奧林巴斯顯微鏡：什么是熒光？

當(dāng)試樣，活的或非活的，有機(jī)或無機(jī)，吸收和后來重新煥發(fā)燈，這個(gè)過程描述為光致發(fā)光。如果光的發(fā)射，激發(fā)能量（光）后，便不再持續(xù)幾秒鐘，該現(xiàn)象被稱為磷光。熒光，在另一方面，描述了光發(fā)射的激發(fā)光的吸收僅在繼續(xù)。激發(fā)光的吸收和再輻射光熒光發(fā)射的時(shí)間間隔是異常持續(xù)時(shí)間短，一般不超過百萬分之一秒。

熒光的現(xiàn)象是19世紀(jì)所產(chǎn)生。英國科學(xué)家Sir George G. Stokes首先觀察礦物螢石具有熒光，用紫外光照射時(shí)，他創(chuàng)造了這個(gè)詞“熒光”。斯托克斯觀察熒光光具有更長的波長比激發(fā)光，已經(jīng)成為一種現(xiàn)象，被稱為斯托克斯位移。在圖1中，一個(gè)光子的紫外線輻射（紫）在一個(gè)簡單的原子，令人興奮的電子碰撞，并提升到一個(gè)更高的能量水平的電子。隨后，被激發(fā)的電子放松到一個(gè)較低的水平，并在可見光區(qū)域的低能量光子（紅色）的形式發(fā)射光。圖2是可見光范圍內(nèi)的電磁輻射，其中包括約400?700納米的波長范圍內(nèi)的圖解表示。周邊的可見區(qū)域高的紫外線能量和較低的能量的紅外光。

熒光顯微術(shù)是一個(gè)極好的方法，可以發(fā)出熒光，可以在它的自然形態(tài)（稱為原發(fā)性或自體熒光）或用能夠熒光（稱為次級熒光）的化學(xué)品處理時(shí)的研究材料。熒光顯微鏡卡爾·賴克特8月科勒，和海因里?！とR曼在二十世紀(jì)早期的一部分，制定，等等。然而，此儀器的潛力沒有實(shí)現(xiàn)了幾十年，和熒光顯微鏡現(xiàn)在是一個(gè)重要（也許是不可缺少的）工具中的細(xì)胞生物學(xué)。

早期的調(diào)查顯示，許多標(biāo)本，包括相關(guān)微量礦物質(zhì)元素，晶體，樹脂，生藥，黃油，葉綠素，維生素，和無機(jī)化合物，用紫外線光照射時(shí)表現(xiàn)出的自體熒光。然而，它不是直到1930年，奧地利研究者最大Haitinger和其他科學(xué)家開發(fā)的技術(shù)，它采用二次熒光熒光染色標(biāo)記特定的組織成分，細(xì)菌和其他的病原體，不自體熒光。標(biāo)簽特定的生化指標(biāo)，在這些熒光染料的污漬，促使人們使用熒光顯微鏡。該儀器的價(jià)值顯著增強(qiáng)，由1950年的組織中，用熒光素標(biāo)記的抗體反應(yīng)，當(dāng)阿爾伯特浣熊和彌敦道卡普蘭顯示本地化的抗原。

熒光顯微鏡的基本任務(wù)是允許激發(fā)光照射試樣，然后單獨(dú)遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于從明亮的激勵(lì)光發(fā)射的熒光。因此，只有從檢體的發(fā)射光到達(dá)眼睛或其它檢測器（通常是一個(gè)數(shù)字或傳統(tǒng)的膠片相機(jī)）。黑暗的背景下產(chǎn)生的熒光的領(lǐng)域再鑄輝煌足夠的對比度，這樣可以檢測。越暗的背景后面的非熒光材料，儀器的效率就越高。

圖3表示用熒光顯微鏡觀察熒光的標(biāo)本時(shí)，出現(xiàn)的圖形表示。通過光從紫外線發(fā)射源通過勵(lì)磁機(jī)過濾器所產(chǎn)生的紫外線（UV）光的特定波長或波長組。過濾的紫外線光照射的試樣，在這種情況下，氟石的晶體，這反過來又通過紫外線光照射時(shí)發(fā)射熒光的光。從檢體在圖3中，紅色，發(fā)出的可見光通過屏障過濾器不允許通過反射紫外光，然后過濾。應(yīng)當(dāng)指出，這是唯一的模式，其中顯微鏡標(biāo)本，激發(fā)后，產(chǎn)生自己的光。所發(fā)出的光在所有方向上（在一個(gè)360度的角度），激發(fā)光的方向無關(guān)的再輻射球。

