能源科技轉(zhuǎn)移 ），YPET尚未開發(fā)并演示了合理的耐光性是亮黃色的變種。 抵抗酸性的環(huán)境所提供YPET是優(yōu)于金星和其他YFP的衍生工具，這將增強系統(tǒng)的效用，這個探頭針對酸性細胞生物傳感器組合。 然而，雖然CyPet YPet優(yōu)化組合應(yīng)該是的*首發(fā)點在開發(fā)新的FRET生物傳感器，那里仍然是一個嚴重的疑問的起源YPET增加的性能，這是可能由于簡單地增強二聚，其共同的進化合作伙伴，CyPet。 同樣的，本地化的實驗中，雙分子互補分析和其他應(yīng)用程序的融合標(biāo)簽為中CyPet YPET的適宜性尚未建立起來。 存在這兩種蛋白質(zhì)在溶液中為弱的二聚體，但據(jù)推測，可以被轉(zhuǎn)換成真實使用A206K工作的突變，以及與其他多管水母的變種（雖然這顯然破壞了它們的優(yōu)點在FRET）的單體。
橙色熒光蛋白，所有這些都被隔離從珊瑚礁物種，有可能是有用的在各種FRET成像場景。 也許*多才多藝的這些是從蘑菇珊瑚Fungia黃果厚殼桂 （稱為日本為Kusabira艾希 ）*初是作為一個四聚體，蛋白質(zhì)單體Kusabira橙色。（簡稱人民圣戰(zhàn)者組織）Kusabira橙單體版本創(chuàng)建引入*過20突變，通過現(xiàn)場指導(dǎo)和隨機突變。的單體（市售從MBL國際）的四聚體具有相似的光譜特性，并具有類似EGFP的亮度值，但稍微敏感的酸性環(huán)境中，比它的父。然而，本報記者的耐光性，是名列前茅的任何蛋白質(zhì)在所有的光譜類，使人民圣戰(zhàn)者組織長期成像實驗的*佳選擇。此外，發(fā)射光譜輪廓充分分離從青色熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率增加人民圣戰(zhàn)組織結(jié)合在生物傳感器中，探針是有用的在多色調(diào)查與青色，綠色，黃色和紅色的探針的組合。
尋找一個理想的紅色發(fā)光熒光蛋白長期以來一直使用活細胞和整體動物成像的目標(biāo)FRET生物傳感器和融合，主要是由于在這個光譜區(qū)域的探頭在多色成像實驗的要求，以及事實較長的激發(fā)波長產(chǎn)生更少的光毒性和可以探測到生物組織更深。 至目前為止，已廣泛的潛在有用的紅色探頭（排放量在590納米至650納米），其中許多仍然受到一定程度的強制性的四級結(jié)構(gòu)賦予原籍物種。 與水母蛋白不同的是，大多數(shù)的本地和基因工程的珊瑚礁蛋白變體的成熟非常有效地在37度。 廣泛的誘變研究努力，包括新近引入的方法，已成功地應(yīng)用在搜索中為黃色，橙色，紅色，和遠紅熒光蛋白變異，從而進一步降低的傾向，這些潛在的有效的生物探針自交聯(lián)，同時推動排放*大值向更長的波長。 結(jié)果已改進的單體蛋白質(zhì)，具有消光系數(shù)增加，量子產(chǎn)率，和光，雖然沒有一個單一的變種尚未優(yōu)化的所有標(biāo)準(zhǔn)。
紅色mFruit蛋白，MAPPLE（mCherry mStrawberry的發(fā)射峰位于592，610和596納米，分別），有亮度級別范圍從50％到110％的綠色熒光蛋白，但馬普爾和mCherry得多比mStrawberry耐光和的*佳探頭的選擇長期成像實驗，以取代mRFP1。進一步延長的mFruit蛋白質(zhì)譜類通過迭代產(chǎn)生了兩個新的熒光蛋白突變體與*大發(fā)射波長625納米和649納米，相當(dāng)于*個真正的遠紅遺傳工程探頭。