奧林巴斯顯微鏡成像，什么是反卷積？

 反卷積進(jìn)行大量計(jì)算的圖像處理技術(shù)，正被越來(lái)越多地利用改善在顯微鏡拍攝的數(shù)字圖像的對(duì)比度和分辨率。 根據(jù)一套旨在消除或扭轉(zhuǎn)引起的物鏡的孔徑有限的顯微鏡圖像中存在的模糊的方法，這些方法的基礎(chǔ)是。

幾乎任何數(shù)字熒光顯微鏡獲得的圖像可以被反卷積，以及一些新的應(yīng)用程序正在開(kāi)發(fā)，應(yīng)用反卷積技術(shù)透射光下的各種采集圖像對(duì)比度增強(qiáng)策略。 其中*合適的改進(jìn)的主體，通過(guò)反卷積是從一系列的光學(xué)部分構(gòu)成的三維蒙太奇。

圍繞收購(gòu)的串行光學(xué)部分的卷積分析的基本概念示意圖如圖1。 的檢體是一種理想化的單元格從一系列的光學(xué)部分（右圖）是沿z軸的一個(gè)廣義的光學(xué)顯微鏡記錄。 對(duì)于每個(gè)試樣中的焦平面，由檢測(cè)器記錄，相應(yīng)的圖像平面中，并隨后被存儲(chǔ)在一個(gè)數(shù)據(jù)分析計(jì)算機(jī)。 卷積分析，整個(gè)系列的光學(xué)部分進(jìn)行分析，以建立一個(gè)三維的蒙太奇。

作為一種技術(shù)，反卷積常常建議共聚焦顯微鏡作為一種很好的替代。 這不是嚴(yán)格正確的，因?yàn)樵诠簿劢癸@微鏡中使用的針孔孔徑獲得的圖象也可以分析通過(guò)反卷積技術(shù)。 然而，大多數(shù)的反卷積實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道的適用于記錄，可在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡圖像。 現(xiàn)代卷積算法取得可比分辨率的圖像共聚焦顯微鏡。 事實(shí)上，共聚焦顯微鏡和廣角卷積顯微鏡都工作通過(guò)去除圖像模糊，但這樣做相反的機(jī)制。 共聚焦顯微鏡防止外的焦點(diǎn)模糊，從被檢測(cè)的目標(biāo)和檢測(cè)器，通過(guò)它，可以通過(guò)只在聚焦光線之間放置一個(gè)針孔孔徑。 與此相反，寬視場(chǎng)顯微鏡允許模糊的光線到達(dá)檢測(cè)器（或圖像傳感器），但反卷積技術(shù)，然后施加到所產(chǎn)生的圖像，以減去模糊的光，或?qū)⑵渲匦路峙涞皆础?/span> 共聚焦顯微鏡特別適合研究厚的標(biāo)本，如胚胎或組織，而廣角卷積顯微鏡已被證明是一個(gè)**的工具，需要非常低的光線水平，如活細(xì)胞熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)和核酸的成像標(biāo)本。

圖像退化的來(lái)源

來(lái)源可分為4個(gè)獨(dú)立的現(xiàn)象：噪聲，散射，眩光，模糊的圖像退化。 圖2給出的視覺(jué)沖擊每個(gè)這些相同的圖像的例子。 卷積方法的主要任務(wù)是從圖像中刪除焦模糊。 反卷積算法去除噪聲，但其整體性能，這是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的方面。

