奧林巴斯顯微鏡：多光子熒光顯微鏡簡介

多光子熒光顯微鏡是一種強(qiáng)有力的研究工具，它結(jié)合了先進(jìn)的光學(xué)技術(shù)，長波長多光子激發(fā)激光掃描顯微鏡捕捉到高分辨率三維圖像高度特異性熒光標(biāo)記標(biāo)本。

該方法是特別有用的細(xì)胞生物學(xué)家的努力來研究活體細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)過程，而不會(huì)造成顯著，往往是致命的，損壞的標(biāo)本。雖然經(jīng)典的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡在生物系統(tǒng)中的生化事件通?？梢蕴峁﹣單⒚追直媛?，該技術(shù)是由引起的二次熒光位于焦平面上方和下方的整個(gè)區(qū)域的背景噪聲的靈敏度和空間分辨率的限制。

多光子顯微鏡的激發(fā)只發(fā)生在一個(gè)的衍射有限的顯微鏡的焦點(diǎn)，提供的能力，以獲得三維分辨率光學(xué)部分厚的生物標(biāo)本。個(gè)人光學(xué)部分獲得通過光柵掃描標(biāo)本在xy平面，一個(gè)完整的三維圖像是由連續(xù)掃描標(biāo)本在連續(xù)的Z位置。多光子熒光的焦點(diǎn)的位置，因?yàn)榭梢跃_地確定和控制，是非常有用的，用于探測(cè)下方的試樣表面的選定區(qū)域。的高度局部化的激發(fā)能量供應(yīng)，以盡量減少光漂白的熒光基團(tuán)連接到試樣，并降低光損傷，從而增加了細(xì)胞的活力和隨后的持續(xù)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，調(diào)查活細(xì)胞的性質(zhì)。此外，近紅外激發(fā)波長的應(yīng)用程序允許更深入地滲透到生物材料，并減少觀察在較短波長的光的散射程度高。這些優(yōu)勢(shì)使研究人員能夠厚的活組織樣本，如腦切片和發(fā)育中的胚胎，這將是困難的，如果不是不可能的，與其他光學(xué)技術(shù)的圖像進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在圖1所示的是一個(gè)典型的配置中使用的多光子熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)。顯微鏡是一種倒置式的儀表設(shè)計(jì)，觀察活細(xì)胞的組織培養(yǎng)和較厚的生物標(biāo)本沐浴在生理鹽水。對(duì)于常規(guī)的非熒光觀察，透射燈箱定位以上的階段，使標(biāo)本可視化，通過常規(guī)技術(shù)，如明場(chǎng)，微分干涉對(duì)比，相位相反，和Hoffman調(diào)制對(duì)比度。雖然沒有用的多光子應(yīng)用中，有35毫米照相機(jī)主體連接到該端口，在前面的圖1中所示的顯微鏡，采取與現(xiàn)有的照明來拍攝圖像的基礎(chǔ)上。顯微鏡主體的右側(cè)的Ti（鈦）：藍(lán)寶石模式鎖定脈沖激光系統(tǒng)，是由于多光子激發(fā)的峰值強(qiáng)度高，但較低的平均功率的優(yōu)選來源?？刂萍す馐峭ㄟ^位于頂部的激光柜，被接合到顯微鏡端口策略性地放置的中繼反射鏡的光波導(dǎo)或直接耦合或者通過光纖耦合的電子單元。在顯微鏡基地過濾光電倍增管檢測(cè)系統(tǒng)連接到另一個(gè)端口，是一個(gè)XY光柵掃描單元，可以迅速偏轉(zhuǎn)聚焦激光束在物鏡領(lǐng)域。隨附的計(jì)算機(jī)工作站，可以從光學(xué)部分組裝三維重建顯微鏡所收集的數(shù)字圖像處理和分析。

傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡困擾的二次熒光遠(yuǎn)離震源區(qū)，這有助于天賦和高背景噪聲信號(hào)發(fā)生，往往掩蓋了重要的標(biāo)本細(xì)節(jié)。共聚焦顯微鏡規(guī)避了這個(gè)問題，在很大程度上，通過針孔孔徑，產(chǎn)生?。ㄐ∮谝晃⒚祝?span style="font-family:Times New Roman">unblurred光學(xué)部分由深厚的標(biāo)本內(nèi)使用拒絕的焦點(diǎn)的背景熒光。多光子熒光顯微鏡的引入提供了一種新的替代共聚焦顯微鏡，可通過選擇性的激勵(lì)耦合到檢測(cè)范圍更廣泛的選擇。不同于傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡中，不需要圖1中的顯微鏡的針孔附近的探測(cè)器，發(fā)射的熒光信號(hào)顯著提高的效率達(dá)到三維歧視。在過去，所需的多光子激發(fā)的脈沖激光系統(tǒng)的高成本和復(fù)雜性的技術(shù)具有有限的使用，但最近推出的交鑰匙激光器和商用多光子系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多光子熒光顯微鏡的方法給出了很多調(diào)查。

