尼康顯微鏡：顯微物鏡的屬性
三個(gè)關(guān)鍵的設(shè)計(jì)特點(diǎn)的物鏡顯微鏡的極限分辨率極限。這些包括用來(lái)照亮試樣的孔徑角的光錐物鏡捕獲，和對(duì)象空間中的物鏡前透鏡和被檢體之間的折射率的光的波長(zhǎng)。
圖1中顯示的是通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的雙透鏡的阿貝聚光照明顯微鏡的物鏡的剖開(kāi)圖。光通過(guò)聚光鏡被組織成一個(gè)光錐到樣品上發(fā)出，然后被發(fā)送到物鏡前透鏡元件作為反錐形。照明錐的大小和形狀是一個(gè)函數(shù)的組合的物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑。物鏡的孔徑角是由希臘字母θ表示，將在下面詳細(xì)討論。
的分辨率衍射極限的光學(xué)顯微鏡的*小可檢測(cè)兩個(gè)緊密間隔的樣本點(diǎn)之間的距離可以被描述為：
R =λ/2n（SIN（θ））
式中，R是分開(kāi)的距離，λ是照射波長(zhǎng)，n的成像介質(zhì)的折射率，θ是物鏡的孔徑角的二分之一。檢查方程中，很明顯的，分辨率是成正比的照明波長(zhǎng)。人的眼睛與在400和700納米之間，它表示利用顯微鏡觀察的大多數(shù)在可見(jiàn)光光譜的波長(zhǎng)區(qū)域。分辨率也取決于成像介質(zhì)的折射率和物鏡的孔徑角。物鏡旨在圖像標(biāo)本與空氣或前透鏡和試樣之間的介質(zhì)的折射率越高。往往是相當(dāng)有限的視場(chǎng)，和前透鏡元件的物鏡是放置在靠近試樣與它必須位于光學(xué)接觸。一個(gè)增益由約1.5倍的分辨率達(dá)到浸油取代的作為成像介質(zhì)為空氣。
*后，但也許是*重要的因素，確定一個(gè)物鏡的分辨率是角的光圈，其中有一個(gè)實(shí)際的上限約72度（與一個(gè)正弦值0.95）。結(jié)合使用時(shí)的折射率，該產(chǎn)品：
N（SIN（θ））
數(shù)值孔徑（簡(jiǎn)稱NA）為已知的，對(duì)于任何特定的物鏡的分辨率提供了一個(gè)方便的指標(biāo)。數(shù)值孔徑一般是*重要的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)（除倍率）時(shí)要考慮選擇一個(gè)顯微鏡物鏡。值的范圍從0.1非常低倍率物鏡（倍到4倍），以盡可能1.6高性能的物鏡，利用專(zhuān)門(mén)的浸泡油。由于數(shù)值孔徑值增加了一系列的物鏡，相同的放大倍率，我們通常觀察到一個(gè)更大的聚光能力和提高分辨率。顯微鏡應(yīng)仔細(xì)選擇一個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑相匹配的放大倍率，在*終圖像中產(chǎn)生。在*好的情況下，應(yīng)充分?jǐn)U大只是解決的細(xì)節(jié)，被視為與舒適，但到如此地步，不空倍率阻礙精細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)的觀察。
正如在顯微鏡的照明的亮度是由聚光鏡工作的數(shù)值孔徑的平方，由物鏡產(chǎn)生的圖像的亮度，是由它的數(shù)值孔徑的平方。此外，物鏡放大倍率也發(fā)揮了作用，在確定圖像的亮度，這是橫向放大率的平方成反比。數(shù)值孔徑的平方/倍率表示的物鏡，當(dāng)利用透射照明的聚光能力。因?yàn)楦邤?shù)值孔徑物鏡往往是更好的像差糾正，他們還收集更多的光線，產(chǎn)生出更明亮，校正后的圖像高度解決。應(yīng)該指出的是，圖像的亮度迅速降低，提高放大率。在光線水平的情況下，是一個(gè)限制因素，選擇一個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑*高，但具有*低放大倍率能夠生產(chǎn)足夠的分辨率。
