奧林巴斯顯微鏡：物鏡的數(shù)值孔徑和分辨率

顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑是其收集光并解決細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)在一個固定的物體距離的能力的量度。圖象形成光波穿過試樣和在倒置錐體進(jìn)入物鏡，如圖1這個錐形光的縱向切片顯示了孔徑角，是由物鏡的焦距確定的值。

角μ是二分之一的數(shù)值孔徑角（A），它與通過以下等式的數(shù)值孔徑：

其中n是物鏡的前透鏡和試樣玻璃蓋，一個值，該范圍為1.00空氣1.51專門浸沒油之間的成像介質(zhì)的折射率。許多作者替換變量α為μ在數(shù)值孔徑方程。從這個等式很明顯，當(dāng)成像介質(zhì)為空氣（具有折射率，n= 1.0），則數(shù)值孔徑僅取決于所述角μ的*大值為90°。角度的sin μ，因此，具有1.0（SIN（90°）= 1），這是一個透鏡與空氣作為所述成像介質(zhì)操作的理論*大數(shù)值孔徑（使用“干”顯微鏡物鏡）的*大值。

在實(shí)踐中，但是，它是很難實(shí)現(xiàn)的數(shù)值孔徑值在0.95以上的干的物鏡。圖2示出了一系列從變焦距和數(shù)值孔徑的物鏡衍生光錐。作為光錐改變，角度μ從7°的增加在圖2（a）至圖2的（c）60°，從而增加了數(shù)值孔徑從0.12至0.87，接近極限時空氣是成像媒介。

通過檢查數(shù)值孔徑方程，很明顯的是，折射率是在實(shí)現(xiàn)數(shù)值孔徑大于1.0的限制因素。因此，為了獲得較高的工作數(shù)值孔徑，物鏡的前透鏡和試樣之間的介質(zhì)的折射率必須增加。顯微鏡物鏡，現(xiàn)已允許成像在其他媒體，如水（折射率= 1.33），甘油（折射率= 1.47），和浸油（折射率= 1.51）。護(hù)理應(yīng)與這些物鏡可用于防止當(dāng)一個物鏡是，使用具有比它的物鏡是為不同的浸沒介質(zhì)，這將產(chǎn)生不希望的偽影。我們建議顯微鏡從來不使用專為油浸無論是與甘油或水的物鏡，雖然有幾個新的物鏡，*近已經(jīng)******，將與多個介質(zhì)。您應(yīng)與制造商檢查是否有任何疑慮。

多數(shù)物鏡在60倍和100倍（或更高版本）的放大倍率范圍是設(shè)計用于浸油的使用。通過檢查上面的數(shù)值孔徑方程，我們發(fā)現(xiàn)，*高理論數(shù)值孔徑與浸油獲得的是1.51（當(dāng)sin（μ）= 1）。在實(shí)踐中，然而，大多數(shù)的油浸物鏡的1.4的*大數(shù)值孔徑，以*常用的數(shù)值孔徑范圍為1.0至1.35。

物鏡的數(shù)值孔徑也依賴，在一定程度上，在校正光學(xué)像差的量。高度校正的物鏡趨于如示于下表1中有大得多的數(shù)值孔徑為各個放大倍數(shù)。如果我們采取了一系列典型的10倍物鏡作為一個例子，我們看到，平場校正的規(guī)劃物鏡，數(shù)值孔徑增加對應(yīng)校正色差和球面像差：平場消色差，NA = 0.25; 平場螢石，NA = 0.30; 并平場復(fù)消色差透鏡，NA = 0.45。

增加數(shù)值孔徑橫跨越來越光學(xué)校正因子在一系列類似倍率物鏡的該特征保持在整個放大率范圍內(nèi)真如表1所示。大多數(shù)制造商努力，以確保它們的物鏡具有*高校正和數(shù)值孔徑是可能每個類的物鏡。

的顯微鏡物鏡的分辨率定義為在該仍然可以區(qū)分為兩個獨(dú)立的實(shí)體的檢體的兩個點(diǎn)之間的*小距離。分辨率是顯微鏡，因?yàn)樵诟叻糯蟊堵?，圖像可能會出現(xiàn)不清晰的，但仍然有點(diǎn)主觀的價值被解析為物鏡的*大能力。數(shù)值孔徑確定一個物鏡的分辨能力，但在顯微鏡系統(tǒng)的總的分辨率也取決于臺下聚光鏡的數(shù)值孔徑時。較高的總系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，更好的分辨率。

顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的正確對準(zhǔn)是非常重要的還有，以確保*大的分辨率。臺下聚光鏡必須匹配于物鏡相對于數(shù)值孔徑和調(diào)整孔徑光闌為準(zhǔn)確的光錐的形成。用于圖像中的檢體的光的波長光譜也是*個決定性因素。較短的波長是能夠解決的細(xì)節(jié)在更大程度的比是在較長的波長。有已被衍生表達(dá)的數(shù)值孔徑，波長，和分辨率之間的關(guān)系數(shù)方程：

其中，R是分辨率（兩個對象之間的*小可分辨的距離），NA等于數(shù)值孔徑，λ等于波長，NA（OBJ）等于物鏡的數(shù)值孔徑，及NA（cond）是聚光的數(shù)值孔徑。注意，等式（1）和（2）相差倍增因子，這是0.5等式（1）和0.61等式（2） 。這些方程是基于許多因素（包括各種光學(xué)物理學(xué)家制成理論計算的）來解釋的物鏡和聚光鏡的行為，而不應(yīng)被認(rèn)為是任何一個一般物理定律的*值。在一些情況下，如共焦和熒光顯微鏡，分辨率實(shí)際上可能*過置于由這三個方程中的任何一個的限制。其他因素，如低標(biāo)本對比度和不當(dāng)照明可用于較低的分辨率，并且更經(jīng)常的情況是，對現(xiàn)實(shí)世界的*大值R（約0.25 微米的使用550納米的中間光譜的波長），以及數(shù)值孔徑1.35 1.40沒有體現(xiàn)在實(shí)踐中。表2提供的列表分辨率（R）和數(shù)值孔徑（NA）由物鏡放大倍率和糾正。

當(dāng)在顯微鏡是在**對準(zhǔn)，并具有與臺下聚光鏡適當(dāng)匹配的物鏡，那么我們就可以代替物鏡的數(shù)值孔徑成方程（1）和（2） ，與添加的結(jié)果是等式（3）簡化為方程式（2） 。要注意的一個重要的事實(shí)是，倍率不會顯示為在任何這些方程的一個因素，因?yàn)橹挥袛?shù)值孔徑和照明光的波長確定樣品分辨率。正如我們所提到的（并且可以在公式中看到）的光的波長是在顯微鏡的分辨率的一個重要因素。更短的波長，得到較高的分辨率（對于較低值?），反之亦然。在光學(xué)顯微鏡的*大分辨能力實(shí)現(xiàn)了與近紫外光，*短有效成像波長。近紫外光之后是藍(lán)色，然后綠色，*后紅光在解決標(biāo)本細(xì)節(jié)的能力。在大多數(shù)情況下，顯微鏡使用由鎢-鹵素?zé)襞莓a(chǎn)生白光照亮樣品?？梢姽庾V的中心位于約550納米，對于綠色光的主波長（我們的眼睛*敏感的綠色光）。它是該波長被用來計算在表2中的數(shù)值孔徑值分辨率值也是在這些方程和更高的數(shù)值孔徑重要也將產(chǎn)生更高的分辨率，可明顯看出在表2中的光的波長的效果上的分辨率，在一個固定的數(shù)值孔徑（0.95），列于表3。

當(dāng)光從各點(diǎn)的試樣的通過物鏡，并重組為一個圖像時，各點(diǎn)的試樣的出現(xiàn)在圖像的小圖案（未分）被稱為在艾里模式。這種現(xiàn)象是通過衍射或光散射引起，因?yàn)樗┻^微小零件和間隔在試樣和物鏡的圓形回光圈。艾里模式的中央*大常被稱作艾里斑，它被定義為通過所述**小值的艾里圖案包圍的區(qū)域，并且包含的光能量的84％。這些艾里磁盤組成的小同心輕和黑眼圈如示于圖3本圖顯示艾里磁盤及其強(qiáng)度分布作為間隔距離的函數(shù)。