雙光子和三光子激發(fā)

多光子激發(fā)的基本原則，首先描述由瑪麗亞G?ppert - 梅耶70多年前同時(shí)進(jìn)行她的博士論文研究，但假設(shè)不能被證實(shí)，直到脈沖紅寶石激光器的發(fā)明，大約30年后。在高光子密度，可以同時(shí)吸收兩個(gè)光子（介導(dǎo)的虛擬狀態(tài)）相結(jié)合，他們的精力去招惹電子躍遷到激發(fā)態(tài)的熒光。一個(gè)光子的能量是因?yàn)樗牟ㄩL成反比，兩個(gè)光子的波長大約兩倍所需的單光子激發(fā)。作為一個(gè)例子，兩個(gè)光子的波長640納米（紅色光）相結(jié)合，以激發(fā)紫外線吸收在320納米區(qū)域的熒光團(tuán)（紫外線），這將導(dǎo)致在較長的波長（藍(lán)色或綠色）的熒光發(fā)射二次。這種獨(dú)特的應(yīng)用裝置，較長的波長延伸到紅外區(qū)域，可以方便地利用激發(fā)單量子事件，隨后在較低的波長發(fā)射的二次輻射的發(fā)色團(tuán)。

每次激發(fā)事件的兩個(gè)光子的要求必須的速率常數(shù)，取決于激發(fā)光強(qiáng)度的平方。雖然光子不必是相同的波長，以引起多光子激發(fā)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)都設(shè)計(jì)有一個(gè)單一的激光源，所以兩個(gè)光子通常具有窄的波長分布的特定人群的成員。與單光子吸收的情況下，一個(gè)給定的熒光基團(tuán)，將同時(shí)吸收兩個(gè)光子的概率是入射光子的空間和時(shí)間之間的重疊的函數(shù)?；谶@樣的假設(shè)，每個(gè)熒光基團(tuán)暴露在相同的激光截面的計(jì)算表明，光子必須內(nèi)到達(dá)10（-18）秒（1 秒）阿托對(duì)方。這種重疊期間的時(shí)間尺度是一致的中間虛擬狀態(tài)的壽命（10（-17）秒或0.01 毫微微的第二個(gè)）。

光子密度高的多光子熒光是必要的，以確保有足夠的熒光團(tuán)的激發(fā)水平。事實(shí)上，光子的濃度必須是大約一百萬次，所需的相等數(shù)目的單光子的吸收。這是通過高功率鎖模脈沖激光器，脈沖峰值期間產(chǎn)生顯著的功率量，但具有足夠低，不損壞試樣的平均功率。簡短，但激烈，由激光器發(fā)射的脈沖增加平均在一個(gè)恒定的平均入射激光功率電平對(duì)于一個(gè)給定的熒光基團(tuán)的雙光子吸收的概率。最小的平均激勵(lì)功率電平降低的單光子吸收的量，這也發(fā)生在在激發(fā)過程中的試樣。這是單光子激發(fā)事件而導(dǎo)致的加熱和一些熒光實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)生的光損傷的大多數(shù)。

典型的脈沖激光配置采用短的工作周期大約100飛秒（10 E（-13）秒），重復(fù)頻率為80?100兆赫的多光子熒光實(shí)驗(yàn)。此機(jī)制允許令人滿意的圖像采集沒有過量的熱和光損傷試樣。為每個(gè)脈沖的時(shí)間刻度，而通常被稱為“超短”，仍然是4至5個(gè)數(shù)量級(jí)不再比雙光子吸收的反應(yīng)時(shí)間。單重態(tài)激發(fā)的雙光子脈沖的發(fā)色團(tuán)的人口是在傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)或共聚焦熒光顯微鏡得到的相同。因此，二次雙光子激發(fā)后的熒光發(fā)射單光子的實(shí)驗(yàn)中觀察到的沒有區(qū)別。甲熒光基團(tuán)，例如羅丹明，將二次熒光排放相同的寬波長范圍內(nèi)，不管它是否被激發(fā)的一個(gè)單一或雙光子激發(fā)事件。

三光子激發(fā)是將關(guān)聯(lián)的非線性光學(xué)吸收的事件，可以發(fā)生類似的雙光子激發(fā)的方式。所不同的是，三光子必須與非法過渡到激發(fā)單重態(tài)的熒光團(tuán)同時(shí)交互的。三光子激發(fā)的一個(gè)好處是，成功的吸收只需要一個(gè)更大的10倍的濃度比雙光子吸收的光子，使得這種技術(shù)有吸引力的一些實(shí)驗(yàn)。三光子激發(fā)能增強(qiáng)z軸的分辨率更大程度比雙光子吸收。這是由于同時(shí)有三個(gè)單個(gè)光子的相互作用的要求造成的熒光團(tuán)激發(fā)到一個(gè)較小的橫截面。在實(shí)踐中，發(fā)出紅外光的激光，中心在1050納米的波長分布能夠激發(fā)熒光，吸收在紫外區(qū)（約350納米的激發(fā)波長的三分之一）。相同的激光可同時(shí)激發(fā)另一個(gè)熒光基團(tuán)的一半的波長（525納米），在雙標(biāo)記的生物實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)有用的組合。