在裝配過(guò)程中的物鏡，鏡頭是*戰(zhàn)略間隔一圈坐在進(jìn)入細(xì)胞坐騎，然后打包成一個(gè)中央套筒油缸內(nèi)部安裝的物鏡桶。個(gè)別鏡頭安裝鏡頭紡紗在精密車(chē)床夾頭，其次是鏡頭鎖定到位（或透鏡組）用薄的金屬邊緣拋光黃銅肩靠在。球面像差進(jìn)行校正，通過(guò)選擇*佳的間隔物，以適應(yīng)在較低的兩個(gè)鏡頭支架（半球形和彎月形透鏡）之間。該物鏡偏光向上或向下翻譯整個(gè)鏡頭群內(nèi)套筒鎖緊螺母，使安置物鏡的倍數(shù)的物鏡轉(zhuǎn)換器可以互換不失焦。昏迷調(diào)整完成與三個(gè)中心螺釘，可以優(yōu)化內(nèi)部透鏡組的位置相對(duì)于光軸的物鏡。
物鏡規(guī)格放大
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表1
有是物鏡桶上刻了豐富的信息。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每一個(gè)物鏡上登記的倍率（例如10倍，20倍或40倍等），其物鏡旨在給出*好的圖像（通常為160毫米或希臘的無(wú)窮大符號(hào)）管長(zhǎng)和厚度覆蓋玻璃保護(hù)標(biāo)本，這是假設(shè)在校正球面像差（通常為0.17毫米），有一個(gè)恒定的值由設(shè)計(jì)者。如果物鏡被設(shè)計(jì)成一滴油和標(biāo)本之間，物鏡上會(huì)刻上油或OEL或HI（同質(zhì)浸泡）。后者指定這些在物鏡上不刻的情況下，物鏡上意味著要使用干燥，空氣的*低部分的物鏡和標(biāo)本之間。物鏡還經(jīng)常隨身攜帶雕刻的數(shù)值孔徑（NA）值。這可能會(huì)有所低倍率物鏡從0.04至1.3或1.4為高功率油浸復(fù)消色差的物鏡。如果沒(méi)有指定物鏡進(jìn)行更高的修正，通?？梢约僭O(shè)它是一個(gè)消色差物鏡。更高度糾正的物鏡有銘文，如復(fù)消色差透鏡或APO，F(xiàn)L，平常氟等舊的物鏡，往往焦距（鏡頭到圖像的距離），上刻桶，這是一個(gè)衡量的放大倍率。在現(xiàn)代顯微鏡，其物鏡是設(shè)計(jì)為特定的光管的長(zhǎng)度，因此包括在***管上的焦距和放大倍率變得有些多余。
表1列出了工作距離和數(shù)值孔徑作為功能的倍率四種*常見(jiàn)的類(lèi)物鏡：消色差透鏡，平常消色差透鏡，平常螢石，平常復(fù)消色差。需要注意的是干的物鏡都具有用于液浸介質(zhì)的數(shù)值孔徑小于1.0，*的物鏡設(shè)計(jì)值，*過(guò)此值的數(shù)值孔徑。
當(dāng)制造商的集匹配的物鏡，例如，各種放大倍率（單表1中列出的物鏡子集）的所有消色差的物鏡，被安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，他們被通常設(shè)計(jì)投影約在相同的平面在體內(nèi)的圖像管中。因此，改變物鏡旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器通常只需要極少使用微調(diào)旋鈕重新建立大家關(guān)注的焦點(diǎn)。這樣的一組物鏡被描述為是齊焦，一個(gè)有用的便利性和安全功能。符合條件的物鏡集的設(shè)計(jì)也是預(yù)定心，從而使視場(chǎng)中的一個(gè)物鏡為中心的標(biāo)本時(shí)，仍然為中心旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器帶來(lái)的另一個(gè)物鏡，使用。
多年來(lái)，大多數(shù)廠家的生物應(yīng)用設(shè)計(jì)的物鏡都符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)齊焦距離。因此，大多數(shù)的物鏡有一個(gè)齊焦距離為45.0毫米，并且被認(rèn)為是可以互換的。一組新的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)隨著遷移到無(wú)限遠(yuǎn)校正的管長(zhǎng)度，出現(xiàn)在物鏡與鏡筒透鏡的像差校正。加上需求增加更大的靈活性，以適應(yīng)需要越來(lái)越大的工作距離與更高的數(shù)值孔徑和視場(chǎng)大小，物鏡來(lái)自不同制造商之間的互換性消失。這種轉(zhuǎn)變體現(xiàn)現(xiàn)代尼康CFI-60光學(xué)系統(tǒng)，具有“無(wú)鉻”的物鏡，管鏡頭和目鏡。沒(méi)有一個(gè)被利用，以實(shí)現(xiàn)校正另一個(gè)單獨(dú)校正的CFI-60系統(tǒng)中的每個(gè)組件。管子的長(zhǎng)度設(shè)置為無(wú)窮大（平行光路）使用的管透鏡，已增加至60毫米的齊焦距離。即使物鏡安裝螺紋尺寸已經(jīng)改變從20.32至25毫米的光學(xué)系統(tǒng)，以滿足新的要求。
