徠卡顯微鏡：明亮的熒光共振掃描
觀察的快速生物過程需要高速成像系統(tǒng)。共聚焦掃描顯微鏡有一個(gè)固有的障礙：串行記錄的圖像元素。因此，基于攝像頭的系統(tǒng)，或其它的方法（不是真正的共焦掃描方法）被應(yīng)用。
對(duì)于真正的共聚焦掃描系統(tǒng)，只有更高的掃描速度可以提高時(shí)間分辨率。因此，諧振掃描系統(tǒng)已允許行頻率*高為16千赫（非共振掃描儀相比，3千赫）。信號(hào)噪聲的討論帶來了意想不到的好處共振掃描：，熒光亮和熒光染料照片預(yù)應(yīng)力。
真正的激光共聚焦掃描照明模式
真正的共焦成像需要一次在單個(gè)點(diǎn)的照明和觀察。為了創(chuàng)建一個(gè)二維圖像，這點(diǎn)需要掃描的區(qū)域，該區(qū)域?qū)⒈怀上瘛?/span>掃描通常是由兩個(gè)反射鏡，可以指向在x方向和y方向的斑點(diǎn)。像在其他的掃描系統(tǒng)（例如光柵電子顯微鏡或第 20 世紀(jì)的電視管），光點(diǎn)掃描線由左到右（x方向）和從頂部到底部的幀（y方向）。
樣品中的某個(gè)位置（例如一個(gè)熒光的位置），經(jīng)歷了一個(gè)光脈沖，每次束移到那個(gè)位置。現(xiàn)貨理想艾里形。照明的持續(xù)時(shí)間，即τ p通過的位置，依賴于波長(zhǎng)和NA 的時(shí)候，樣品中的實(shí)際的掃描速度和衍射圖案交叉的位置時(shí)的高度。衍射圖案通常遠(yuǎn)大于熒光染料（150 ... 1000海里與2 ... 20納米）。
對(duì)任意圖像進(jìn)行掃描，會(huì)體驗(yàn)到一種熒光染料，如在圖1中所示的照明脈沖模式。燈飾由于過采樣之間的時(shí)間間隔的1 / f L，f L的表示該線路頻率。真正的共聚焦顯微鏡的典型線路頻率躺在1千赫左右，但可能范圍從10 Hz?2 kHz的。
記錄，可對(duì)每個(gè)圖像，的flourochrome會(huì)遇到如上述的照明脈沖圖形。脈沖模式之間的時(shí)間是由圖像重復(fù)時(shí)間的1 /女F，無論是有限的掃描速度（通常簡(jiǎn)稱為幀每秒“幀）或故意延長(zhǎng)，這是典型的延時(shí)實(shí)驗(yàn)生理學(xué)。F F 表示“幀頻”。
（注釋：對(duì)于仿真，可以假設(shè)，只穿過一次，每幀的矩形脈沖，后者的假設(shè)是與過采樣（奈奎斯特 - 香農(nóng)）的要求相矛盾，但并不主要干擾的影響，三重峰積累）。
圖 1：受衍射限制的點(diǎn)掃描的圖像的過程的。被照亮的特征（比較小的衍射光斑延長(zhǎng)）多次，這里表示的線K，L和m。每一次，衍射圖案是不同的，根據(jù)模式和掃描線的距離的幾何形狀。
低劑量率：更少的三重態(tài)
脈沖掃描圖像中的照明和熒光過程，涉及三重態(tài)（這是*常見的標(biāo)準(zhǔn)熒光染料）的概念，我們現(xiàn)在可以了解真正的共焦掃描系統(tǒng)具有快速（相比較低的高速掃描儀）的結(jié)果建議一個(gè)更好的熒光信號(hào)和漂白時(shí)，用人共振掃描系統(tǒng)。
如果沒有三胞胎本，照度的量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)的熒光光子的量將取決于。的照明接通時(shí)，排放量將增加（增加的速度取決于熒光壽命），并保持在一個(gè)恒定的水平。只要我們?cè)试S有些激動(dòng)分子搬離到三重態(tài)，他們不再是可產(chǎn)生熒光光子。因此，排放量將減少。我們甚至可以假設(shè)所有的分子都在三重態(tài)的情況下，只有非常偶然，三重態(tài)松弛到基態(tài)時(shí)，熒光機(jī)械工作很短的時(shí)刻，冒出一些光子，并盡快停止分子進(jìn)行系統(tǒng)間的過渡和保持暗三重態(tài)。這種極端的情況是一個(gè)現(xiàn)代化的*分辨率技術(shù)：地面狀態(tài)耗盡（GSD）的基礎(chǔ)。但是，即使在極端條件下少，三重態(tài)減少的金額準(zhǔn)備發(fā)射的熒光染料。和從T到G的松弛慢（取決于分子的量子參數(shù)）。
如果我們停止照明，熒光顯示實(shí)際的熒光衰減時(shí)間將減少。漸漸的，速度卻慢得多，三重態(tài)分子也將返回到基態(tài)，當(dāng)他們準(zhǔn)備再次產(chǎn)生熒光。顯然，很重要，無論我們?cè)噲D得到的排放，在一個(gè)單一的，長(zhǎng)的照明（三重態(tài)強(qiáng)度降低），或在一對(duì)夫婦的小劑量用一些時(shí)間來放松之間（仍然假設(shè)總照射劑量是恒定的?。┰诤笳叩那闆r下如果該場(chǎng)所是在三重松弛（R）或更長(zhǎng)的時(shí)間的范圍內(nèi)，我們將收集更多的光子，在末端。這是明亮的成像在同等照度劑量相同。