通過利用較短的近紅外波長（720納米），三光子熒光可以延長進(jìn)深紫外線的有用的熒光成像范圍。激光波長在900到700納米范圍內(nèi)將激發(fā)熒光基團(tuán)吸收在240至300納米的地區(qū)，這是幾乎無法使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡。用玻璃制造的熒光物鏡具有非常低的傳輸波長300納米以下，但波長較長的紅外激光輻射可以很容易地通過三光子激發(fā)。

一個(gè)共同的芳族氨基酸，色氨酸，單，雙和三光子激發(fā)，在圖3中示意性地示出的。4.5電子伏特單光子電子躍遷激發(fā)色氨酸在280納米與隨后的二次熒光發(fā)射在348納米的紫外區(qū)域。激發(fā)的雙光子的機(jī)制是通過在580納米為中心的黃綠色的光，而三光子激發(fā)時(shí)，會(huì)發(fā)生在近紅外區(qū)域中的氨基酸與840納米的輻射照射。轉(zhuǎn)換雅布隆斯基圖中（圖3），該虛擬的狀態(tài)表示由雙光子激發(fā)和三光子激發(fā)了球體的球體。色氨酸具有更強(qiáng)的熒光具有更高的量子產(chǎn)率比其它芳族氨基酸，并且在大多數(shù)蛋白質(zhì)只少量存在。這些屬性應(yīng)該多光子顯微鏡調(diào)查一個(gè)極好的工具，使用自體熒光色氨酸殘基。即使高階非線性現(xiàn)象是可能的，包括四光子激發(fā)，但這些還沒有被應(yīng)用到生物學(xué)研究。

雙光子熒光顯微鏡

本地化激發(fā)該地區(qū)周圍多光子顯微鏡的焦點(diǎn)，原因是它在這里，的光子密度最高的。這種優(yōu)勢(shì)從基本的物理原理，由熒光基團(tuán)的雙光子吸收激發(fā)光強(qiáng)度的平方的函數(shù)的產(chǎn)生。當(dāng)從一個(gè)脈沖激光源的光子聚焦高數(shù)值孔徑的物鏡，他們變得更加擁擠，從而增加了兩個(gè)或更多個(gè)同時(shí)與一個(gè)單一的熒光基團(tuán)相互作用的概率。光子顯微鏡焦點(diǎn)集中如此多光子吸收的關(guān)鍵，這是唯一的區(qū)域發(fā)生明顯的激發(fā)。的概念，分別在圖2和4，說明宏觀和微觀水平上的多光子激發(fā)。圖2示出了夸張的視圖的顯微鏡的物鏡的位置的圖像培養(yǎng)的細(xì)胞在顯微鏡載玻片和蓋玻片。紅色激光脈沖穿過的縱向軸線的物鏡集中，集中到該圖的中心部分中的單元格。

在圖4中，光子與熒光團(tuán)的擁擠和互動(dòng)表現(xiàn)在顯微鏡焦點(diǎn)。作為紅色激光通脈沖通過含有熒光基團(tuán)的試樣（表示為球體的線性三重峰），激發(fā)的概率隨著脈沖達(dá)到的物鏡的焦點(diǎn)。被表示為單個(gè)光子漫紅線定義的激光脈沖的邊界分隔成合。一小群被激發(fā)震源區(qū)的中心定位在圖4中的熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)光子，并表現(xiàn)出綠色熒光二次。焦平面以外的發(fā)色團(tuán)會(huì)吸收兩個(gè)光子的概率幾乎是零，因?yàn)楣庾拥拿芏炔粔蚋?，在這一地區(qū)。

雙光子激發(fā)的現(xiàn)象是可能的，這不僅是因?yàn)樵陲@微鏡焦點(diǎn)附近的熒光基團(tuán)的空間，而且還因?yàn)榘谶B續(xù)的激光脈沖的光子的時(shí)間重疊。如上文所述，發(fā)生雙光子吸收激發(fā)能量在由激光源產(chǎn)生的光子的強(qiáng)度的平方成比例。脈沖激光束的強(qiáng)度下降的焦平面的距離的平方，所以焦區(qū)附近的任何地方熒光團(tuán)的激發(fā)概率降低的熒光團(tuán)的焦平面的距離的四次方。脈沖激光照明錐的尺寸由物鏡的數(shù)值孔徑。因此，電子束強(qiáng)度降低相差的焦點(diǎn)激勵(lì)光錐的直徑的平方成正比。，作為照明錐し上方和下方的聚焦點(diǎn)，熒光團(tuán)的激發(fā)概率隨著錐體直徑的四次方。出于這個(gè)原因，熒光團(tuán)激發(fā)只限于立即周邊地區(qū)的焦點(diǎn)，它代表了整個(gè)樣品只有一個(gè)非常薄的光學(xué)部分。