在用光學(xué)顯微鏡的視場(chǎng)直徑所表示的字段的視圖數(shù)或簡(jiǎn)單的視場(chǎng)數(shù)，這是視的直徑以毫米為單位表示，并在中間像平面測(cè)量。在對(duì)象（檢體）的場(chǎng)直徑平面上變?yōu)橐晥?chǎng)數(shù)除以物鏡的放大倍數(shù)。雖然視場(chǎng)數(shù)的放大倍率和眼（目鏡）視場(chǎng)光闌的直徑往往是有限的，有明確的限制，這也是所施加的設(shè)計(jì)的物鏡。早在顯微鏡物鏡是有限的，*大的可用場(chǎng)直徑約18毫米（或相當(dāng)少的高倍率目鏡），但現(xiàn)代的平場(chǎng)復(fù)消色差和其他專(zhuān)門(mén)的平場(chǎng)物鏡的范圍可以在22毫米和28毫米之間往往有一個(gè)可用場(chǎng)結(jié)合大視野目鏡。不幸的是，有用的字段的*大數(shù)目一般不刻在物鏡桶，也沒(méi)有廣泛顯微鏡目錄中列出的。
沒(méi)有任何明顯的濃度變化在圖像銳度的軸向范圍內(nèi)，通過(guò)該物鏡可以集中被稱為景深。此值從低到高數(shù)值孔徑物鏡根本變化，通常隨數(shù)值孔徑的增加（見(jiàn)表2和圖2）。在高數(shù)值孔徑，主要取決于波光學(xué)景深，而在較低的數(shù)值孔徑，幾何光學(xué)“的錯(cuò)亂圓圈”占主導(dǎo)地位。字段的總深度由下式給出的波和幾何光學(xué)景深的總和：
e TOT =λN/ NA 2 +（N / M×NA）é
其中，λ是波長(zhǎng)的照明，?成像介質(zhì)的折射率，NA是物鏡的數(shù)值孔徑， M 是物鏡的橫向放大率，?鍵是*小的距離，就可以解決由一個(gè)檢測(cè)器，其被放置在圖像平面的物鏡。請(qǐng)注意，衍射限制的景深（方程的右手側(cè)的*項(xiàng)）縮小與數(shù)值孔徑的平方成反比，而與*功率的數(shù)值孔徑的分辨率降低的橫向限制。其結(jié)果是，由系統(tǒng)的數(shù)值孔徑更軸向分辨率和光學(xué)部分的厚度的影響比在顯微鏡的橫向分辨率（見(jiàn)表2）。
*接近的表面的玻璃蓋和物鏡前透鏡的間隙之間的距離被稱為工作距離。在試樣的情況下被設(shè)計(jì)成沒(méi)有蓋玻璃成像，工作距離的測(cè)量是在實(shí)際的試件表面。一般來(lái)說(shuō)，工作距離減小了一系列的匹配物鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑的增加（見(jiàn)表1）。可以查閱標(biāo)本作為成像介質(zhì)與空氣的物鏡應(yīng)該工作距離盡可能長(zhǎng)的時(shí)間，數(shù)值孔徑的要求得到滿足。浸沒(méi)物鏡，另一方面，應(yīng)該有較淺的工作距離，以包含前透鏡之間的浸沒(méi)液體和試樣。許多設(shè)計(jì)物鏡有密切的工作距離有一個(gè)彈簧加載的回縮塞，允許前置鏡頭組件縮回推到物鏡的身體和扭曲，將其鎖定到位。物鏡是旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，所以它不會(huì)拖累整個(gè)表面的干凈的玻片浸油這種配件是方便的。在相反的方向扭動(dòng)回縮止動(dòng)件釋放的透鏡組件的使用。在一些應(yīng)用中（見(jiàn)下文）中，很長(zhǎng)的自由工作距離是不可缺少的，和特殊的物鏡是用于這樣的用途而設(shè)計(jì)的，盡管在實(shí)現(xiàn)大的數(shù)值孔徑和光學(xué)矯正的必要程度的困難。