此語言對的*有可能有用的探針被評為mPlum的，它具有相當(dāng)有限的亮度值（10％的EGFP），但優(yōu)良的耐光性。這種單體的探針的組合應(yīng)該是有用的，與變體排放，青色，綠色，黃色和橙色區(qū)域的多色成像實驗中，作為生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移與綠色和黃色的蛋白質(zhì)，如綠寶石和黃晶（參見圖10）的合作伙伴。礁珊瑚生物已分離出一些額外的紅色熒光蛋白呈現(xiàn)不同程度的承諾。應(yīng)用程序的位點特異性和隨機誘變，然后通過篩選的突變顯示出遠紅熒光的TurboRFP變種，導(dǎo)致一種二聚體蛋白質(zhì)名為Katushka（發(fā)射*大值為635納米）。盡管只有三分之二光亮如綠色熒光蛋白，Katushka展品涵蓋650至800納米，一個地區(qū)是重要的深層組織成像光譜窗口中的任何熒光蛋白的亮度*高水平。介紹到TagRFP的的四個主要Katushka突變產(chǎn)生的單體，遠紅蛋白名為mKate，具有相似的光譜特征。耐光mKate報道是例外和蛋白質(zhì)mCherry，這使得它一個很好的候選人本地化和遠紅光部分頻譜FRET實驗顯示亮度類似。
盡管擴大到橙色，紅色，和遠紅外光譜區(qū)的熒光色調(diào)色板的顯著的進步，青色和黃色的僧帽衍生物仍是*有用的配對場景開發(fā)有用的生物傳感器。這場突如其來的差異發(fā)生，因為大部分的橙色和紅色珊瑚源性蛋白表現(xiàn)出一個比較寬泛的吸收光譜曲線有一個長期的激勵尾部延伸到紫色和青色區(qū)域，從而產(chǎn)生直接受激勵?？赡荛_始發(fā)揮作用的另一個因素是相對成熟率熒光蛋白融合伙伴。在大多數(shù)情況下，從多管水母蛋白衍生的變種的成熟速度遠遠*過造礁珊瑚得到的，所以它是可能的，不成熟的受體，有助于所表現(xiàn)出許多的珊瑚來源的蛋白質(zhì)的敏化發(fā)射差。此外，廣泛的吸附光譜的橙色和紅色的蛋白，結(jié)合的單體版本的量子產(chǎn)率減少，有可能使它們很難用于FRET。FRET熒光蛋白未來的成功將重點放在實驗設(shè)計，除其他因素外，配對的蛋白質(zhì)相匹配的成熟率。
結(jié)論
雖然提供了巨大的潛力，在活細胞系統(tǒng)，尚未揭示分子動力學(xué)FRET實驗的基礎(chǔ)上無處不在的熒光蛋白家族是不是有一個**的FRET對。 CFP和YFP的優(yōu)化版本仍然為一般用途，提供*有效的對更好的組合，雖然可能籠罩在地平線上。 同樣地，也沒有**的技術(shù)，測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），上述所有的方法雖然有優(yōu)勢，取決于特定的實驗調(diào)查的情況下，可以利用。 更優(yōu)化的熒光蛋白成為包括鮮紅的變種，可能是適當(dāng)?shù)氖荏w為GFP或YFP捐助者的，F(xiàn)RET使用熒光蛋白在活細胞中蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)查變得更加有用。 如所討論的，寬的吸收光譜的紅色熒光蛋白的當(dāng)前調(diào)色板，除了單體版本的量子產(chǎn)率較低，這些候選者難以采用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移。 然而，快速的步伐熒光蛋白改進借給樂觀，這種蛋白質(zhì)會在不久的將來，將有助于進一步改變這種新的方法來闡明細胞內(nèi)生化機制。