超短激光脈沖持續(xù)時(shí)間，其測(cè)量范圍通常從約100飛秒，1皮秒（10 E（-13）10 E（-12）秒），被認(rèn)為是在宏觀方面。然而，在吸收光子事件的時(shí)間尺度（飛秒約千分之一）的脈沖實(shí)際上是相當(dāng)長的持續(xù)時(shí)間。這限制了熒光飽和度，并允許分子足夠的時(shí)間之前返回到基態(tài)脈沖之間激發(fā)新一輪的發(fā)生。脈沖重復(fù)率范圍從大約80至120兆赫（MHz），它提供了激發(fā)瞬間峰值功率高，停留時(shí)間平均為10納秒。因?yàn)橐粋€(gè)典型的熒光的熒光壽命僅持續(xù)幾納秒，人口激分子有足夠的時(shí)間來放松脈沖之間。相對(duì)短的脈沖的占空比（脈沖持續(xù)時(shí)間脈沖之間的時(shí)間）除以平均輸入激光功率限制為小于10 mW，值僅稍大，常規(guī)的激光掃描共聚焦顯微鏡的。

雙光子激發(fā)焦平面附近的區(qū)域的限制提供了一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)超過共聚焦顯微鏡的多光子。熒光共聚焦顯微鏡的試樣在整個(gè)被激發(fā)，而是由檢測(cè)器所收集的次級(jí)熒光共焦針孔限制物鏡焦平面。這供應(yīng)量減少背景噪音或添加背景噪聲的數(shù)據(jù)從其他焦平面的熒光。與此相反，產(chǎn)生多光子顯微鏡熒光激發(fā)（其后，熒光發(fā)射）只在焦平面，消除背景信號(hào)和共焦針孔的必要性。如圖5所示，每個(gè)技術(shù)檢討漂白型材共聚焦和多光子顯微鏡的激勵(lì)模式之間的顯著差異。

如圖5所示，光模式，從發(fā)生反復(fù)掃描一個(gè)單一的xy平面在福爾瓦的聚合物薄膜與熒光羅丹明（綠色染色）染色的XZ。在左側(cè)（圖圖5（a）），通過掃描彩色膜，用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生的檔案。在掃描的中心的白色矩形表示的焦平面上，通過針孔，由檢測(cè)器成像。對(duì)角線突出的矩形的上部和下部的角落的藍(lán)線代表由激發(fā)光光束透過薄膜的光的路徑。隨著電子束在光柵掃描的薄膜，熒光染料是激發(fā)和熒光發(fā)射二次。最終，光漂白時(shí)，在焦區(qū)的暗區(qū)所表示的。在掃描共聚焦顯微鏡（圖圖5（a））的膜中，集成的激發(fā)幾乎等于整個(gè)激發(fā)路徑，上方和下方的焦平面上幾乎相等。相反，在xz重復(fù)掃描激發(fā)輪廓產(chǎn)生的多光子顯微鏡限制激發(fā)光漂白的焦平面上（圖5（b）條）。類似于在圖5（a）的情況下，對(duì)角的焦平面發(fā)出的藍(lán)線劃定所采取的路徑由激發(fā)光到達(dá)焦平面。

來自本地化激發(fā)多光子顯微鏡帶來一些優(yōu)勢(shì)。也許最重要的是，可以實(shí)現(xiàn)與該技術(shù)中，這是相同的一個(gè)理想的共聚焦顯微鏡獲得的三維分辨率的高度。此外，由于缺乏以外的焦平面位置的熒光團(tuán)的吸收，使更多的激發(fā)光的穿透試樣，達(dá)到對(duì)焦平面。其結(jié)果是顯著增加的能力，聚焦束的穿透深度內(nèi)的試樣中，頻繁的深度的范圍可以用激光共聚焦顯微鏡觀察到的兩到三倍之間。

正如前面所討論的，沿著光軸（z方向）的距離的四次方焦點(diǎn)區(qū)域以外的多光子吸收的概率下降。當(dāng)與高數(shù)值孔徑的物鏡（1.4）進(jìn)行多光子激發(fā)的熒光基團(tuán)的均勻分布，約80％的吸收發(fā)生在一個(gè)嚴(yán)格定義的空間被稱為焦距的體積。本卷的尺寸依賴于物鏡的數(shù)值孔徑，但對(duì)于一個(gè)典型的的大光圈熒光在近紅外波長的目的，這被定義為一個(gè)具有橫向尺寸為0.3微米，直徑1微米的軸向長度的橢球區(qū)域。