物鏡設(shè)計(jì)的一個(gè)*顯著的進(jìn)步，在*近幾年的是，這有助于降低時(shí)出現(xiàn)的光穿過(guò)透鏡系統(tǒng)的不希望的反射的防反射涂層技術(shù)的改善。每個(gè)未包衣的空氣 - 玻璃界面能反映4％和5％之間，垂直于表面的入射光束，從而在垂直入射時(shí)的透射率值的95-96％。四分之一波長(zhǎng)厚的具有適當(dāng)折射率的抗反射涂層的應(yīng)用可以增加這個(gè)值由三至百分之四。物鏡變得更復(fù)雜的透鏡元件的數(shù)量不斷增加，需要消除內(nèi)部反射，相應(yīng)增長(zhǎng)。一些現(xiàn)代的具有高度校正的物鏡可以包含多達(dá)15個(gè)鏡頭有許多空氣 - 玻璃界面的元素。如果鏡片涂層，反射損耗僅軸向光線透過(guò)率值將下降到50％左右。單層一次利用透鏡涂層，以減少眩光和提高傳輸產(chǎn)生的傳輸在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)的值*過(guò)99.9％的多層涂層，現(xiàn)在已經(jīng)取代了。
場(chǎng)的深度和圖像深度
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表2
圖3中所示的光波反射和/或通過(guò)涂有防反射層的透鏡元件的示意圖。入射波取得的*層以一定角度（在圖3中的層A），產(chǎn)生的光的一部分被反射（R（鄰））的一部分被傳輸通過(guò)所述*層。遇到的第二防反射層（B層）后，在相同的角度的光的另一部分被反射，并從*層反射的光干擾。一些其它光波繼續(xù)到玻璃表面上，在那里再次反射和透射。從玻璃表面的反射光干擾（和相消）與防反射層反射的光。防反射層的折射率的玻璃和周?chē)橘|(zhì)（空氣）的變化。由于光波通過(guò)的防反射層和玻璃表面，大部分的光（取決于入射角-通常的光學(xué)顯微鏡中的透鏡法線）*終透過(guò)玻璃集中以形成圖像。
氟化鎂是一種利用薄層的光學(xué)增透膜的許多材料，但現(xiàn)在大多數(shù)顯微鏡制造商生產(chǎn)自己的**配方。總的結(jié)果是在對(duì)比度和可見(jiàn)光波長(zhǎng)的傳輸并發(fā)的破壞性干擾，在位于傳輸頻帶之外的頻率諧波相關(guān)的顯著改善。這些專(zhuān)門(mén)的涂料可以由操作不當(dāng)容易損壞和顯微鏡應(yīng)該意識(shí)到這個(gè)漏洞。防反射多層膜有一個(gè)稍微偏綠色調(diào)，而不是單層涂層的略帶紫色的色調(diào)，觀察，可以被用來(lái)區(qū)分涂料。內(nèi)部鏡片上使用減反射膜的表面層往往比相應(yīng)的涂層設(shè)計(jì)，以保護(hù)外部鏡片表面柔和得多。清潔光學(xué)表面已經(jīng)涂有薄膜，特別是如果在顯微鏡已被拆解和內(nèi)部鏡頭元件受到審查時(shí)，應(yīng)采取非常謹(jǐn)慎。
被定義為從透鏡中心的距離平行光線的光軸上（通常被稱為主要的焦點(diǎn)）集中到一個(gè)點(diǎn)的透鏡系統(tǒng)的焦距。被稱為主要焦點(diǎn)的假想平面垂直于透鏡系統(tǒng)的焦平面的。每一個(gè)鏡頭有兩個(gè)主要的焦點(diǎn)為光進(jìn)入每邊，一個(gè)在前面，一個(gè)在后面。按照慣例，被稱為前焦面更靠近所述前透鏡元件的物鏡焦平面和焦平面位于后面的物鏡被稱為后側(cè)焦點(diǎn)面（參見(jiàn)圖4）。后側(cè)焦點(diǎn)面的實(shí)際位置的變化與物鏡建設(shè)，但一般是位于高倍率物鏡的物鏡桶內(nèi)部的某個(gè)地方。低倍率的物鏡往往有一個(gè)外部桶，坐落在線程區(qū)域或顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器內(nèi)的后焦平面。
由于光線通過(guò)一個(gè)物鏡物鏡的，它們被限制由后孔或出射光瞳的物鏡，如在圖4中示出。這個(gè)光圈的直徑12毫米低倍率物鏡之間下降到約5毫米，*高權(quán)力的復(fù)消色差物鏡。光圈大小是非常關(guān)鍵的外延照明應(yīng)用，依靠物鏡上充當(dāng)成像系統(tǒng)和聚光鏡，出瞳也成為入瞳。的圖像的光源必須完全填滿整個(gè)視場(chǎng)的物鏡后孔徑，以產(chǎn)生均勻的照明。如果光源圖像比孔徑小，視場(chǎng)照度不均勻的體驗(yàn)暗角。另一方面，如果光源的圖像大于后孔，一些光不進(jìn)入物鏡的照度降低。