熒光顯微鏡是一個(gè)迅速擴(kuò)大的調(diào)查和寶貴的工具。其優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)屬性不那么容易可以在其他光學(xué)顯微鏡技術(shù)。熒光染料的使用使得有可能具有高度的特異性熒光材料之中，以確定細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分和其他實(shí)體。更重要的是，在熒光顯微鏡可以揭示與精致的靈敏度熒光材料的存在。一個(gè)非常小的熒光分子數(shù)（50每立方微米的分子數(shù)）可以被檢測到。在一個(gè)給定的樣本中，通過使用多個(gè)染色，不同的探針將揭示單個(gè)目標(biāo)分子的存在。雖然在熒光顯微鏡不能提供的各試樣的衍射極限以下的空間分辨率，低于該范圍內(nèi)的熒光分子的存在下顯著可見。

熒光顯微鏡的技術(shù)可以應(yīng)用到有機(jī)材料，以前?。ㄉ铮┎牧希蛴猩奈镔|(zhì)（與使用在體外或在體內(nèi)的熒光染料）或無機(jī)材料（尤其是在半導(dǎo)體晶片上的污染物的調(diào)查） 。也有許多研究使用熒光探針監(jiān)測快速變化的生理濃度的離子，如鈣和鎂，和在活細(xì)胞中的pH值。

許多植物和動(dòng)物組織中，以及材料和試樣，固有熒光照射時(shí)更短的波長的光（主或自體熒光）。自體熒光植物研究，煤巖，沉積巖巖石，在半導(dǎo)體工業(yè)中已發(fā)現(xiàn)有用的。自體熒光在動(dòng)物組織或病原體的研究，往往是極其微弱的，或如非特異性自發(fā)熒光用處很小。的更大的價(jià)值等標(biāo)本，通過照射光，被激發(fā)和發(fā)射的光的最終產(chǎn)率是力度更大的外在熒光染料（也稱為熒光團(tuán)）。這樣的熒光被稱為次級熒光。

熒光染料漬，有點(diǎn)類似較知名的可見光吸收組織污漬，重視自己可見或亞可見的有機(jī)物。這些熒光染料，能夠吸收，然后再照射光，往往是高度特異性的，在他們的附件定位在吸收發(fā)射比（稱為量子產(chǎn)率）的概念，并有顯著的產(chǎn)率。這使得熒光染料極其寶貴的生物應(yīng)用。使用熒光顯微鏡的增長，數(shù)以百計(jì)的熒光染料與已知強(qiáng)度激發(fā)曲線（吸收）和排放和理解生物結(jié)構(gòu)目標(biāo)的發(fā)展是緊密相連的。

圖4中所示的兩個(gè)最常用的熒光染料，在熒光顯微鏡。流行的核酸染色，4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚（DAPI），在圖4中左邊的分子，是具有兩個(gè)親核性很強(qiáng)的脒基部分，這是有用的熒光標(biāo)記核酸的吲哚衍生物，并具有被廣泛地應(yīng)用于病原體的快速鑒定的熒光分析。最初作為一個(gè)潛在的抗錐蟲劑的合成，DAPI結(jié)合腺苷和胸苷（AT）堿基對的DNA區(qū)域中被激發(fā)的最大吸收波長為355納米的紫外線。在可見光光譜的藍(lán)色區(qū)域中的染料發(fā)出熒光。DAPI分子的右側(cè)（圖4）是另一種熒光染料，德克薩斯紅，熒光共軛物中的屬性已經(jīng)過深入研究。此熒光染料被開發(fā)用于在應(yīng)用程序中的雙標(biāo)記被稱為流式細(xì)胞儀，但廣泛地用于在熒光顯微鏡中用于抗體檢測的羅丹明（另一種常用的熒光染料）。

在許多情況下，組合使用得克薩斯紅用DAPI和異硫氰酸熒光素（FITC）的乘法，由于紅色，藍(lán)色，和綠色的熒光染料，可以觀察到染色標(biāo)本。當(dāng)決定哪些標(biāo)簽使用熒光顯微鏡，它必須牢記，選擇應(yīng)具有較高的熒光激發(fā)光吸收的可能性，并應(yīng)保持連接到目標(biāo)分子。還應(yīng)該能夠提供令人滿意的產(chǎn)率發(fā)射的熒光的熒光。