漂白量的顯著減少（和相關(guān)的光損傷的細(xì)胞和組織）示于圖5（b）對(duì)于多光子顯微鏡基本上小于發(fā)生用激光共聚焦顯微鏡。漂白和光損傷的兩種熒光顯微鏡在研究中的活細(xì)胞，組織，和其他生物的最重要的限制。熒光的激發(fā)導(dǎo)致促進(jìn)基態(tài)的電子激發(fā)單能量狀態(tài)。從激發(fā)態(tài)的振動(dòng)弛豫過程中，有一個(gè)概率會(huì)發(fā)生系間竄越到三重態(tài)而不是典型的衰減的單峰態(tài)。三重態(tài)反應(yīng)和相對(duì)長的壽命，它允許在此條件下的時(shí)間的熒光基團(tuán)反應(yīng)的活細(xì)胞或經(jīng)過非熒光物種的分子變性或重排。此外，在三重態(tài)的激發(fā)熒光團(tuán)可以產(chǎn)生單線態(tài)氧，這將相鄰的生物分子上的官能團(tuán)與各種反應(yīng)。必須激發(fā)光穿透標(biāo)本焦平面上的焦點(diǎn)，大部分這種光過去的重點(diǎn)地區(qū)繼續(xù)傳播相當(dāng)遠(yuǎn)的距離。因此，人口穿過波束路徑的激發(fā)的熒光基團(tuán)，為的是可在寬視場(chǎng)和激光共聚焦顯微鏡的情況下，將進(jìn)行了相當(dāng)數(shù)量的光，并產(chǎn)生細(xì)胞和組織損傷，可避免與多光子技術(shù)。

雖然暴露于光誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的確切機(jī)制了解甚少，已確定，光損傷降低將顯著擴(kuò)展的可行性研究的生物樣品的熒光顯微鏡。暴露于長波長的可見光和近紅外光不影響細(xì)胞生存力，因此它很可能是與多光子顯微鏡的損害的大多數(shù)來自激發(fā)和被限制到焦平面。

多光子顯微鏡探測(cè)器

在多光子顯微鏡，通過二次熒光發(fā)射的光子的來源幾乎完全從物鏡焦平面，消除退掃描檢測(cè)的要求，并允許更靈活的檢測(cè)幾何。這種增加的通用性，可能會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)大的改進(jìn)相比，激光共聚焦顯微鏡，熒光檢測(cè)效率。退掃描檢測(cè)在一個(gè)系統(tǒng)中，由物鏡收集的光反射到檢測(cè)器通過針孔之前，一系列的掃描反射鏡的表面的。共焦針孔的產(chǎn)生，同時(shí)提高圖像的分辨率，探測(cè)效率的下降幅度大時(shí)，必須采取的試樣的較長的曝光入射照明，光損傷的概率增加，光漂白。

在某些情況下，它可能是可取申請(qǐng)修改的多光子成像的共焦檢測(cè)技術(shù)（圖7）。入侵的室內(nèi)光線下，可以排除通過使用一個(gè)大的共焦針孔，它可以產(chǎn)生橫向分辨率信號(hào)收集效率的成本略有增加。針孔也可以與小的入口孔，例如雪崩光電二極管或光電光譜儀檢測(cè)器的利用率。利用多光子成像針孔，應(yīng)仔細(xì)檢查后方能實(shí)施。由樣品發(fā)出的光，可以向圖像形成的大部分將被阻塞的針孔。這既包括光散焦平面光源于重點(diǎn)區(qū)域界限內(nèi)的位置。出于同樣的原因，也將是一個(gè)減少的量的熒光收集從試樣深處。事實(shí)上，當(dāng)采用共聚焦針孔孔徑，增加試樣深處的信號(hào)衰減將是類似的多光子共聚焦成像。

幾種檢測(cè)圖案都在圖7中，示出了使用光電倍增管（光電倍增管），CCD圖像陣列檢測(cè)器和非光學(xué)檢測(cè)收集的熒光信息。光電倍增管檢測(cè)器給出在多光子熒光顯微鏡，有效地與這些設(shè)備可以被捕獲，因?yàn)榘l(fā)射波長較短（紫外線和低波長的可見光）。在圖7中的光電倍增管檢測(cè)器的各種標(biāo)量之間的主要區(qū)別是是否發(fā)射的熒光被傳遞回通過掃描鏡（退掃描檢測(cè)）或通過中繼傳輸透鏡放置在一個(gè)平面上的共軛物鏡后孔徑檢測(cè)器（光電倍增管）。第三個(gè)光電倍增管（標(biāo)有外部檢測(cè)器）所示的位置到右下的試樣，是用來捕捉從檢體不通過顯微鏡光學(xué)列車的任何部分的情況下，熒光直接。