噪聲可以被描述為一個(gè)準(zhǔn)隨機(jī)排列紊亂圖像中的細(xì)節(jié)，（在其*嚴(yán)重的形式）時(shí)遇到的外觀類似白噪聲或鹽和胡椒噪聲 ，什么被認(rèn)為是在廣播電視接收不良（圖2（a））。 這種類型的噪音被稱為“準(zhǔn)隨機(jī)的”，因?yàn)榭梢灶A(yù)測(cè)的統(tǒng)計(jì)分布是已知的源，如果力學(xué)。 在數(shù)字顯微鏡，噪聲的主要來(lái)源是信號(hào)本身或數(shù)字成像系統(tǒng)（通常被稱為光子散粒噪聲 ）。 兩個(gè)噪聲源的機(jī)制是可以理解的，因此，噪聲的統(tǒng)計(jì)分布是已知的。 信號(hào)相關(guān)的噪聲可以由泊松分布特征，而從成像系統(tǒng)所產(chǎn)生的噪音往往遵循高斯分布。 由于數(shù)字法師常見(jiàn)的噪聲源和分布是這么好理解，它可以很容易地通過(guò)應(yīng)用適當(dāng)?shù)膱D像過(guò)濾器，這通常是大多數(shù)卷積軟件包包括一個(gè)可選的“前處理”例行去除。

散點(diǎn)圖通常是指作為一個(gè)隨機(jī)擾動(dòng)引起的光通過(guò)于異構(gòu)折射率區(qū)域的一個(gè)標(biāo)本。 分散的凈效應(yīng)是真正的隨機(jī)圖像細(xì)節(jié)紊亂，表現(xiàn)在圖2（b）。 雖然沒(méi)有完全令人滿意的方法已被開(kāi)發(fā)來(lái)預(yù)測(cè)散布在一個(gè)給定的試樣，它已被證明的散射程度是高度依賴于試樣的厚度和材料的試樣的光學(xué)特性的和周?chē)那度搿?/span> 散射增加與試樣的厚度和內(nèi)部組件內(nèi)的試樣的折射率的非均質(zhì)性。

類似的分散，眩光是一個(gè)隨機(jī)的光的干擾，但發(fā)生在光學(xué)系（透鏡，濾光片，棱鏡，透鏡安裝座等），而不是在試樣的顯微鏡。 眩光，在現(xiàn)代的顯微鏡的水平已被*小化，由鏡頭和過(guò)濾器與抗反射涂層的就業(yè)機(jī)會(huì)，透鏡形成技術(shù)，光學(xué)水泥，玻璃配方的細(xì)化。 圖2（c）示出了不受控制的眩光的效果。

所描述的非隨機(jī)傳播的光，通過(guò)成像系統(tǒng)的光學(xué)系（圖2（d））發(fā)生模糊。 源模糊的*顯著的是衍射，并且被認(rèn)為是只限于由模糊的圖像的分辨率衍射極限的 。 這表示任何成像系統(tǒng)的特性的限制，并在評(píng)估的光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限是決定性因素。 光學(xué)理論提出了復(fù)雜的模型，可應(yīng)用于現(xiàn)代高速計(jì)算機(jī)的協(xié)助下，在光學(xué)顯微鏡拍攝的數(shù)字圖像模糊。 這是反卷積的基礎(chǔ)。 由于其反卷積的根本的重要性，模糊理論模型，將討論在本節(jié)的其他部分要詳細(xì)得多。 然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，所有的成像系統(tǒng)產(chǎn)生的模糊獨(dú)立于其他形式的圖像劣化引起的試件或相應(yīng)的儀器電子。 從其他類型的退化，使反卷積技術(shù)模糊消除的可能性，正是這種獨(dú)立性的光模糊。

光與物質(zhì)的相互作用是主要的散射，眩光，模糊的物理起源。 然而，每種材料的組合物和在給定的材料（無(wú)論是玻璃，水，或蛋白質(zhì)）的分子排列賦予它自己的特殊的光學(xué)性質(zhì)。 對(duì)于反卷積的目的，有什么區(qū)別的位置，他們發(fā)生的可能性，產(chǎn)生這些現(xiàn)象的數(shù)學(xué)模型，分散，防眩光，和模糊。 由于分散是一個(gè)本地化的，不規(guī)則的現(xiàn)象，發(fā)生在試樣，它已被證明難以模型。 與此相反，由于模糊的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)（主要的目標(biāo)）是一個(gè)函數(shù)，它可以建模與相對(duì)簡(jiǎn)單。 這種模式使得它可以扭轉(zhuǎn)的模糊數(shù)學(xué)運(yùn)算，卷積采用這種模式來(lái)扭轉(zhuǎn)或消除模糊。

