徠卡顯微鏡：活細胞成像技術(shù)
復(fù)雜和/或快速的細胞動力學的理解是探索生物過程的一個重要步驟。因此，今天的生命科學研究越來越注重動態(tài)過程，如細 胞遷移，細胞，器官或整體動物形態(tài)學變化和生理（如細胞內(nèi)的離子成分的變化）事件實時的活標本。解決這些具有挑戰(zhàn)性的需求的方法之一是采用若干統(tǒng)稱活細胞成像的光學方法。活細胞成像活細胞的動力學過程，而不是給細胞的當前狀態(tài)的一個“快照” -允許調(diào)查將改編成電影的快照。活細胞成像提供了空間和時間信息的動態(tài)事件在單細胞，細胞網(wǎng)絡(luò)（原位），甚至整個生物體（體內(nèi)）。這些特點使活 細胞成像技術(shù)，為細胞生物學，癌癥研究，發(fā)育生物學和神經(jīng)科學的解決問題的必要條件。
近年來，在電子，光學和分子生物學取得了重大進展，活細胞成像輕松訪問科學家。
活細胞成像采用的方法
離子成像 - 離子濃度的變化觀察
通常執(zhí)行的方法是鈣，氯，鎂離子成像（）可以使用熒光染料或蛋白質(zhì)，尤其是鈣離子結(jié)合后，旨在改變其排放行為。這使研究人員能夠觀察到細胞中的離子濃度的動態(tài)變化。由于離子組成細胞的細胞質(zhì)中確定許多重要功能的細胞，如神經(jīng)細胞的興奮性，基因轉(zhuǎn)錄和細胞運動（只是僅舉幾例）調(diào)節(jié)細胞內(nèi)離子在空間和時間方面是生命科學的重大利益研究。另外，成像細胞內(nèi)pH值水平或電壓可以用特殊的熒光染料。一個特殊的成像技術(shù)離子濃度，pH值或電壓變化比例成像方法。這些可以進行精確的測定，例如細胞內(nèi)鈣濃度的相對變化，而不是監(jiān)測，因為它是在非比例的方法。
FRET - 量化的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用
要動態(tài)檢測蛋白質(zhì)相互作用FRET（福斯特共振能量轉(zhuǎn)移）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）事件可以在活細胞實驗成像。FRET量化分子動力學，如蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-DNA相互作用，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化是一個有用的工具。FRET成像通常使用GFP（綠色熒光蛋白）的衍生物，特別是CFP和YFP（青色和黃色熒光蛋白，分別），這是每一個連接到感興趣的蛋白質(zhì)，使用分子生物學方法。CFP分子被激發(fā)熒光燈。盡快感興趣的蛋白質(zhì)緊密的空間接近（小于20 nm）的CFP將作為供體和轉(zhuǎn)移的能量以光的形式發(fā)射到Y(jié)FP的，作為受體。研究人員將觀察轉(zhuǎn)變，從從CFP發(fā)出藍色熒光YFP發(fā)出的黃色熒光。在BRET的情況下，捐贈者是一個發(fā)光的分子（如熒光素衍生物）作為捐贈者，像熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），GFP衍生物作為受體。
圖 1：活細胞共聚焦圖像擬南芥; endoplasmatic網(wǎng)：GFP標記的自體熒光綠色，紅色，藍色傳輸葉綠體。基于這樣的圖像，例如FRET或FRAP分析可以做到。
FRAP - 監(jiān)控蛋白和囊泡販運
適用于監(jiān)控蛋白或囊泡運輸?shù)姆椒ㄍ枪馄祝‵RAP）后熒光恢復(fù)。在這里，熒光蛋白（GFP）的感興趣的蛋白（即一種蛋白質(zhì)，其運動是要監(jiān)視）。一般情況下，整個小區(qū)是初步熒光蛋白可能在整個細胞豐富。目標區(qū)域的細胞，通常在神經(jīng)細胞的軸突或樹突細胞的過程，例如，暴露在高強度的光（通常為激光），并在該特定區(qū)域的熒光被破壞（漂白）。感興趣的蛋白質(zhì)是移動的，其他部位的細胞蛋白reinvade漂白區(qū)域以一定的速度，并在漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)。這可以給研究人員深入到細胞內(nèi)運輸動力學。
TIRF - 觀察過程接近到細胞膜
觀察位于或接近一個細胞的質(zhì)膜的事件的一個特殊的技術(shù)是全內(nèi)反射熒光顯微鏡（全內(nèi)反射）。通過使用熒光染料的激發(fā)僅穿透細胞的60-250納米的漸逝場中，全內(nèi)反射熒光顯微鏡提供一個*的z軸分辨率，使中發(fā)生的事件或接近到質(zhì)膜（例如分子運輸?shù)劫|(zhì)膜）的成像，而不熒光分子在細胞內(nèi)的相形見絀。
TIRF圖像：半乳糖凝集素-3接近沿著肌動蛋白絲膜囊泡運輸。
圖 2A：概述螢光圖像， 圖 2B：概述圖像與TIRF在C所示，標記的部分，
