徠卡顯微鏡：螢光蛋白及熒光計時器

術語“螢光蛋白”結合了一組基因改變的熒光蛋白，具有非常特殊的屬性：它們可以從一個非熒光狀態(tài)激活，他們可以改變他們的發(fā)射光譜或進行切換和關閉，他們甚至能夠“為很多次。此行為是由于一些獨特的照片的物理屬性。在單分子水平，許多熒光蛋白顯示閃爍的活動可以由外部照明的影響的特性。有明顯分別發(fā)射和非發(fā)射新的發(fā)射狀態(tài)，所表達的內容屬性光可活化，photoconvertible的的或光開關，光學熒光筆蛋白突變的熒光蛋白。另一個有趣的類型的熒光蛋白熒光定時器能夠改變它們的顏色隨著時間的推移。下面的文章將給予這些“特殊”的熒光蛋白的選擇的概述。

光活化的蛋白

光活化的蛋白可以“接通”從低熒光狀態(tài)到一個更高的熒光狀態(tài)。此開關期間發(fā)生的事件的第二小于施加短暫的光脈沖在紫色/藍色光譜，并允許動態(tài)細胞過程的檢測。感興趣的區(qū)域（ROI）中的分子定向光活化可用于監(jiān)測這些被激活的細胞內的蛋白質的運動。而像FRAP在其他脈沖追逐的實驗設置一個不能區(qū)分蛋白質重新進入的投資回報率和新合成的分子，光敏繞過這個問題的方法之一。

第一光活化的蛋白是一個wtGFP變體，并，，由Lippincott-Schwarz和帕特森已經建立。它包括的單點突變（T203H），這會導致一個非常低的區(qū)域從450到550nm的吸光度。被光活化與紫色光的幫助下，PA-GFP（綠色熒光蛋白光活化的）開關從400到504 nm的最大吸收。因此，其熒光增加CA。100倍，當用波長為488 nm，什么樣的是反映在激活的和未激活的蛋白之間形成了鮮明對比激發(fā)[ 1 ]。

PA-GFP的激活過程中的基本過程似乎是谷氨酸的側鏈殘基222的光致脫羧。這種損失的二氧化碳改變了發(fā)色基團的配置從一個中性的陰離子狀態(tài)[ 2 ]。

這里應該提到另一個候選是Phamret（光活化介導的共振能量轉移），這是一個特殊的串聯(lián)二聚體的熒光蛋白，光活化的熒光共振能量轉移。phamret的融合蛋白組成的一個PA-綠色熒光蛋白的共價耦合到FRET伙伴ECFP。在480 nm到458 nm波長的曝光導致排放ECFP。相鄰光敏PA-GFP有405nm的激光束。在這之后，反復暴露于458納米導致FRET激發(fā)ECFP和PA-GFP之間的，在綠色熒光。因此，“無效”和“活躍”的形式，可以激發(fā)出相同的激光波長?？赡苁秦摰奶匦缘牡鞍踪|的大小，這是由兩個熒光蛋白，可能喚起空間位阻問題。

值得注意的是，光活化的蛋白通常顯示降低亮度相比，EGFP的耐光性降低，并顯示出。

圖 1：光激活FPS可以切換“開”藍色/紫色光譜光照射在熒光狀態(tài)從非熒光狀態(tài)。Photoconvertable的FPS是能夠改變他們的熒光發(fā)射光譜，從一個到另一個最大。這也被觸發(fā)，通過曝光與目標波長的光。可以切換光開關的FP“開和關”的兩個不同波長的光脈沖的幫助。該循環(huán)可以執(zhí)行至幾百倍。改變其發(fā)射光譜熒光計時器時間。在他們的幫助下，它是可能的關聯(lián)的蛋白質，例如年齡和蜂窩位置

Photoconvertible蛋白質

在光活化的蛋白相比，photoconvertible發(fā)出熒光的蛋白質已經在他們的非轉換的狀態(tài)。因此，它是更容易定義您的投資回報率。光電轉換被發(fā)現在石開腦珊瑚Trachyphyllia geoffroyi中。由于其排放的屬性，正在從綠色變?yōu)榧t色光轉化后用紫外光，熒光蛋白被命名為楓像日本槭樹的葉子[ 4 ]。秋天，他們把顏色從綠色變?yōu)榧t色。如果楓380和400納米之間的波長，其最大發(fā)射光轉換正在發(fā)生變化，從518納米到582納米。這顯示在綠色和紅色熒光的因素2,000之間的比例大幅改變。這種轉換是不可逆的。另一個限制因素是楓四聚體的性質，是什么使活細胞成像研究它，而沒有吸引力。

光轉化的基本過程又是一個光誘導過程。在這種情況下，內部的發(fā)色團（His61-Tyr63-Gly64）組氨酸殘基被裂解的照射，并最終導致一個形成一個高度共軛的雙咪唑環(huán)系統(tǒng)。這個過程被連接到紅色波長[ 2 ] 熒光移位。