點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

模糊模型是根據(jù)光學(xué)理論中已逐漸形成一個(gè)三維的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的概念上。 這一概念是至關(guān)重要反卷積，并應(yīng)清楚地了解，為了避免成像偽影。 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是基于一個(gè)無(wú)限小的點(diǎn)源的光，在檢體（對(duì)象）的空間。 的顯微鏡成像系統(tǒng)，因?yàn)橹皇占蛇@點(diǎn)發(fā)射的光的一小部分，它不能將光聚焦成一個(gè)**的三維圖像的點(diǎn)。 相反，出現(xiàn)點(diǎn)擴(kuò)大，并蔓延到一個(gè)三維的衍射圖案。 因此，點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的正式定義由一個(gè)理想的點(diǎn)光源產(chǎn)生的三維衍射圖案。

點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，這取決于所使用的攝像模式（寬視場(chǎng)，激光共聚焦，透過(guò)光），具有不同的和**的形狀和輪廓。 在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的形狀類似于，加寬環(huán)喇叭形的光所包圍的長(zhǎng)方形的“足球”。 在三維空間中的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)來(lái)描述，它是常見(jiàn)的應(yīng)用的坐標(biāo)系的x，y和z三個(gè)軸（）×和y是平行的試樣的焦平面和z是平行于光軸顯微鏡。 在這種情況下，顯示為在xy平面上的一組同心環(huán)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，并類似于沙漏的xz和yz平面中（如在圖3中示出）。 通過(guò)中心的廣角點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的XY片揭示了一組同心圓環(huán)：所謂的艾里斑 ，通常引用文本中的經(jīng)典光學(xué)顯微鏡。

在圖3中示出球面像差的不同程度的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的兩個(gè)XZ突起。 的光軸平行于垂直軸的圖像。 在左邊顯示的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)*小的球面像差，而在右邊顯示一個(gè)顯著程度的畸變。 請(qǐng)注意，軸向不對(duì)稱，加寬的中央節(jié)點(diǎn)，在右側(cè)圖像沿著光軸導(dǎo)致退化的軸向分辨率和模糊信號(hào)。 從理論上講，點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的大小是無(wú)限的，而遠(yuǎn)離焦點(diǎn)的平面的光強(qiáng)度的總和等于焦點(diǎn)處的總強(qiáng)度。 然而，光強(qiáng)下降迅速，并*終成為區(qū)分噪音。 在一個(gè)unaberrated的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的記錄，可有高數(shù)值孔徑（1.40）油浸物鏡，占用0.2平方微米的焦點(diǎn)平面的光傳播區(qū)域*過(guò)90倍，在1微米以上和以下的集中。 用來(lái)記錄這些點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的圖像的檢體是一個(gè)直徑為0.1微米的熒光珠安裝在甘油（折射率等于1.47），與具有圖中所示的折射率的浸沒(méi)油。

的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的一個(gè)重要的考慮因素是如何影響在顯微鏡圖像形成。 的圖像形成處理的圖像為基本單元的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的理論模型。 換句話說(shuō)，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是磚的房子的圖像。 *好的圖像可以永遠(yuǎn)是一個(gè)組裝點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，并增加放大倍率將不會(huì)改變這個(gè)事實(shí)。 作為一個(gè)**的理論光學(xué)教科書(shū)（Born和狼： 光學(xué)原理 ）解釋說(shuō)，“這是不可能的目鏡，增加了電源的主圖像的每個(gè)元素，襯托出細(xì)節(jié)沒(méi)有出現(xiàn)在主圖像是一個(gè)小的衍射圖案，和實(shí)際圖象，通過(guò)目鏡觀察，只有這些圖案的放大圖像的合唱“。