圖3（a）示出一個假想艾里斑，基本上由包含中央*大的衍射圖案的（通常稱為零階*大值）由同心*，第二，第三等，依次遞減的亮度順序*大值構(gòu)成包圍的強(qiáng)度分布。兩個艾里磁盤和在光學(xué)分辨率的極限它們的強(qiáng)度分布示于圖3（b）中。在這一部分圖中，在兩個盤之間的間隔*過其半徑，并且它們是可解析的。在其中兩個艾里磁盤可以拆分成單獨(dú)的實(shí)體的限制通常被稱為瑞利判據(jù)。如圖3（c）示出了兩個艾里磁盤和在一個情況下的零階*大值之間的中心到中心的距離小于這些*大值的寬度的強(qiáng)度分布，和兩個盤都不能單獨(dú)解析的瑞利判據(jù)。

在由物鏡在形成圖像，即變?yōu)榭梢姷臉颖镜母敿?xì)投射的艾里磁盤小。更高的校正（螢石和apochromats）的物鏡產(chǎn)生較小的艾里磁盤比更低的修正物鏡。以類似的方式中，具有較高的數(shù)值孔徑的物鏡也能夠產(chǎn)生更小的艾里磁盤。這是高數(shù)值孔徑和總校正光學(xué)象差的物鏡所用的檢體區(qū)分更精細(xì)的細(xì)節(jié)的首要原因。

圖4示出的數(shù)值孔徑的上成像的一系列相同焦距的假想物鏡艾里磁盤的大小的影響，但不同的數(shù)值孔徑。具有小數(shù)值孔徑的艾里斑的大小是大的，如圖4（a）中。作為數(shù)值孔徑的一個物鏡增加，并且光錐角然而，該艾里斑的大小減小，如圖4（b）和圖4（c）所示。在目鏡膈肌水平產(chǎn)生的圖像實(shí)際上是艾里磁盤這是我們所認(rèn)為的光明與黑暗的馬賽克。其中，兩個磁盤過于靠近在一起，使得它們的中心斑點(diǎn)重疊很大，由這些重疊磁盤表示的兩個細(xì)節(jié)都沒有解決或分離并因此顯示為一個，如在圖3中所示的上方。

在圖像形成理解一個重要的概念是由物鏡截獲衍射光線的性質(zhì)。僅在較高的（*，第二，第三等）衍射光的訂單被捕獲的情況下，可以干擾工作重新創(chuàng)建在所述物鏡的中間像平面的圖像。當(dāng)只有零階光線被捕獲，這幾乎是不可能重構(gòu)樣品的一個可識別圖像。當(dāng)一階的光線被添加到零階射線，圖像變得更加連貫，但它仍然缺乏足夠的細(xì)節(jié)。只有當(dāng)高階射線復(fù)合，該圖象將表示檢體的真實(shí)結(jié)構(gòu)。這是基礎(chǔ)的大數(shù)值孔徑（以及隨后的更小的艾里磁盤）的必要性，以實(shí)現(xiàn)高清晰度的圖像，用光學(xué)顯微鏡。

在一天到一天的例行觀察，大多數(shù)顯微鏡不要試圖達(dá)到的*高分辨率圖像可能與他們的設(shè)備。它只有在專門情況下，例如高倍率明場，熒光，DIC和共聚焦顯微鏡，我們力爭達(dá)到顯微鏡的限制。在顯微鏡的大多數(shù)用途，這是沒有必要使用高數(shù)值孔徑的物鏡，因?yàn)闄z體容易地解決了與使用較低數(shù)值孔徑物鏡。這是特別重要的，因?yàn)楦邤?shù)值孔徑和高放大倍數(shù)都伴隨著場的很淺的深度（這指的是良好的聚焦在區(qū)域正下方或者只是區(qū)域上方被檢查）和短工作距離的缺點(diǎn)。因此，在標(biāo)本，其中分辨率是不太關(guān)鍵的和放大倍率可以更低，*好是用溫和的數(shù)值孔徑較低倍物鏡以得到具有多個工作距離和更多的景深圖像。

臺下聚光鏡孔徑光闌的仔細(xì)定位也以數(shù)值孔徑和濫用此隔膜可導(dǎo)致圖像劣化（如上一節(jié)中所討論的控制臨界臺下聚光鏡）。其他因素，例如對比度和照明的效率，也影響圖像分辨率的關(guān)鍵要素。