熒光顯微鏡的最重要的應(yīng)用之一是在免疫熒光字段。活的動(dòng)物制造無數(shù)的使用，配合白血細(xì)胞，以消除任何進(jìn)入異物，如病毒，細(xì)菌，外源蛋白，其中含有或產(chǎn)生抗原的抗體。抗原-抗體反應(yīng)是高度特異性的，常示意性地比作鎖和鑰匙的關(guān)系。免疫熒光顯微鏡的敏感性和高度的特異性免疫展出之間的婚姻將其成功歸功于。

在直接免疫熒光法中，被標(biāo)記的特異性抗體，通過化學(xué)附加熒光色素的形成，什么是已知的作為共軛物含有懷疑存在已知的一個(gè)特定的抗原刺激抗體的生產(chǎn)顯微鏡載片上，然后將其傳播。如果抗原存在時(shí)，標(biāo)記的抗體結(jié)合物與抗原結(jié)合，并結(jié)合到所述試樣被洗滌之后。當(dāng)被激發(fā)的熒光在其激發(fā)峰，隨后在不同波長的發(fā)光強(qiáng)度可以被目視觀察或捕獲的檢測器系統(tǒng)（數(shù)字或傳統(tǒng)相機(jī)）的化學(xué)附著的熒光共軛物和抗原的存在下證明。

另一種常用的技術(shù)被稱為間接免疫熒光法，其中可能含有未標(biāo)記的抗體及其相關(guān)的，但已知的血清，抗原一起孵育。甲熒光標(biāo)記的抗人抗體（如果被測試的試樣是人類），然后放置在幻燈片上含有的未標(biāo)記的抗體-抗原。如果確實(shí)出現(xiàn)了抗原-抗體反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗人抗體附著形成的復(fù)合物的抗原和抗體。隨后，抗原，抗體，和熒光染料標(biāo)記的抗人抗體的標(biāo)記的分組在該熒光強(qiáng)度的峰值波長激發(fā)，觀察到任何因此而產(chǎn)生的排放。間接免疫熒光技術(shù)，降低庫存大量標(biāo)記抗體的必要性，也通常會(huì)導(dǎo)致更大的熒光強(qiáng)度。

à相當(dāng)面積的熒光調(diào)查與細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)染色。熒光染料已被用于識(shí)別染色體DNA含量，蛋白質(zhì)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，激素和維生素。熒光顯微鏡是一個(gè)功能強(qiáng)大的工具，在這些研究中，因?yàn)樗x熒光染料精湛的靈敏度和他們極微量標(biāo)本中特異性。事實(shí)上，雖然在熒光顯微鏡是有限的，其空間分辨率受數(shù)值孔徑衍射極限，熒光探針的一般規(guī)則，可以通過發(fā)射光，揭示存在的熒光材料，這種材料可見，即使目前在只能分分辨率的數(shù)量時(shí)（例如幾個(gè)分子）。

涉及了一批新興的應(yīng)用熒光顯微鏡熒光探針（熒光染料）生活物資，無論是在體外（玻璃）和體內(nèi)（在生活中）的應(yīng)用。這些探頭，因?yàn)榭赡艿亩拘韵拗品敝忱щy。此外，相當(dāng)數(shù)量的重視，必須支付的時(shí)間間隔，因?yàn)椴粩嘧兓男再|(zhì)的生命過程和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)。熒光調(diào)查已經(jīng)應(yīng)用到重要的生物離子，如氫（pH值），鈣，鎂離子濃度的變化，綁定和非綁定，。

其中最有名的是研究細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針采用了時(shí)下流行的Fura-2 。對于這種染料，雙激發(fā)波長為約340納米和380納米（使用光斬波器和雙激發(fā)濾光片或單色儀）可以監(jiān)測在一個(gè)單一的發(fā)射波長，這是衡量獨(dú)立地為每個(gè)激發(fā)帶。一臺(tái)主機(jī)控制顯微鏡是用來計(jì)算的比率（被稱為比熒光成像過程）綁定到細(xì)胞內(nèi)游離鈣熒光強(qiáng)度的變化所揭示的。的比的方法的優(yōu)點(diǎn)是，基本上所有的因素，除了雙近紫外光的激發(fā)波長，其中每個(gè)產(chǎn)生在可見光譜的綠色部分中的排放保持恒定。用探針被稱為印度1比成像進(jìn)行類似的類型。對于該熒光染料，綁定和非綁定的細(xì)胞內(nèi)鈣的測定，也可用于一個(gè)單一的激發(fā)波長，但發(fā)射的測量是在兩個(gè)波長區(qū)分綁定未結(jié)合的鈣。