由于這一事實(shí)，分辨率定義為在多光子激發(fā)過程中，由激發(fā)的熒光基團(tuán)發(fā)出的光可以被收集，而不使用物鏡。事實(shí)上，高數(shù)值孔徑的聚光鏡將足以應(yīng)付累積二次熒光發(fā)射檢測(cè)器的目的。在某些情況下，光檢測(cè)器被放置高于（或低于，這取決于顯微鏡配置）試樣的區(qū)域中，從光學(xué)顯微鏡（圖7）中刪除。這種檢測(cè)方案，使短波發(fā)射，可能會(huì)受到影響，或因低傳輸通過物鏡的利用率。另一種策略是直接從附近的二色性反射鏡的反射光從通過轉(zhuǎn)換透鏡的后孔徑下的檢測(cè)器（如光電倍增管的整個(gè)區(qū)域，如上所述）中的物鏡收集排放。甲較短的排放路徑有利于收集光子的數(shù)目，特別是當(dāng)通過沐浴在鹽水中的10到20微米的組織成像。雖然后一種方法中，可以采用熒光檢測(cè)效率最大化，它往往是容易污染室內(nèi)光。

如電荷耦合器件（CCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）探測(cè)器，光電二極管陣列，也可以被用來收集在多光子的實(shí)驗(yàn)中（圖7）的熒光信息。在此配置中，由樣品發(fā)出的光被再次反射的分色鏡，并直接成像到光電二極管陣列的表面，這是放置在一個(gè)平面上共軛的中間像平面。因?yàn)榉直媛视砂l(fā)射波長比激發(fā)波長較短，通?？梢允褂眠@種技術(shù)獲得的橫向分辨率的改善。

幾個(gè)非光學(xué)檢測(cè)方案有可能被應(yīng)用到多光子顯微鏡，由于在激發(fā)過程中的高度的空間定位。其中，光電聲檢測(cè)，用來測(cè)量少量吸收，光化學(xué)掃描檢測(cè)，產(chǎn)生離子電流電壓鉗位細(xì)胞的受體分布的圖像。

在多光子顯微鏡的分辨率

多光子顯微鏡的分辨率不超過，實(shí)現(xiàn)了用激光共聚焦顯微鏡，事實(shí)上，利用較長的波長（紅色到近紅外，700?1200納米）的結(jié)果，在一個(gè)較大的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的多光子激發(fā)。這轉(zhuǎn)化為橫向和軸向分辨率稍微降低。例如，使用的激發(fā)波長為700納米和130的數(shù)值孔徑的物鏡，所觀察到的橫向分辨率是約0.2微米與相應(yīng)的軸向分辨率為0.6微米。當(dāng)耦合到斯托克的偏移大小，這些值的范圍可以高達(dá)30％，大于在相同的條件下與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡觀察到的分辨率。在實(shí)踐中，共聚焦分辨率有限針孔孔徑，色差，以及不完全對(duì)應(yīng)的光學(xué)系統(tǒng)，所有這些都有助于減少共焦和多光子顯微鏡的分辨率的差異可能會(huì)降低。從這次討論中，很明顯，如果結(jié)構(gòu)沒有得到充分解決，激光共聚焦顯微鏡，他們將不加價(jià)任何好轉(zhuǎn)（可能會(huì)加重病情）成像時(shí)多光子激發(fā)。

收集數(shù)字圖像或三維空間分辨率的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)，它是必不可少的區(qū)分的焦點(diǎn)，在后臺(tái)的體積內(nèi)的熒光發(fā)射發(fā)生。兩個(gè)信號(hào)之間的分化可以通過工具（用共焦或者多光子儀器）或通過反卷積的三維數(shù)據(jù)集。的能力區(qū)分的焦平面和背景熒光的熒光發(fā)射信號(hào)背景比（S / B），其中，S的焦平面和乙收集的光子的數(shù)量或強(qiáng)度被定義為代表光子從背景（聚焦平面）。在激光共聚焦掃描顯微鏡，高S / B比值抑制背景信號(hào)所產(chǎn)生的共焦針孔。然而，在多光子激發(fā)，S / B比本質(zhì)上是大的，因?yàn)楹苌儆屑ぐl(fā)焦平面之外。多光子和激光共聚焦技術(shù)的分辨率之間的計(jì)算，可以比執(zhí)行聚焦計(jì)算時(shí)考慮一個(gè)無限小的針孔。對(duì)于這兩種技術(shù)中，通常是幾個(gè)數(shù)量級(jí)大于經(jīng)典的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡的信號(hào)背景比。

還有一點(diǎn)要考慮的是，可以利用多光子激發(fā)熒光團(tuán)在低波長紫外區(qū)的吸收轉(zhuǎn)換。因?yàn)榈陀诩s340納米的光激發(fā)熒光基團(tuán)的能力是有限的共聚焦顯微鏡，研究者往往利用探針具有更長的波長，用相對(duì)較低的分辨率。在危急情況下，在多光子顯微鏡的分辨率可以提高，并且還通過利用諸如CCD的光電二極管陣列掃描影像中的平面下的空間分辨的檢測(cè)系統(tǒng)通過限制通過共焦針孔的成像波長。

