奧林巴斯顯微鏡：熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM）
觀察生物材料（如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸，和離子）的分布的組織和細(xì)胞的研究領(lǐng)域中，積極地使用多顏色用熒光染料染色。熒光觀察的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)單一的熒光染料分子的水平下最好的情況下，可以檢測(cè)到。本節(jié)回顧熒光壽命成像顯微鏡（FLIM），一個(gè)新的熒光顯微鏡技術(shù)的幾個(gè)重要方面。此外多色染色，還可以利用熒光壽命成像可視化的因素的影響，也就是說，在分子周圍的環(huán)境的狀態(tài)的染料分子的熒光壽命特性。
波長(zhǎng)光譜
傳統(tǒng)的熒光顯微鏡利用熒光染料，也就是標(biāo)識(shí)基于熒光染料的光譜特性之間的差異的顏色屬性。利用這種技術(shù)，可以同時(shí)使用五個(gè)或六個(gè)染料在從紫外光到近紅外的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，在顯微鏡下沒有顏色之間的混淆。
壽命譜
每一個(gè)熒光染料，有自己的生命周期，處于興奮狀態(tài)。通過檢測(cè)壽命的差異，這是可以區(qū)分具有相同的熒光色，以及識(shí)別自體熒光的染料。此外，使用具有很長(zhǎng)的使用壽命比通常使用的熒光染料的探針，可以通過以下方式獲得高的信號(hào)噪聲的圖像。例如，鉑糞卟啉有一生的毫秒量級(jí)，而普通的熒光染料的壽命是納秒級(jí)。這種相對(duì)長(zhǎng)壽命的熒光染料將很快被用作探針的DNA芯片上檢測(cè)。
熒光壽命成像也使得有可能獲得分子的信息，同時(shí)觀察活細(xì)胞。熒光壽命的影響因素包括當(dāng)兩種蛋白質(zhì)彼此接近時(shí)，離子強(qiáng)度，憎水性能，氧濃度，分子結(jié)合，能量轉(zhuǎn)移和分子間的相互作用。然而，終生是獨(dú)立的染料濃度，光漂白，光散射和激發(fā)光的強(qiáng)度。因此，熒光壽命成像，使我們能夠進(jìn)行精確的離子濃度測(cè)量和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析。
熒光壽命成像的方法有兩種：時(shí)域方法和頻域方法。
· 時(shí)域FLIM的 -通過脈沖激光激發(fā)后的延遲在某些情況下，熒光圖像可以通過以下方式獲得的圖像增強(qiáng)器的門控操作。通過激光，脈沖持續(xù)時(shí)間為幾百皮秒和納秒級(jí)快門的激發(fā)態(tài)的壽命，因?yàn)橥ǔＪ?/span>1至20納秒，以納秒為單位計(jì)量的壽命。一個(gè)高速柵極圖像增強(qiáng)市售濱松光子學(xué)株式會(huì)社（日本濱松市）。在每個(gè)像素處的熒光壽命測(cè)量而不同的延遲時(shí)間，直到一個(gè)門打開，也可以通過以下方式獲得。根據(jù)他們的一生中偽彩色的熒光壽命的圖像顯示。
· 頻域FLIM -熒光壽命的計(jì)算通過測(cè)量熒光的相移和在其幅度的減少使用的檢測(cè)器的增益調(diào)制器調(diào)制的激光作為激發(fā)光源時(shí)（為1?200兆赫茲）。測(cè)量可以由激光掃描（光電倍增管）或使用的電荷耦合器件（CCD）。
應(yīng)用
探頭的周圍環(huán)境檢測(cè)到的事實(shí)，熒光壽命為敏感的氫離子濃度（pH值），氧，和鈣離子濃度的基礎(chǔ)上。的綁定或分子之間的相互作用也可以結(jié)合測(cè)量FRET。
鈣離子濃度成像
當(dāng)鈣離子結(jié)合的Fura-2的熒光探針，例如，氟-3或鈣綠，熒光壽命的熒光強(qiáng)度的變化。離子濃度測(cè)定用常規(guī)方法集中在強(qiáng)度上的變化。據(jù)的變化的鈣離子濃度，染料之間的結(jié)合與非結(jié)合鈣離子的變化的比率，這隨后導(dǎo)致在試樣中的測(cè)量點(diǎn)的熒光壽命的變化。除了鈣離子探針，這種技術(shù)也適用于測(cè)量溶液pH和其他離子如鈉離子和鎂離子。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
目前正在研究將進(jìn)行FRET的綠色熒光蛋白（GFP）的變體（GFP用不同的熒光彩色）。熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使得它可以測(cè)量的熒光染料標(biāo)記的一對(duì)兩個(gè)蛋白之間的相互作用（關(guān)聯(lián)或解離）。一個(gè)捐助熒光染料激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)較短的提供能量的到受體熒光染料的。激發(fā)態(tài)的供體染料的生存期是可變的，取決于受體（染料接收的能量）是否存在。基于生命周期的測(cè)量，因?yàn)檫@是沒有必要考慮重疊的熒光在檢測(cè)過程中，允許更好的定量。
臨床影像
作為某些組織和cytodiagnostic標(biāo)本有很強(qiáng)的自體熒光的探針，使用具有長(zhǎng)壽命（以毫秒為單位）已嘗試。長(zhǎng)壽命的探針也可用于熒光原位雜交（FISH），可以同時(shí)使用的顏色的數(shù)量是有限的，因?yàn)槭褂迷摷夹g(shù)。血液中的氫離子濃度，以及氧和二氧化碳的壓力，已經(jīng)被測(cè)量熒光壽命的基礎(chǔ)上，，雖然這樣測(cè)量的仍然是不可能的，在顯微鏡下。