圖 2C：TIRF部分的時間序列，時間定在幾秒鐘內(nèi)。首先沿著肌動蛋白絲（從底部向上）運輸à半乳糖凝集素-3的囊泡（標YFP）膜（箭頭），切換到另一個燈絲（88），移動到左側(cè)（109），再次運送到右側(cè)，再次切換燈絲，然后被輸送向上（246次）。
YFP：紅色; CFP：綠色;圖像概覽：20微米;截面：6微米，穿透深度TIRF：110納米的尺度。Courtesy of Ralf Jacob, University of Marburg, Germany
光敏 - 監(jiān)測基因表達和蛋白質(zhì)運輸
*近開發(fā)的方法，稱為光敏選擇性地標記在一個單元格或整個機體的某些地區(qū)或感興趣的領(lǐng)域。對于使用光活化，尤其是設(shè)計的染料或熒光蛋白，如綠色熒光蛋白（paGFP）光活化的或楓。這些熒光熒光在其正常狀態(tài)。然而，某些波長的光照射之后，這些熒光可以激活熒光像傳統(tǒng)熒光。在許多情況下，這些蛋白質(zhì)的基因融合到某些感興趣的蛋白質(zhì)的表達或傳輸然后，可以監(jiān)測。然后可以應(yīng)用如FRAP或粒子跟蹤的方法，感興趣的蛋白質(zhì)，以進一步調(diào)查。
MPE - 深入調(diào)查過程中
現(xiàn)代生物學研究的要求真正在體內(nèi)的調(diào)查，以配合“準體內(nèi)”，在細胞培養(yǎng)實驗。但它是很難，調(diào)查像鼠標生物體內(nèi)部發(fā)生的進程。多光子激發(fā)顯微鏡（MPE）可更深入地滲透到組織中，因為近紅外激發(fā)光的，具有較長的波長，相比，單光子激發(fā)的短波長的光用于減分散。MPE技術(shù)的非線性性質(zhì)，限制了光漂白和光毒性在聚焦的區(qū)域。長期調(diào)查，這是極其有利的，因為無論是熒光蛋白和生物體遭受這些問題。使用適當?shù)臏蕚浜臀⒂^設(shè)置，成像到幾毫米到組織的報告。使得它適合用于光子操縱以及激發(fā)的精確定位。這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)生物學的廣泛應(yīng)用。
STED - 細胞動力學研究納米尺度
受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡可以讓科學家們調(diào)查*越光學分辨率極限的結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)使用熒光染料，被刺激的排放，以消除探測信號的財產(chǎn)。下降到50-70納米的細胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)成功地成像。提高分辨率是非常重要的為調(diào)查小細胞結(jié)構(gòu)。特別是對那些誰想要看看共存事件，分辨率的提高可以產(chǎn)生更逼真的效果。隨機STED的獨立性，使成像速度非常快，相比其他的*分辨率技術(shù)。視頻率STED收購已經(jīng)實現(xiàn)，它允許實時細胞動力學研究。
圖 3：STED活細胞成像單元標簽技術(shù)：Vero細胞結(jié)構(gòu)：EB3，瞬時轉(zhuǎn)染;標簽：俄勒岡綠488。
FLIM - 活細胞的空間測量
熒光壽命成像的優(yōu)點在于，該數(shù)據(jù)是不依賴于信號強度。因此，它不是常見的文物，如漂白濃度變化的影響。使用時間相關(guān)單光子計數(shù)，F(xiàn)LIM的重建圖像數(shù)據(jù)的單分子檢測。在子納秒熒光壽命的變化*小，可以注冊和分析。該方法具有通用性外和細胞內(nèi)環(huán)境改變，從而導(dǎo)致熒光壽命改變?nèi)魏畏N類的調(diào)查。FLIM的FRET分析的發(fā)射強度是不敏感的，從而增加量化數(shù)據(jù)的精度。
CARS和SRS - 無標記方法振動對比
幾乎所有活細胞的熒光成像方法基于熒光蛋白的基因表達。這涉及大量的技術(shù)工作和可觀的費用。此外，外部基因的表達有可能發(fā)生變化的微環(huán)境，從而導(dǎo)致從生理的現(xiàn)實的變化的數(shù)據(jù)。相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡和共焦方法是非線性的，這是不依賴于熒光染料的受激拉曼散射（SRS）顯微鏡。這些標簽免費的方法圖像樣本中的特定化學鍵的振動狀態(tài)。的積累，在活的生物體中的特定化學鍵，如在軸突周圍的髓磷脂的脂質(zhì)，可以成像在高分辨率和出色的信號與噪聲的質(zhì)量，而不需要任何染色。
未來是定量
生物研究已經(jīng)離開了年齡的描述性調(diào)查，并進入了一個時代的定量分析。新的活細胞成像技術(shù)發(fā)展的方向，更高的分辨率，無論是在空間和時間。技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在集中在納米范圍內(nèi)的單分子和分子反應(yīng)為幾皮秒的定量研究。