徠卡顯微鏡：全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）

全內(nèi)反射熒光（TIRF）是一種特殊的技術(shù)，在20世紀80年代初在安阿伯市密歇根大學(xué)的丹尼爾·阿克塞爾羅德在熒光顯微鏡。全內(nèi)反射熒光顯微鏡提供的圖像具有出色的高軸向分辨率低于100納米。這允許與膜相關(guān)的過程的觀察。

全內(nèi)反射熒光顯微鏡

它允許靠近的玻璃/水（或玻璃/試樣）接口的熒光分子成像。這是通過采用的漸逝波通過交付的弧光燈，發(fā)光二極管（LED）或激光的光激發(fā)的熒光基團，而不是直接照明。如果入射的光被全反射的兩個具有不同折射率的透明介質(zhì)的界面處發(fā)生的漸逝場。在生物應(yīng)用中的入射光通常是激光和接口的玻璃蓋玻片，蓋玻片和貼壁細胞的膜之間的水溶液。

隨著能量的漸逝場到界面的距離呈指數(shù)下降，只有在一定的接近蓋玻片的熒光基團被激發(fā)。這允許創(chuàng)建的圖像具有出色的信號噪聲比，其余的細胞的熒光團幾乎興奮。此外，全內(nèi)反射熒光顯微鏡提供的極高的軸向分辨率低于100納米的圖像。這使得觀察膜相關(guān)的過程，如細胞粘附，激素結(jié)合，分子運輸和胞吐（如神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和吸收）和內(nèi)吞過程。

圖 1：TIRF顯微鏡的原理

全內(nèi)反射和漸逝場

每當光遇到兩個具有不同折射率的透明介質(zhì)的接口，這將是部分衍射和部分地反射。的入射角一定的角度，即所謂的臨界角，將被完全反射的光，這種現(xiàn)象被稱為發(fā)生全內(nèi)反射。如果光從更高的折射率（n）的（如玻璃皿中，n = 1.52），在培養(yǎng)基中具有較低的折射率（例如，水性介質(zhì)中，n = 1.33）中的培養(yǎng)基中，才能觀察到全內(nèi)反射。的入射光，在發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角（Θ ?），可以由斯涅耳定律：

n1和n2是試樣的折射率和蓋玻片。

在發(fā)生全內(nèi)反射，一部分的入射光的能量將被轉(zhuǎn)換成一個電磁場，并通過接口形成的界面處的漸逝波。新興的倏逝波具有相同的頻率為入射光和其振幅呈指數(shù)衰減的穿透深度。因此，內(nèi)的倏逝波的激發(fā)的熒光團與光子的相互作用，但與電磁場的相互作用。在此字段中的穿透深度范圍通常在60?100納米，但可以去到200nm。它依賴于光的入射角，波長和兩種介質(zhì)的折射率（例如玻璃蓋玻片和試樣）的角度。增加導(dǎo)致減少的穿透深度和較高的波長的入射光的光的入射的角度，導(dǎo)致增加的穿透深度。背后的接口的介質(zhì)的折射率（例如，試樣）的穿透深度的影響也有更高的折射率增加的倏逝波的穿透深度。還應(yīng)當指出，在TIRF顯微鏡高功率的激光，這是比通常采用的激光共聚焦系統(tǒng)中，是用來形成有足夠能量的倏逝波強。

物鏡的全內(nèi)反射熒光顯微鏡

在光學(xué)實現(xiàn)全內(nèi)反射的方法有兩種：一種是基于棱鏡和其他基于物鏡。基于棱鏡的全內(nèi)反射熒光顯微鏡，棱鏡連接到蓋玻片的表面，該表面定向聚焦光束或激光朝向的蓋玻片/介質(zhì)界面。隨著棱鏡的幫助下，穿透光的角度被調(diào)整到臨界角。

現(xiàn)代全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)通常是基于物鏡的。的光，通常激光的光被定向到的標本，也收集所發(fā)射的熒光通過物鏡。它是強制性的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的物鏡具有一個非常高的數(shù)值孔徑（NA）（> 1.45 NA），它允許的入射角大于臨界角的。物鏡的數(shù)值孔徑（NA）越高，未能穿透深度越低的漸逝場的光的入射的角度，可以更加平坦。的棱鏡型方法相比，物鏡的方法是更方便的使用試樣以及訪問，能夠容易地改變激光光的入射的角度。通過放置在激光光斑的物鏡的后焦面的不同區(qū)域中，用戶可以選擇的激光的入射的角度，并因此而改變的倏逝波的穿透深度。在基于棱鏡的全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)的棱鏡強烈限制了訪問的試樣，難以例如變介質(zhì)，添加藥物或進行生理測量。