避免三重態(tài)有一個(gè)額外的好處：的樣本將漂白少。作為指出，很大一部分是由于漂白激發(fā)三重態(tài)。如果我們能夠避免這些國家的積累，分子光化學(xué)解體的風(fēng)險(xiǎn)較小。
低線頻率增加照明脈沖之間的恢復(fù)時(shí)間，但也增加的照明脈沖時(shí)間，更慢點(diǎn)動(dòng)過樣品。一般，這種較慢的運(yùn)動(dòng)增加了三重峰濃度。只有非常低的強(qiáng)度，可避免這種效果。
高線頻率縮短照明脈沖之間的時(shí)間，從而增加了三重積累。另一方面，每脈沖的光照時(shí)間是較短的，因此較少的三胞胎被累積。
如果相同劑量的光施加在小劑量乘以頻率的n倍，累積或平均n次，將增加，如果總的熒光衰減時(shí)間顯著長(zhǎng)于脈沖之間的渡假。在這里，共振掃描儀是*有益的。
如果三重峰衰減慢于行頻，隔行掃描的過采樣將提高信號(hào)。在這里，后續(xù)幀收集信息，否則重疊線。例如先掃描線每5 次，2 次掃描，每5 次 + 1行...等等。在這種情況下，照明脈沖之間的三重恢復(fù)允許的時(shí)間幀頻率f F統(tǒng)治。
在任何情況下，*好是使用短的照明脈沖，即快線頻率。共振掃描系統(tǒng)（目前，振鏡光學(xué)掃描設(shè)備提供高達(dá)20 kHz），因此提高了信號(hào) - 噪音和減少漂白和光毒性一般選項(xiàng)。
圖 3：分裂熒光照射劑量。在左側(cè)，單劑量應(yīng)用。熒光強(qiáng)度顯示為綠色。由于三重峰積累（紅色曲線）時(shí)，熒光強(qiáng)度降低。總收率類似綠色曲線下方的面積。在右邊，相同劑量應(yīng)用分成兩半。在休息時(shí)間，三重積累消失（紅色曲線）和熒光再像以前一樣強(qiáng)烈。這里的兩個(gè)區(qū)域和大的產(chǎn)率相比，在單脈沖實(shí)驗(yàn)。
三重態(tài)，熒光暗態(tài)
適當(dāng)?shù)纳逝c光（光子能量）照明時(shí)，熒光染料可以吸收從地面狀態(tài)G，光子和過境到激發(fā)態(tài)E.在分子中，這些狀態(tài)顯示了一系列的子狀態(tài)（振動(dòng)狀態(tài)）。當(dāng)興奮到這些振動(dòng)狀態(tài)，分子很快會(huì)放松到*低的子狀態(tài)（在低溫下，如室溫）。從激發(fā)態(tài)，分子將返回到基態(tài)。典型的剩余時(shí)間在激發(fā)態(tài)取決于分子中的電子系統(tǒng)中，被稱為“熒光”。激發(fā)態(tài)衰變到地面狀態(tài)指數(shù)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，衰減其他光子觸發(fā)。這種現(xiàn)象被稱為受激發(fā)射（見STED*高分辨率顯微鏡）。過渡到基態(tài)時(shí)，能量被釋放通過發(fā)射一個(gè)光子。在共同的熒光過程（自發(fā)輻射），所發(fā)射的光子的能量是由振動(dòng)能量差小于激發(fā)光子的能量。因此，有一個(gè)更短的波長(zhǎng)（激發(fā)），以較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（發(fā)射）的斯托克斯位移（Stokes shift）。
根據(jù)分子上，也有可能被耗盡后，激發(fā)態(tài)的其他途徑。*突出的非熒光的方法之一是一個(gè)所謂的“系統(tǒng)之間的十字路口”，ISC。在這里，的分子進(jìn)入狀態(tài)，大力E和G.之間對(duì)于量子力學(xué)的原因，這種狀態(tài)被稱為“三重態(tài)的”T，從這里到地面狀態(tài)的衰減很慢。因此，分子是“關(guān)閉”假設(shè)三重態(tài)的時(shí)間。還有其他一些國家，其中一個(gè)熒光非熒光，尤其是*重要的熒光蛋白顯示各種“黑暗狀態(tài)”，不一定三重態(tài)。這里發(fā)現(xiàn)熒光產(chǎn)量報(bào)告也將適用于非三重黑暗狀態(tài)。不可逆的熒光破壞（漂白），可能需要不同的論證。
三重態(tài)的討論用于漂白的主要來源之一。尤其是激發(fā)三重態(tài)傾向于與分子化學(xué)中斷。在模擬中為了簡(jiǎn)單起見，可以假設(shè)所有熒光染料三重態(tài)吸收額外的光子將被不可逆地破壞（漂白）。
圖 2：雅布隆斯基圖熒光激發(fā)，發(fā)射和三重轉(zhuǎn)換。可能被激發(fā)熒光（防爆）從地面狀態(tài)G到激發(fā)態(tài)E.該系統(tǒng)將很快放松在熱亞（虛線，適用于所有過渡）*低。從興奮狀態(tài)，系統(tǒng)可以返回到基態(tài)（EM）所釋放出的能量作為發(fā)射光子。興奮狀態(tài)，也可以輸入一個(gè)三重態(tài)T系統(tǒng)間穿越過程（ISC）。從這里，它可能慢慢返回到基態(tài)（R）。或者，特別是在吸收進(jìn)一步的能量，分子化學(xué)分解，因此結(jié)束漂白的（BL）。