激發(fā)特性的熒光基團(tuán)

熒光小分子多光子實(shí)驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)行的用于單光子調(diào)查的相同標(biāo)準(zhǔn)來檢驗(yàn)。探針應(yīng)具有方便的波長，高的量子產(chǎn)率，低的光漂白率，和可能的最低程度的化學(xué)和光化學(xué)毒性大的吸收截面。熒光團(tuán)也應(yīng)該是無顯著退化，從所述激光源，能夠承受高強(qiáng)度的照明。在大多數(shù)情況下，研究者已經(jīng)利用相同的公共熒光基團(tuán)的雙光子作為標(biāo)記在寬視場(chǎng)和激光共聚焦熒光顯微鏡，可廣泛用于實(shí)驗(yàn)。

常見的熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的激勵(lì)模式和入射的光子的波長的函數(shù)。由于這種相依性，雙光子吸收光譜可以（而且常常）從相應(yīng)的單光子光譜顯著不同。在實(shí)驗(yàn)中，大部分已審查的熒光基團(tuán)，能夠以兩倍于單光子的最大吸收波長的吸收雙光子激發(fā)。盡管如此，沒有根本的定量預(yù)測(cè)檢查單光子的截面簡單地通過一個(gè)復(fù)雜的熒光基團(tuán)的雙光子激發(fā)光譜的基礎(chǔ)。高度共軛的非對(duì)稱的分子，這是經(jīng)常被剝削分子光譜激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)提供信息的單一和雙光子激發(fā)光譜之間往往存在顯著差異。一個(gè)很好的例子是芳香氨基酸衍生物酪氨酸和苯丙氨酸，其復(fù)雜的雙光子截面顯示單光子激發(fā)有很大的不同。與此相反，色氨酸（圖2）的雙光子光譜非常相似，顯示單光子激發(fā)的檔案。

定量三維重建的和去卷積實(shí)驗(yàn)，光譜的熒光基團(tuán)的雙光子吸收進(jìn)行測(cè)量，以確保激發(fā)波長附近的吸收帶中的峰為中心。盡管雙光子的橫截面可以計(jì)算出，這個(gè)過程是復(fù)雜的最好的。直接的實(shí)驗(yàn)測(cè)量的吸收光譜是優(yōu)選的方法，但是這些實(shí)驗(yàn)是困難的，因?yàn)樯倭康娜肷涔β逝c在光源的強(qiáng)度波動(dòng)吸收。熱透鏡效應(yīng)，聲光技術(shù)已被用來確定吸收截面，但也許是一個(gè)簡單的方法，是研究光子發(fā)射與已知的量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)。當(dāng)設(shè)計(jì)新的雙光子實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)檢查的范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)的二分之一的值，預(yù)期的激發(fā)波長附近具有吸收峰的。

圖7給出了測(cè)得的雙光子熒光激發(fā)光譜特性的一些常見的熒光基團(tuán)。圖7中的數(shù)據(jù)代表的雙光子的動(dòng)作，這是來自通過服用該產(chǎn)品的熒光發(fā)射量子效率和雙光子吸收截面的橫截面。記錄，可利用由鎖模鈦：藍(lán)寶石激光器射出的直線偏振光的光譜。黑點(diǎn)表示在每個(gè)光譜中，熒光基團(tuán)的單光子的最大吸收的波長的兩倍。表1中是一個(gè)關(guān)鍵的兩個(gè)字母的名稱的代碼，在圖7中每個(gè)頻譜旁。曲線代表的熒光基團(tuán)的雙光子激發(fā)光譜的橫截面。

熒光小分子的雙光子熒光激發(fā)譜

表1

橫截面的測(cè)量表明，雙光子吸收的激發(fā)峰是非常類似的，相對(duì)于單光子的檔案中（圖7）或藍(lán)移的趨勢(shì)?？赡苁怯欣鸟詈峡捎面i模激光器的波長范圍內(nèi)的熒光團(tuán)激發(fā)的平均波長較短的。雙光子吸收光譜的另一個(gè)方面一致的是，他們通常更廣泛的比單光子。這簡化了實(shí)驗(yàn)的約束通過增加適合激發(fā)的和增強(qiáng)的能力，同時(shí)激發(fā)兩個(gè)熒光基團(tuán)，有重疊的雙光子的橫截面，但廣泛分離單光子光譜的波長范圍內(nèi)。三光子橫截面的測(cè)量表明它們是在一般情況下，相應(yīng)的單光子光譜非常相似。