此外，對應(yīng)的激光，并使用不同的角度入射在棱鏡系統(tǒng)要復(fù)雜得多。此外，激光TIRF系統(tǒng)基于棱鏡中出現(xiàn)的安全問題克服物鏡為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。棱鏡為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中，同時激光更多或更少的公開引導(dǎo)到棱鏡物鏡為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中，激光被直接耦合到顯微鏡本身和退出的物鏡在一個非常定義的方式。

全內(nèi)反射在生物設(shè)置

正如上文所述，全內(nèi)反射熒光顯微鏡的物鏡具有高數(shù)值孔徑（> 1.45 NA），這只能通過使用浸油或其他特殊的液浸介質(zhì)實現(xiàn)。在典型的生物設(shè)置，用于生產(chǎn)的瞬逝波的激光的光，有通過的物鏡，液浸介質(zhì)中和要在蓋玻片/水（例如，水林格的溶液，PBS或其他成像緩沖液）界面反射的蓋玻片。為了避免反射和偏轉(zhuǎn)的影響，浸沒介質(zhì)的折射率盡可能接近的蓋玻片（通常為N = 1.52）。對于標準的浸泡油的折射率為n = 1.515 - 1.518在20°C 當然，浸沒介質(zhì)的折射率是溫度依賴的。盡可能多的實驗，特別是在活細胞成像，在37℃下進行，由溫度引起的變化的折射率的液浸介質(zhì)可能發(fā)生。要糾正這些變化，很多都配備了全內(nèi)反射熒光顯微鏡物鏡校正領(lǐng)。

圖 2：廣角的的布雷斯特癌腫瘤細胞表達GFP標記的細胞粘附分子在細胞膜上表達的CD44的熒光圖像。

圖 3：同樣的細胞在TIRF成像。禮貌：瑪麗亞·蒙托亞博士，CNIO，西班牙國家癌癥中心，馬德里，西班牙

在一個生物的設(shè)置中，會發(fā)生全反射的接口，在該接口通常是玻璃蓋玻片之間，其中n = 1.52在蓋玻片和細胞組（n = 1.33）之間的小的薄膜的水性介質(zhì)中。漸逝場，然后通過該水溶液膜，直徑為約7.5 nm和轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)的細胞下降為零，在一定的穿透深度取決于激光光的入射的角度的質(zhì)膜。在一些景點細胞直接堅持蓋玻片和蓋玻片的細胞（例如，細胞粘著斑）之間沒有水溶液中可以找到。在這種情況下，蓋玻片和細胞之間的界面全內(nèi)反射的地方。細胞有不同的折射率（約每組1.38）比水溶液，這些斑點，可能是不可見的，當系統(tǒng)設(shè)置的蓋玻片/水溶液界面。根據(jù)斯涅耳定律，發(fā)生全反射的臨界角取決于介質(zhì)的折射率，因此的蓋玻片/細胞界面的蓋玻片/水溶液的接口不一樣的。此問題是可以克服的，通過改變激光光的入射的角度。

漸逝場的性質(zhì)，因為它是在呈指數(shù)下降，只在約60-100納米的范圍內(nèi)（根據(jù)設(shè)定）的蓋玻片/水溶液界面（或細胞本身）的熒光團被激發(fā)。這提供了一個軸向分辨率通常為60-100納米（z平面），使觀察，它們位于或關(guān)閉到質(zhì)膜不被淹沒由位于細胞的其余部分中的熒光基團發(fā)出的熒光的熒光基團。被激發(fā)的熒光團僅在一個“切片”的細胞漸逝場的事實，導(dǎo)致具有很好的信號 - 噪聲比，幾乎沒有任何背景熒光外的聚焦平面制作圖像。

圖 4：廣角圖像的微管蛋白表達CFP

圖 5：微管蛋白CFP TIRF圖像。禮貌：德國馬爾堡大學(xué)·雅各教授，的臨床細胞生物學(xué)和細胞病理學(xué)系，馬爾堡