作為一個(gè)例子，考慮人口的微小熒光珠蓋玻片顯微鏡載玻片之間夾著。 在此試樣中揭示了一個(gè)在焦圖像云點(diǎn)，其中每一個(gè)，檢查時(shí)，在高分辨率下，實(shí)際上是一個(gè)微小的一套環(huán)（實(shí)際上，艾里斑所包圍的磁盤(pán)，請(qǐng)參閱圖4（a）） 。 如果此焦點(diǎn)若干取出試樣，將出現(xiàn)更大的一組同心環(huán)，其中每個(gè)點(diǎn)是在聚焦的圖像（圖4（b））。 當(dāng)在此試樣中的三維圖像被收集，然后一個(gè)完整的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的記錄，可在每個(gè)胎圈。 描述會(huì)發(fā)生什么情況，每個(gè)點(diǎn)光源后，通過(guò)成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

剛剛描述的模糊處理，數(shù)學(xué)建模為一個(gè)卷積。 卷積運(yùn)算的描述試樣中的每一個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的應(yīng)用：從該對(duì)象中的每個(gè)點(diǎn)發(fā)出的光，以產(chǎn)生*終的圖像的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的卷積。 不幸的是，此卷積導(dǎo)致點(diǎn)中的試樣，成為模糊圖像中的區(qū)域。 試樣中的每個(gè)點(diǎn)的熒光圖像中的每一個(gè)點(diǎn)的亮度由卷積運(yùn)算是線性相關(guān)。 因?yàn)辄c(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是三維的，模糊的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)是固有三維的現(xiàn)象。 焦平面的圖像從任何包含模糊的光點(diǎn)位于該平面混合在一起，模糊的光點(diǎn)，對(duì)原產(chǎn)于其他焦平面。

可以概括的情況下，形成圖像的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的卷積中的試樣的想法。 解卷積逆轉(zhuǎn)這一進(jìn)程，并嘗試重新構(gòu)建試樣從一個(gè)模糊的圖像。

畸變的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

定義的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)可以利用衍射的數(shù)學(xué)模型理論上或經(jīng)驗(yàn)上的熒光珠（參見(jiàn)圖3）獲取的三維圖像。 一個(gè)理論的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)一般具有軸向和徑向?qū)ΨQ。 實(shí)際上，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是在xy平面的上方和下方（軸對(duì)稱）和繞z軸（徑向?qū)ΨQ）旋轉(zhuǎn)對(duì)稱。 一個(gè)經(jīng)驗(yàn)性的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可以顯著偏離**對(duì)稱（如圖3）。 這種偏差，通常被稱為像差 ，成像系統(tǒng)的光學(xué)火車(chē)，尤其是目標(biāo)的任何組件中所產(chǎn)生的凹凸或偏移量，但也可發(fā)生與其它組分如鏡，分束器，管透鏡，過(guò)濾器，隔膜，和光圈。 的光學(xué)元件和顯微鏡對(duì)準(zhǔn)更好的質(zhì)量就越高，越接近的經(jīng)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)其理想的對(duì)稱形狀。 兩個(gè)共聚焦和去卷積顯微鏡依賴于盡可能接近理想的情況下的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)。

眾所周知，任何經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)顯微鏡，光學(xué)顯微鏡，遇到的*常見(jiàn)的像差是球面像差。 這種像差的表現(xiàn)形式為軸向不對(duì)稱的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的形狀，大小，并相應(yīng)增加，特別是沿z軸（圖3）。 其結(jié)果是一個(gè)相當(dāng)大的損失，分辨率和信號(hào)強(qiáng)度。 在實(shí)踐中，*常見(jiàn)的原點(diǎn)的球面像差是物鏡前透鏡的液浸介質(zhì)和安裝介質(zhì)，在其中沐浴試樣的折射率之間的不匹配。 一個(gè)巨大的重點(diǎn)應(yīng)放在盡量減少這種無(wú)所不在的像差的重要性。 卷積雖然可以部分恢復(fù)丟失的分辨率，再多的圖像處理，可以恢復(fù)丟失的信號(hào)。