雖然吸收光譜往往不同于單光子和雙光子激發(fā)的熒光特性，以及其他如壽命，發(fā)射波長，和系間竄越速率似乎并沒有受到影響。表示線性或非線性吸收達(dá)到相同的熒光激發(fā)態(tài)，并且一旦被激發(fā)的熒光基團(tuán)，它的行為激勵(lì)模式一樣的，不管這樣的相似性。這些租戶還持有三光子激發(fā)，讓研究者利用既定的比例和光譜方法在大多數(shù)的多光子實(shí)驗(yàn)。

照片和熱損傷的多光子激發(fā)

所有形式的熒光顯微鏡遭受光損傷活細(xì)胞，其程度是依賴于激發(fā)波長，曝光長度，和用作蜂窩探針的熒光基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)。激發(fā)照明的損傷，可以劃分為兩大類：由于化學(xué)反應(yīng)的熱破壞和退化。光化學(xué)的副作用引起的生化反應(yīng)，作為熒光團(tuán)激發(fā)的結(jié)果，沒有得到很好的理解，細(xì)胞和組織類型之間差異很大。另一方面，產(chǎn)生的熱損傷，主要的兩種機(jī)制，因?yàn)榻柚驮谠诮箙^(qū)的熒光基團(tuán)的雙光子吸收的單光子吸收發(fā)生。

在大多數(shù)研究的細(xì)胞（特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中），幾乎不存在固有的熒光基團(tuán)，利用多光子熒光吸收長波長的近紅外激發(fā)輻射。然而，周圍的細(xì)胞和組織中的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的水能夠吸收紅外和近紅外照明的顯著量的，產(chǎn)生多余的熱量，有可能損害生物標(biāo)本的可行性。另一方面，當(dāng)含水的生物環(huán)境照明的可見光和紫外光的波長較短的共聚焦和寬視場(chǎng)熒光顯微鏡，顯著量的熱利用周圍的水不被吸收。

的暖氣由于單光子吸收，可水沿束路徑的上方和下方的焦平面發(fā)生?？刂破骄亩鄺l件下，已計(jì)算引起的溫度上升，分別在700和1000納米，介于0.065和1.1攝氏度。這些協(xié)議在1064納米光鑷激光激發(fā)的熱量進(jìn)行測(cè)量計(jì)算。激動(dòng)人心的光束被固定的情況下，可能會(huì)發(fā)生更大的加熱，隨著時(shí)間的推移對(duì)數(shù)關(guān)系在迅速上升。暖氣，由于熒光吸收高度本地化的多光子激發(fā)實(shí)驗(yàn)的震源區(qū)。隨后的熱釋放內(nèi)均勻發(fā)生一個(gè)球?qū)ΨQ周邊地區(qū)的焦點(diǎn)體積，并沒有產(chǎn)生顯著的熱量，即使是在高濃度的熒光。

結(jié)論

多光子熒光顯微鏡是變給出一種方法，用于活細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)成像。該技術(shù)是特別有用的紫外線激發(fā)不會(huì)以其他方式是可能的，因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的光透射特性的生物系統(tǒng)。此外，在多光子激發(fā)的副作用，如漂白和光損傷最小化，并且只發(fā)生在立即周邊地區(qū)的焦點(diǎn)體積。雖然預(yù)測(cè)和測(cè)量雙光子吸收型材共同熒光正在慢慢地實(shí)現(xiàn)，這方面工作的一個(gè)顯著量的留下來完成的。設(shè)計(jì)新的針對(duì)多光子激發(fā)熒光團(tuán)仍然處于萌芽階段，但應(yīng)該沿著這條大道預(yù)計(jì)在未來幾年取得了一些進(jìn)展。

光毒性的細(xì)胞是一個(gè)知之甚少的現(xiàn)象，但不發(fā)生很大程度在大多數(shù)形式的熒光顯微鏡。較低的量子能量和較低的本征吸收較長的波長，利用多光子顯微鏡有助于減少光的有害影響活細(xì)胞和組織，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)開放的大門，新的調(diào)查。多光子顯微鏡研究中的一個(gè)主要障礙是設(shè)備成本高，尤其是必要的鎖模脈沖激光雙光子和三光子激發(fā)所需要的系統(tǒng)。超快激光系統(tǒng)普遍使用的兩種主要類型是鈦：藍(lán)寶石和Nd：YLF激光器，這雖然是非常昂貴的，并不需要水冷卻，也沒有過多的電力需求。在Ti：藍(lán)寶石脈沖激光（700至1100納米）的波長可調(diào)諧性，使其更為靈活比單波長的Nd：YLF激光器（1047納米），但方便排除手動(dòng)操作的總的可調(diào)諧性。隨著新的，更便宜，用戶友好的激光引入一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)激烈的市場(chǎng)，更多的商業(yè)的多光子顯微鏡系統(tǒng)將推出一個(gè)更便宜的價(jià)格。這種情況，再加上多光子熒光的實(shí)施，有沒有物理限制的事實(shí)，將鼓勵(lì)整個(gè)生物科學(xué)的廣泛應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)。