一個紅色綠色兌換FP來自珊瑚Dendronephtytha SP。它的名字和紅色的激活屬性都反映表達將Dendra [ 5 ]。商業(yè)發(fā)展Dendra2是第一單體紅-綠色photoconvertible的蛋白質。

另一種廣泛使用的光學熒光筆tdEosFP [ 6 ]，主要是從Labophyllia hemprichii，石珊瑚隔離。串聯(lián)二聚體可以轉換從綠色到紅色熒光的近紫外線照射后，欣然用于超分辨率顯微鏡，什么是真正的單體版本MEOS mEos2個。

非常相似的特征Keadeàphotoconvertible的蛋白質被發(fā)現在第三個石珊瑚：法維亞瘌痢。近紫外線照射四聚體KikGR的后改變其熒光從綠色變?yōu)榧t色，但在一個更美好的方式比楓。其商業(yè)的變體被稱為Kikume，可以用750 nm波長的多光子激發(fā)的光轉換。類似這樣的，它可以被用來在厚的組織標本。突變導致KikGR單體形式mKikGR的。連同與mEos2 Dendra2它是一個經常使用的光學超分辨成像熒光筆。

光開關染料

而光敏化是一個不可逆轉的轉換，從一個非熒光狀態(tài)的熒光狀態(tài)，光開關蛋白能兩個條件之間的班車。不同波長的光脈沖，這些熒光蛋白的幫助，可以打開和關閉的幾百倍不漂白。熒光燈和暗態(tài)之間進行切換，這樣的現象，被稱為光致變色的，已經顯示了在單分子水平wtGFP，但一個非常低的延伸。

一個眾所周知的光開關的蛋白質，它是用來在超高分辨率顯微鏡，是來自于一個石珊瑚：Dronpa是單體，并在390 nm處的最大吸收波長為503納米，由于它的陰離子，去質子化的發(fā)色團，有小absoption最大由于它的中性，質子化的發(fā)色團。而陰離子形式在518 nm處具有最大發(fā)射，中性的形式描繪了一個非熒光狀態(tài)。此外，還有一個順式-反式異構化，質子化的發(fā)色團連接。的發(fā)色基團的中性態(tài)Tyr66的側鏈中的反式構型（第2圖）。在其陰離子國家Tyr66具有順式構象。有405nm照射后，被強制進入激光脈沖Dronpa的熒光順式構象。488 nm激光脈沖然后切換Dronpa的構象非熒光反狀態(tài)。該循環(huán)可以重復幾百次。

圖2：使用超高分辨率顯微鏡的光開關蛋白Dronpa的

四聚體蛋白在紅色區(qū)域的最大發(fā)射光開關Kindling FP（KFP1）。

最新努力創(chuàng)造新的光學熒光筆想出了這是一種蛋白質，光電轉換和光控相結合。IrisFP是一個wtEosFP的一個開和關的開關狀態(tài)，以及其綠色熒光紅色熒光構衍生。換句話說，照射高強度的405nm的激光束IrisFP后轉移從綠色到紅色的發(fā)光狀態(tài)。格林IrisFP的可以被關掉的幫助下為488 nm的激光。在405納米的低強度激光開關再次打開。紅IrisFP另一方面關閉用532 nm的激光的光，并且可以具有440 nm的激光再次接通。相鄰的建設單體形式mIrisFP的打開門為進一步的應用[ 3 ]。

熒光計時器

正在改變他們的發(fā)射光譜的時間被稱為熒光蛋白的熒光計時器。此行為是不pH值的變化，離子強度或蛋白質濃度的結果，但獨立于這些生化指標發(fā)生。換句話說有關的蛋白的年齡可以估算它的顏色。具有這些特征的，有可能測量在活細胞內的時間-時間取決于發(fā)生的事情- 。

在2000年，由實驗室的謝爾蓋·A.盧科亞諾夫第一熒光定時器描述。這種紅色熒光蛋白突變體命名為FT（熒光定時器）改變其發(fā)射光譜在18小時期間從紅色到綠色波長。由于這樣的事實，FT的四聚體Vladislav Verkhusha的看到有必要創(chuàng)造一個單體的。突變的mCherry導致3熒光定時器，具有不同的轉換時間。這些蛋白質被轉向快速，中速或慢速的時間尺度從藍色到紅色，但仍然太慢測量細胞在幾分鐘內發(fā)生的進程（S. 表1）。

然而，隨著熒光計時器的幫助下，它未能觀看蛋白在活細胞中，無論是在空間和時間分辨率的行為。例如，分化和細胞極化過程可以觀察到。此外，蛋白質運輸的事件或病毒裝配可以跟蹤或基因的活性可以被監(jiān)控。該應用程序列表中一定能進行擴展和顯示熒光定時器在未來的潛在用途

表1：螢光蛋白和熒光計時器

Exmax：最大激發(fā)，Emmax：最大發(fā)射，QY：量子產率，亮度計算量子產率和摩爾消光系數的乘積除以1,000